Рекомбинантная плазмидная днк pj g824, кодирующая j-антиген чумного микроба, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент j-антигена чумного микроба

 

Использование: получение 1-антигена чумного микроба. Сущность изобретения; получены рекомбинантнаяплазмидная ДНК plG824 и штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-5348-продуцент 1-антигенэ, кодирующая 1-антиген чумного микроба, разработан способ конструирования плазмиды . 3 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ((9) (И) (51)5 С 12 N 15/31

ГОСУДАРСТВ Е ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ (1РИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4853667/13 (22) 31.07.90 (46) 15.10.92. Бюл. M 38 (71) Всесоюзный научно-исследовательский

uHcmTyT прикладной микробиологии (72) П. А. Черепанов, Г. А. Каримова, Е, А. Панферцев. T. Г, Михайлова и

В. Н. Степаншина (56) Авторское свидетел ьство СССР

N. 1103555, кл, С 12 P 1/04, 1983, (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ.

ДН К pl 6824, КОДИРУЮЩАЯ l-АНТИ ГЕН

Изобретение относится к генетической инженерии и касается способа получения 1 антигена чумного микроба в клетках бактерий Escherichia coli, ! антиген синтезируется в клетках чумного микроба при росте на 37 С в богатой среде при рН 5,8-6,0 (1).

Иэ а.с. 1103555 известен штамм

Yersinia pestis — продуцент антигена (2).

Продуктивность этого штамма авторы выражают в гемагглютинирующих единицах, под которыми понимают максимальное разведение образца, еще дающее положительный результат, но не приводят данных о количественном выходе продукта. Необходимо отметить, что процесс культивирования клеток штамма — продуцента занимает длительное время (от 3 до 8 суток) и требует использования обогащенных питательных сред. Кроме того, при использовании клеток

Уегз1п1а pestis для выделения ) антигена существует сложность в отделении J антигена or Fi антигена (из-за близости мол. масс).

ЧУМНОГО МИКРОБА, СПОСОБ EE КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ

ESCHERtCHlA СО! — ПРОДУЦЕНТ i-АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА (57) Использование, получение 1-антигена чумного микроба. Сущность изобретения; получены рекомбинантная плазмидная ДНК

plG824 и штамм бактерий Escherichia coll

ВКПМ B-5348-продуцент l-антигена, кодирующая 1-антиген чумного микроба. разработан способ конструирования плазмиды

piG824. 3 ил.

Целью изобретения является повышение выхода l антигена, ускорение и упрощение способа его выделения.

Для этого создана рекомбинантная д плазмидная ДНК plG824, кодирующая синтез l антигена и состоящая из следующих элементов: 1) космидная ДНК рНС79 размером 6 т.п.о.; 2) фрагмент Kpnl-RcoRl размером 6,5 т.п.o., содержащий ген(ы) l антигена О под собственным промотором; 3) фрагмент (гд

Крпl-Hindlll размером 0,5 т,п.о. — часть ма- сО лой плазмиды pPst чумного микроба, Для достижения цели используют способ конструирования рекомбинантной Ъ плазмидной ДНК р16824, заключающийся в том, что фрагменты хромосомной ДНК чумного микроба после неполного гидролиэа рестриктазой EcoRl лигируют с ДНК космиды рНС79, гидролизованной рестриктззой

EcoRl, упаковывают в фаг, заражают им клетки Escherichia coll, которые выращивают на агаризованной среде с ампициллином, из выросших клонов, дающих

1768639

15

40 положительную реакцию иммунопреципитации с анти-l моновален гной сывороткой, выделяют ДНК, полученную ДНК и ДНК плазмиды рРэ0 вначале гидролизуют рестриктазой Kpnt, затем лигируют, лигаэной смесью трансформируют клетки Escherichta соИ, иэ клонов; синтезирующих I аитиген, выделяют ДНК, гидролизуют ее последовательно ресткриктазой Hindttt и рестриктазой Clat. л игируют и отбирают рекомбинатную плазмидную ДНК р! С824 размером 13 т.п.о.

Штамм — продуцент 1 антигена получен трансформацией клеток Е.coll НВ101 рекомбинантной плазмидной ДНК ptG824.

Штамм Escherlchia colt НВ101 (pt6824) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном питательном агаре "Дифко" — колонии гладкие круглые, плоские. серые, блестящие, мутные, края ровные. При росте на жидких средах: мясопептонном или LB бульоне образуют ровную интенсивную муть, . Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут при температуре 4-45 С при рН 5;8-8,0.

Синтез t антигена и его секреция в культуральную жидкость происходит при выращивании культуры E;coll в забуференной среде (рН 5,8-6,0) при ЗTС.

В качестве источника углерода клетки используют многие углеводы, спирты, органические кислоты; в частности: d— - глюкозу, d —,фруктозу, треуголозу. Не усваивают ацетат, аданит, лактозу, ксилозу. Источником азота служат как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме,так и пептон, аминокислоты в органической форме. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют.

Уреазную активность не обнаруживают.

Устойчивость к антибиотикам, Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную рекомбинантной плазмидной ДН К р! 6824, а также к стрептомицину, обусловленную мутацией в хромосомном гене IpsL у штамма Е.coll

H 8101.

Пример 1. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК piG824.

Клетки вакцинного штамма EV76 У.

pestis выращивают в 100 мл LB бульона с добавлением 1% гемолизированной крови в течение 48 час при 28 С. Клетки осаждают центрифугированием {5000g. 4 с, 5 мин), ресуспендируют в 10 мл раствора А (трис-Н С1, рН 8,0 — 25 мМ, ЭДТА — 10 мМ, глюкоза — 50 мМ) и выдерживают во льду 10 мин. Затем добавляют равный объем 2% раствора ДСН. перемешивают и помещают в водяную бана на 65 С на 30 мин. После этого добавляют проназу(50мкг/мл) и инкубируют 16час при

37 С. Депротеиниэацию проводят 3-кратной обработкой фенолом, насыщенным ТЕ (трис-НС!, рН 8,0 — 10 мМ, ЭДТА — 1 мМ) (объем:объем). К водной фазе, отобранной после третьей экстра кции, добавляют 3 объема 96% этилового спирта, Выпавшую в осадок высокомолекулярную ДНК наматывают на стеклянную палочку. После 5-кратной промывки 70% этиловым спиртом осадок растворяют в ТЕ буфере, Качество и количество хромосомной ДНК проверяют с помощью электрофореза и в пробных реакциях "рестрикция-лигирование".

Космидную ДНК рНС79 выделяют согласно (3). Концентрацию плазмидной и хромосомной ДНК определяют спектрофотометрически (при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции

0,02 смlмкг). Полученные препараты хромосомной и плазмидной ДНК используют для конструирования плазмиды ptG7. Это конструирование проводят следующим образом: 2 мкг хромосомной ДНК инкубируют с рестриктазой EcoRI (5 ед.) в буфере 3 (трисHCl, рН 8,0 — 50 мМ, MgO — 10 мМ, NaCI—

100 мМ), Реакцию проводят при 37 С в течение 1 час, отбирая аликвоты каждые t5 мин. После расщепления пробы анализируют с помощью злектрофореза в 0,2% агарозном геле, 2 мкг космидной ДНК рНС79 инкубируют с рестриктазой ЕсоР! (5 ед,) в буфере 3 при 37 С в течение 1 час. Полноту рестрикции проверяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. Для лигирования используют фрагменты ДН К хромосомы размером 35-40 т.п.о. Перед лигированием рестрицированные фрагменты

ДНК прогревают при 65 С 10 мин, Соединение фрагментов хромосомной и плазмидной ДНК проводят в рестрикционном буфере с добавлением: АТФ до концентрации 1мМ, ДТТ вЂ” до 5 мМ и ДНК-лигазы фага Т4 (3-4 ед. Вейса). При лигировании смешивают 2 мкг хромосомной ДНК с,1,5 мкг плазмидной ДНК, Реакцию проводят в течение 16 час при 14 С. Качество лигирова ни я проверяют зле ктрофорезом в 0,4% агарозном геле. Полученную смесь рекомбинантных космид упаковывают в головку фага (3). Фаголизатом заражают клетки

Е.coil! НВ101, выращенные в LB бульоне с добавлением мальтозы (0,2%) и MgSO (10 мМ). Адсорбцию фага проводят в течение 20 мин при 37 С. После подращивания в LB бульоне в течение 2 час при 37 С клетки

1768639 высевают на селективную среду, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, Из сконструированного таким образом банка генов Y.pestis отбирают клон, дающий положительную реакцию диффузионной преципитации с моновалентной анти-I сывороткой (4), Рекомбинантная плазмидная ДНК, выделенная из этого клона, получает наименование plG7 (фиг. 1).

Рекомбинантную плазмидную ДНК р!67 используют в качестве донора при создании плазмиды р!682. В качестве вектора при этом используют предварительно созданную плазмиду pPI — делеционный вариант малой плазмиды pPstl Y,pestis, в которой фрагмент EcoRI — Hindi ll заменен на фрагмент ДНК, кодирующий ген cat (устойчивости к хлорамфениколу) из плазмиды

pBR325, 1 мкг ДНК плазмиды plG7 смешивают с 1 мкг ДНК плазмиды рР1 и инкубируют с рестриктазой Kpni (5 ед.) в буфере 1 (трис-HCI, рН 8,0 — 50 MM, Mg Cl — 10 мМ) при

37 С в течение 1 «ас. Полноту рестрикции контролируют с помощью электрофореза в

0,8% агарозном геле. После инкубации смесь прогревают при 65 С 10 мин, Соединение фрагментов проводят в рестрикционном буфере с помощью ДНК-лигазы фага Т4 по описанной методике. Полученной смесью плазмид трансформируют клетки

Е.coli НВ101 с применением CaCi — методи.ки (3), Отбор трансформантов проводят на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (20 MKr/ìë). Из выросших клонов отбирают те, что способны давать положительную реакцию иммунопреципитации с моновалентной анти-! сывороткой (4). Плазмида из этих клонов мол. массы 19 Md размером около 29 т.п.о. получает наименование pi682 (фиг. 1). Из этой плазмы получают плазмиду р!6822 делетированием Hindi ll фрагмента размером около 12 т.п.о. Для этого 1 мкг ДНК плазмиды plG82 рестрицируют нуклеазой Hind! ll (5 ед) в буфере 3 при 37" С в течение 1 ч.

Полноту реакции проверяют в электрофорезе, Лигирование проводят в рестрикционном буфере по описанной методике.

Смесью плазмид трансформируют клетки

Е.coli НВ101 (3). Среди выросших на селективной среде (ампициллин — 100 мкг/мл) клонов отбирают те. которые дают положи- тельную реакцию диффузионной преципитации с моновалентной анти-! сывороткой и неспособны расти на среде с хлорамфениколом. Удаление фрагмента ДНК проверяют с помощью гидролиза Hindlli нуклеазой и последующим электрофореэом. Сконструированная рекомбинантнэя плазмидная растворяют в том же фосфатном буфере и хранят при температуре -20 С, Содержание

45 белка в препаратах определяют спектрофо50

ДНК получает наименование р!6822, ее рэзмер составляет величину 17 т.п.о. (фиг. 1), Из плазмиды р!6822 создают плазмиду pl6824 делетированием фрагмента Cial размером около 4 т.п.о, 1 мкг ДНК плазмиды plG822 рестрицируют Clal экдонулеазой (5 ед) в буфере 1 при 37 C в течение 1 ч. Полноту рестрикции проверяют с помощью электрофореза. Лигирование проводят с помощью лигазы фага 14 по описанной методике, Смесью плазмид трансформируют в клетки

Е.coli НВ101 (3), Среди выросших на среде с ампициллином (100 мкг/мл) клонов отбирают те, что дают положительную реакцию иммунопреципитации с моновэлентной анти-!-сывороткой. Выделенную их этих клонов ДHK подвергают гидролизу эндонуклеазой Clal и электрофорезу для проверки удаления Cia! фрагмента, Плазмида молекулярной массы 8,5 Md размером 13 т.п.о., кодирующая синтез антигена в клетках Е,coli получает наименование р!6824 (фиг, 1).

Штамм-продуцент антигена получают, трансформируя клетки штамма Escherichia

coli НВ101 рекомбинантной плазмидной

ДН К p I G824, Пример 2. Способ выделения I антигена из клеток рекомбинантного штамма

Е.coli НВ101(р!6824).

Для выделения антигена используют биомассу клеток рекомбинантного штамма

Е.coli H 8101(plG824), вырашенную в матрицах нэ мясопептонном агаре при рН 5,8-6,0, температуре 37 С в течение 16-18 час. Микробную массу смывают Ка-фосфэтным буфером рН 7,0-5 мМ с помощью стеклянных бус, Биомассу осаждают центрифугированием (12000g, 10 мин, 4 C). К супернатанту добавляют сульфат аммония до 40% насыщения. Через 2 час раствор повторно центрифугируют. Осадок, представляющий собой практически чистый I антиген, перетометрическим способом (5). Гомогенность препарата тестируют электрофорезом по

LaemmIi (6) и в реакции диффузионной преципитации (4).

Полученный антигенный препарат из клеток кишечной палочки с поливалентной противочумной сывороткой формирует одну дугу преципитации в иммуноэлектрофорезе, В реакции диффузионной преципитации с антисывороткой полоса преципитации этого антигена (фи", 2 поз. 4, 6) сливается с полосой преципитации i антигена чумного микроба (фиг. 2 поз. 3: поз. 1, 2, 5 — отрица1768639 тельный контроль; поз, 7 — анти (!+=!) сыворотка), При иммунизации кроликов 1 антигеном, выделенным из клеток рекомбинантного штамма Е.со!! НВ101(р!6824}, получены специфические моновалентные сыворотки.

Эти сыворотки образуют одну замыкающуюся полосу преципитации с 1 антигеном как из клеток рекомбинантного штамма, так и из клеток вакцинного штамма EV76

Y.pestls.

В ДСН-электрофорезе 1 антиген сегрегирует на субьединицы мол. массой около 14

Kd (фиг. 3 поз. 1 — маркеры мол. масс; поз. 2 — рекомбинэнтный антиген; поз, 3 — l антиген из клеток штамма EV76.

В настоящее время в литературе нет данных о клонировании хромосомной области Y.pestls. кодирующей 1 антиген. Все плазмиды, полученные в рабате, являются оригинальными.

Использование рекомбинантного штамма Е.со!! НВ101(р16824) для получения

1 антигена позволяет преодолевать ряд существенных недостатков, присущих известным методам, Во-первых, созданная генно-инженерная конструкция обеспечивает: — 10-кратное повышение выхода продукта (от 2-4 мкг/мл до 40 мкг/мл); — отсутствие сопутствующего трудно.отделимого компонента (Fl антигена чумного микроба), Вследствие этого появляется возможность одношаговой очистки продукта без испол ьзования хромэтографического оборудования.

Во-вторых, использование в качестве продуцента клеток бактерий E.со1! вместо Y.

pestis позволяет: — использовать при культивировании более дешевые среды (без добавления гемолизированной крови); — сократить время культивирования .в

4-12 раз (3-8 сут до 16-18 ч).

Все выше перечисленные преимущества позволяют ускорить, упростить и удешевить способ получения 1 антигена чумного микроба.

5 Формула изобретения

1, Рекомбинантная плазмидная ДНК р! 6824, кодирующая 1-энтиген чумного мйк- робэ, размером 13,0 т.п,о., содержащая. — Eco Rl - Hind 1!! — фрагмент ДНК кос10 миды рНС79 размером 6,0 т.п.о„ вЂ” Hind Ш вЂ” Kpnl фрагмент ДНК пестициногенной плазмиды рРз0 Yerslnia pestls размером 0 5 т.п.о.; — Kpn l — Есо Rl — фрагмент ДНК, коди15 рующий синтез l-антигенэ Yerslnia pestis, размером 6,5 т.п.о.; — уникальные сайты рестрикции: по два

С!а1, Hind Ш, Яа!61 сайта, один Kpn сайт; — генетические .маркеры; — ген устойчивости к канамицину.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pl 0824, заключа- ; ющийся в том, что фрагменты ДНК чумного микроба после неполного гидролиза ре25 стриктазой EcoRl лигируют с ДНК космиды рНС79, гидролизованной рестриктазой

EcoRI, упаковывают в фаг il„заражают им клетки Escherichla соИ, которые выращивают на агаризованной среде с ампицилли30 ном, из выросших клонов, дающих положительную реакцию иммунопреципитации с анти-1 моновалентной сывороткой, выделяют ДНК, полученную ДНК и ДНК плазмиды pPst1, гидролизуют рестриктазой

35 Kpnl, а затем лигируют, лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coll, из клонов, синтезирующих 1 антиген, выделяют ДНК, гидролизуют ее последовательно рестриктазой Hind И! и рестриктазой С!а1, 40 лигируют и отбирают рекомбинантную плазмидную ДНК pl6824 размером 13,0 т.п.о.

3. Штамм бактерий Escherlchia со!!

ВКПМ В-5348-продуцент 1-антигена.

1768639

176 S639 ю

Составитель E. Парфенцев

Редактор В. Трубченко Техред М.Моргентал Корректор И. Шмакова

Заказ 3622 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101