Рекомбинантная плазмидная днк pун1 - источник f2 днк- зонда для идентификации штаммов чумного микроба с генами капсульного антигена, штамм бактерий escherichia coli - донор рекомбинантной плазмидной днк pун1, содержащей f2 днк-зонд для идентификации штаммов чумного микроба с генами капсульного антигена

 

Изобретение относится к микробиологии, в частности генетической инженерии. Сущность изобретения: создан штамм кишечной палочки, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК, несущую фрагмент плазмиды pFra чумного микроба и обеспечивающую получение видоспецифичного зонда для идентификации штаммов чумного микроба, содержащих гены капсульного антигена. Для этого сконструирована рекомбинантная плазмида рУН1 с фрагментом ДНК плазмиды pFra, размером около 800 п.н. и репликон векторной плазмиды рАСУС 184. Полученной ДНК трансформированы клетки штамма E.coli К 802 и создан штамм, содержащий рекомбинантную плазмиду рУН1, в процессе репликации которой осуществляется синтез ДНК зонда F₂. ДНК зонд F₂, являющийся частью плазмиды pFra, позволяет идентифицировать штаммы чумного микроба, содержащие гены капсульного антигена Ф1. F₂ зонд видоспецифичен , он не гибридизуется с ДНК других видов иерсиний, а также с др. представителями семейства Enterobact (кишечная палочка, шигелы, сальмонеллы). 1 з. п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии, в частности генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, предназначенный для идентификации методом ДНК-ДНК гибридизации штаммов чумного микроба, а также экспериментально полученных штаммов микроорганизмов других видов, содержащих гены, ответственные за синтез капсульного антигена Ф1 чумного микроба, штамм кишечной палочки продуцент зонда для идентификации штаммов чумного микроба.

Наличие капсульного антигена Ф1 является видоспецифическим признаком чумного микроба и детерминируется плазмидой pFra, размером около 90 kd. Использование фрагментов этой плазмиды, включающих гены, ответственные за синтез капсульного антигена Ф1 является перспективным направлением при конструировании видоспецифических ДНК зондов для идентификации штаммов чумного микроба, содержащих в своем геноме генетические детерминанты капсульного антигена.

По такому принципу сконструированы видоспецифические ДНК зонды для обнаружения патогенных штаммов шигелл и кишечной палочки, где в качестве зондов использованы фрагменты ДНК инвазионных плазмид, содержащих гены видоспецифических иммуногенных белков наружной мембраны (Venkatesan N. Buysse H. Abstr. Annu.Meet. Amer. Soc. Microb. 1987. Annu. Meet. Atlanta. 1-6 March 1987. Washingthon. Dc 1987, 951). Эти фрагменты гибридизуются только с ДНК вирулентных штаммов кишечной палочки и шигелл.

Описан ДНК зонд F1 для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду, детерминирующую синтез антигена Ф1 и "мышиного" токсина. Зонд сконструирован на основе фрагмента ДНК pFra размером 400 п.н. С помощью F1 зонда детектируются штаммы чумного микроба, несущие интактную плазмиду pFra.

Однако особенностью плазмидного репликона pFra является предполагаемая полигенная детерминированность признака капсулообразования, а также наличие в структуре ДНК повторяющихся последовательностей, приводящих к структурной нестабильности репликона и возникновению делеционных вариантов, которые могут уклоняться от детектирования Ф1 зондом. Поэтому для идентификации штаммов чумного микроба, содержащих делеционные варианты плазмиды, необходимо конструирование альтернативных зондов и, в первую очередь, основанных на использовании биологически важных генетических детерминант.

Целью изобретения является создание генетического зонда, состоящего из фрагмента ДНК плазмиды pFra из области, ответственной за синтез капсульного антигена Ф1 чумного микроба, пригодного для идентификации штаммов чумного микроба, имеющих в своем геноме гены капсульного антигена, а также получение штаммов продуцента ДНК-зонда.

ДНК зонд F2 представляет собой фрагмент плазмиды pFra чумного микроба, размером около 800 п.н. имеющий в себе единичные сайты рестрикции для эндонуклеаз Bam H1, XbaI, XhoI. Фрагмент F2 получают в результате гидролиза ДНК рекомбинантной плазмиды pYH1 эндонуклеазой HindIII с последующей элюцией его из геля.

Рекомбинантная плазмида pYH1 была сконструирована следующим образом. На первом этапе был сконструирован штамм кишечной палочки-продуцент капсульного антигена Ф1 чумного микроба. Плазмидная ДНК этого штамма включает векторную часть плазмиду рАТ 153 и фрагмент ДНК pFra, размером около 5,4 т.п.н. содержащий гены капсульного антигена. После гидролиза ДНК этой плазмиды эндонуклеазой HindIII и электрофоретического разделения рестриктов, фрагмент ДНК pFra, размером 800 п.н. был выделен и клонирован на основе векторной плазмиды pACYC 184 по HindIII сайту в области устойчивости к тетрациклину. Рекомбинантные ДНК трансформированы в клетки кишечной палочки штамма Е.coli К 802. Трансформанты, содержащие pYH1 плазмиду, отобраны по устойчивости к хлорамфениколу и чувствительности к тетрациклину.

В состав полученной рекомбинантной ДНК pYH1 входят следующие гены точка начала репликации и гены устойчивости к хлорамфениколу векторной части и фрагмент ДНК pFra, размером около 800 п.н. содержащий уникальный для ДНК pFra сайт для Вам Н1 эндонуклеазы. Размер гибридной ДНК pYH1 около 4,8 т.п. н. Синтез вставки-зонда осуществляется в процессе репликации рекомбинантной плазмиды.

Уровень синтеза зонда в составе рекомбинантной плазмиды в сконструированном штамме составляет 1-1,5 мкг/л среды при плотности культуры 4х10 кл/мл.

Штамм Е. соli К802, содержащий рекомбинантную плазмиду pYH1, несущую фрагмент ДНК-зонд F2, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной фоpмы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах с добавлением хлорамфеникола 10 мкг/мл. На плотной среде образуют гладкие, серые, блестящие, круглые колонии с ровным краем. При выращивании в бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физико-биохимические признаки: оптимальная температура роста 37^оС, оптимум рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода использует многие углеводы, органические кислоты, спирты. В качестве источника азота минеральные соли (в аммонийной или нитратной форме, органические соединения (в виде пептона, триптона, аминокислот).

Устойчивость к антибиотикам: проявляет устойчивость к хлорамфениколу в концентрации 10-12 мкг/мл.

Присутствие в клетках плазмидной ДНК, содержащей F2 фрагмент-зонд, подтверждается проверкой устойчивости клеток к хлорамфениколу, а также путем выделения плазмидной ДНК одним из известных методов, например, методом Birnboim H. Doly J. (Nucl.Acid.Res. 1979. N. 6, V.7, pp. 1523) и последующей идентификацией вставки в рестрикционном анализе совместно с ДНК pFra, гидролизуя ДНК HindIII эндонуклеазой.

Штамм Е. coli K 802, содержащий рекомбинантную плазмиду pYH1, обеспечивающую синтез видоспецифического ДНК зонда для идентификации штаммов чумного микроба депонирован в Музее Живых Культур ВНИПЧИ "Микроб" под номером КМ 46.

Получение фрагмента ДНК-зонда F2 иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pYH1 и получение штамма Е. coli продуцента F2-ДНК зонда для идентификации штаммов чумного микроба, содержащих гены капсульного антигена Ф1.

А. Выделение ДНК рекомбинантной плазмиды из штамма кишечной палочки K 802 pAF 10-23 продуцента капсульного антигена чумного микроба и ДНК векторной плазмиды pACYC 184 из штамма Е.coli K 802 pACYC 184. Клети бактерий выращивают в бульоне LB (рН 7,2 с добавлением ампициллина 50 мкг/мл для Е.coli К 802 pAF 10-23 и хлорамфеникола 10 мкг/мл для Е.coli К 802 pACYC 184, в течение ночи с аэрацией при температуре 37^оС. Плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса (Маниатис Т. с соавт. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984, с. 101). Полученные препараты плазмидных ДНК pAF 10-23 и pACYC 184 используют для конструирования рекомбинантной плазмиды.

Б. Клонирование фрагмента ДНК из рекомбинантной плазмиды pAF10-23 на основе векторной плазмиды pACYC 184. ДНК плазмиды pAF10-23 инкубируют с эндонуклеазой HindIII при 37^оС 1 ч, продукты гидролиза разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле. В длинноволновом ультрафиолетовом свете визуализируют положение третьего (800 п.н. фрагмента, собирают его электроэлюцией в лунку, очищают фенолом и концентрируют этанолом (Маниатис Т. с соавт. Молекулярное клонирование. М. Мир, с. 171). Полученный фрагмент лигируют с ДНК векторной плазмиды pACYC 184, гидролизованной HindIII эндонуклеазой.

В. Получение штамма продуцента F2-ДН зонда для идентификации штаммов чумного микроба. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма Е.coli К 802 по методу Cohen S. et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. 1972, 69, 8, 2110-2114).

Тетрациклинчувствительные и хлорамфениколустойчивые клоны отбирают и анализируют на наличие рекомбинантной ДНК. Вставку фрагмента подтверждают расщеплением ДНК рекомбинантной плазмиды эндонуклеазой HindIII. Рекомбинантная ДНК, состоящая из векторной плазмиды pACYC 184 и фрагмента ДНК чумного микроба размером около 800 п.н. обозначена pYH 1, а клон Е.coli К802, несущий гибридную плазмиду pYH 1, отобран как донор данной плазмиды.

П р и м е р 2. Получение радиоактивного зонда для идентификации штаммов чумного микроба; изучение специфичности зонда.

А. Радиоактивный зонд для проведения ДНК-ДНК гибридизации получают следующим образом: 10 мкг ДНК плазмиды pYH 1 гидролизуют эндонуклеазой HindIII. После электрофоретического разделения продуктов гидролиза, меньшей (800 п.н. из двух полученных фрагментов элюируют как описано выше. Полученный осадок ДНК F2 фрагмента-зонда (1 мкг) растворяют в 20 мкл дистиллированной воды, метят с помощью Р32 СТР (удельная активность 400 Ки/Ммоль) методом никтрансляции, согласно рекомендациям фирмы "Ametsham". Удельная активность зонда получается в пределах 10-10 имп./мин. на 1 мкг ДНК. Меченую ДНК денатурируют при 90^оС в течение 5 мин, охлаждают во льду и 100 мкл такой пробы смешивают с 5 мл буфера для гибридизации (20хSSC, 0,25 М ЭДТА рН 7,4, 50% р-р Денхардта, 10% SDS, 10 мкг/мл тимусной ДНК).

Б. Гибридизация F2 зонда с клетками бактерий различных видов. Радиоактивный зонд получают способом, описанным выше. Исследуемые культуры подращивают на агаровых пластинках в течение суток. Штаммы чумного микроба при 28^оС, кишечной палочки -- при 37^оС, культуры других видов при 37^оС. Из выросших культур готовят взвеси в физиологическом растворе по стандарту плотности 5 млрд./мл. Взвеси по 3 мкл наносят на нитроцеллюлозный фильтр, высушивают на воздухе. Фильтры с нанесенными клетками последовательно обрабатывают 10% раствором SDS 10 мин), денатурирующим раствором (0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl) 10 минут, нейтрализующим раствором (1,5 М NaCl, 0,5 М Трис HCl рН 8,0) 10 мин и промывают 2 х SSC. Обработанные фильтры подсушивают при комнатной температуре и денатурированную ДНК фиксируют на мембране прогреванием в вакуумной печи при 80^оС 1 ч. Предгибридизацию проводят в растворе для гибридизации при температуре 42^оС 2 ч, гибридизацию с Р32 F2 ДНК зондом при 42^оС 18 ч. После инкубации фильтры промывают 2 х SSC с 0,5% SDS 2 ч при 68^оС и 0,1 х SSC с 0,1% SDS 30 мин при 68^оС. Фильтры высушивают при комнатной температуре и экспонируют с рентгеновской пленкой для получения радиоавтографа.

Штаммы, использованные для определения специфичности F2 зонда и результаты гибридизации приведены в таблице.

Таким образом, F2 зонд избирательно детектирует штаммы чумного микроба и кишечной палочки, содержащие гены капсульного антигена Ф1, дифференцируя их от представителей бактерий других видов, в том числе близкородственных иерсиний.

Перспективные области применения сконструированного F2 ДНК-зонда.

1. Использование в системе эпизоотологического обследования на энзоотийных по чуме территориях СССР для идентификации штаммов чумного микроба.

2. Изучение молекулярной организации генома атипичных природных и лабораторных штаммов чумного микроба, не продуцирующих антиген Ф1 или продуцирующих это вещество ниже уровня, определяемого в серологических реакциях.

3. Экспериментальное изучение рекомбинантных штаммов бактерий других видов, несущих генетические детерминанты синтеза капсульного антигена Ф1 чумного микроба.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рYHI - источник F₂ ДНК-зонда для идентификации штаммов чумного микроба с генами капсульного антигена размером 4800 п. н., содержащая: - векторную часть - ДНК рАСУС184 размером 7000 п. н.; - Hind III - фрагмент ДНК плазмиды рFra чумного микроба размером 800 п. н.; - уникальные сайты рестрикции: Bam H I, Xba I, Xbo I; - генетический маркер; Cm^r - устойчивость к хлорамфениколу.

2. Штамм бактерий Escherichia coli КМ 46 донор рекомбинантной плазмидной ДНК рYHI, содержащей F₂-ДНК-зонд для идентификации штаммов чумного микроба с генами капсульного антигена.

РИСУНКИ

Рисунок 1