Поливалентная вакцина для профилактики болезни марека и способ ее изготовления

 

Поливалентная вакцина против болезни Марека, которая в качестве основного (базового) вируса содержит вирус герпеса индейки 3-го серотипа, а в качестве усиливающих иммуногенность компонентов - вирусы 2-го серотипа (без предварительной адаптации и аттенуации), выделенные от птиц из благополучных хозяйств в количестве 1 - 50% от базового. В качестве среды суспензии целых клеток вакцины содержит, мас.%: среда Игла или среда 199 80 - 90; сыворотка крови крупного рогатого скота 5 - 10, с последующим добавлением диметилсульфоксида в количестве 5 - 10 мас.%. По способу получения культуры клеток эмбрионов птиц раздельно инфицируют вирусами герпеса индейки и одним или более вирусом герпеса кур 2-го серотипа 2 - 5 пассажей. 2 с. и 1 з. п. ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается вакцины против болезни Марека и способа ее получения.

Болезнь Марека (БМ) высококонтагиозное, лимфопролиферативное, злокачественное заболевание птиц, вызываемое вирусом из рода Herpesvirus. Важным средством предупреждения БМ и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика.

Для специфической профилактики используют живые вакцины трех типов: из аттенюированных штаммов вируса болезни Марека (ВБМ, серотип 1), из природно-ослабленного непатогенного ВБМ (серотип 2) и из штаммов вируса герпеса индеек (ВГИ, серотип 3).

Широкое распространение получили вакцина из аттенюированного штамма CVI 988 ВБМ и вакцина из штамма ФС 126 ВГИ [1] Однако вакцинные штаммы не устраняют носительства вирулентного вируса. Оба вируса (ВГИ и ВБМ) могут одновременно персистировать в организме птицы. Известные вакцины не устраняют опасность поражения лимфатических органов птиц от появившихся в последнее время высоковирулентных онкогенных штаммов ВБМ.

Более высокую защиту от высоковирулентных штаммов ВБМ обеспечивает вакцина из штамма ВГИ, предварительно адаптированного к клеткам определенных органов и тканей цыплят. Однако технология получения вакцины отличается большими затратами времени [2] Наиболее близким аналогом является поливалентная вакцина против БМ, содержащая комбинацию вирусов 2-го и 3-го серотипа, в частности, штаммы SB-1, B-24 (2 серотип) и штамм ФС-126 ВГИ (ЕР N 0496135, 1992). Способ приготовления известной вакцины заключается в том, что культуры клеток, предварительно выращенные в монослое, раздельно инфицируют ВБМ 2-го серотипа и ВГИ 3-го серотипа, выращивают, инфицированные клетки отделяют, смешивают, добавляют стабилизатор и получают целевой продукт.

Однако известная вакцина не обладает высокой иммуногенностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ.

Целью изобретения является создание поливалентной вакцины, обладающей стабильностью, высокой инфекционностью и высокой иммуногенной активностью как в благополучных по БМ хозяйствах, так и в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости. Предлагаемая вакцина имеет определенное преимущество перед другими аналогами, так как обладает высокой иммуногенной активностью против высоковирулентных вирусных штаммов БМ, циркулирующих в птицехозяйствах, и способна индуцировать протективные антитела против данных штаммов.

Вакцина может быть использована для профилактики болезни Марека любой разновидности птиц (кур, перепелов и др.).

Вакцину вводят парентерально. При применении вакцины могут быть использованы простейшие в технологии пригодные разбавители. Так, например, солевые изотонические растворы или растворитель, содержащий полиэтиленгликоль.

Цель решена тем, что вакцина для профилактики болезни Марека птиц содержит суспензии инфицированных вирусом целых клеток в среде, которая в качестве вакцинных вирусов содержит вирус герпеса индейки (ВГИ) и один или два штамма вируса герпеса кур (ВГК).

В качестве базового компонента используется культуральная вирусвакцина против БМ из ВГИ, а в качестве усиливающего компонента вакцинные изоляты, выделенные из клинически здоровой сероположительной птицы и отнесенные к вирусу герпеса кур 2-го серотипа.

При объединении с базовой вакциной одной расплодки штамма ВГК получается бивалентная вакцина, а 2-х расплодок разных штаммов ВГК поливалентная вакцина. Базовая вакцина в поливалентном препарате имеет содержание не менее 1000 ФОЕ на одного цыпленка и не менее 7 млн. живых инфицированных вирусом клеток в 1 мл.

Усиливающий компонент применяется в количестве 1-50% от базового, что соответствует 10-500 ФОЕ на обычного цыпленка и при этом содержание инфицированных клеток должно быть не более 6-7 млн. клеток в 1 мл.

При составлении поливалентной вакцины расплодки разных штаммов в усиливающем компоненте берутся в равных количествах.

В качестве среды для суспензии клеток, инфицированных вирусом, вакцина может содержать любую пригодную известную криозащитную среду. С целью сохранения высокой иммуногенной активности предпочтительно она содержит среду следующего состава, мас.

Среда 199 или среда Игла 80-90 Сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) 5-10 Диметилсульфоксид (ДМСО) 5-10 Среда Игла или среда 199 добавляется при разбавлении клеток, затем вводится сыворотка крови крупного рогатого скота, непосредственно перед расфасовкой вакцины постепенно, по каплям добавляется ДМСО, при постоянном перемешивании суспензии. Постепенное введение ДМСО необходимо для медленного и равномерного распределения его во всем объеме клеточной суспензии. Одномоментное введение всего объема ДМСО, являющегося в чистом виде клеточным ядом, может привести к значительной гибели инфицированных клеток.

Применение готовой смеси защитной среды нежелательно, так как объемное производственное получение клеток не позволяет лимитировать время нахождения инфицированных клеток в этой среде в течение 30 мин (через 30 мин начинается постепенная гибель клеток).

Вакцина содержит вирус герпеса индейки (ВГИ), выращенный в культуре клеток куриных или перепелиных эмбрионов, содержащей не менее 1000 ФОЕ на 1 цыпленка (базовый) и вирус герпеса кур (ВГК) 2-го серотипа (шт. NN 42 и 50), выделенный из эпителий перьевых фоликул кур с последующим 2-10 разовым пассированием на культуре клеток эмбрионов кур и содержащий 50-500 ФОЕ на цыпленка.

Вакцину готовят следующим образом.

Базовый вакцинный ВГИ готовят по общепринятой технологии (временная инструкция по изготовлению и контролю клеточной культуральной вирусвакцины против БМ из штамма ФС 126 ВГИ, утвержденная Главным управлением Ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 04.06.84).

Усиливающий иммуногенность 2-й компонент вакцины ВГК (2-го серотипа) выделяют из кур в возрасте 180-200-дневного возраста из очинов пера или из лейкоцитов крови без предварительной адаптации и аттенюации.

Культивирование вируса ВГК проводят на культуре клеток эмбрионов кур СПФ (свободных от патогенной флоры). В 1-м пассаже обнаруживают отчетливые мелкоточечные очаги размножения вируса диаметром 0,01-0,05 мм (фокус размножения вируса) на 50-80% площади клеточного монослоя.

Питательную среду сливают, вирус собирают в криозащитную среду.

Таким образом выделяют вирусы от кур и обозначают под NN 42, 50. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) устанавливают, что эти вирусы относятся ко 2-му серотипу. Вирусы разливаются по цитопатическому действию на культуру клеток и поэтому при создании поливалентной вакцины используются как самостоятельные штаммы.

Выделенные вирусы проходят контроль и являются неонкогенными, авирулентными, апатогенными.

Выделенные штаммы ВГК под NN 42 и 50 размножаются в промышленных объемах, и используют их в качестве вторых усиливающих компонентов поливалентной вакцины.

Первоначально готовят маточные расплодки ВГК. Для чего в культуральные сосуды (литровые бутылки) с 24-48 часовой культурой клеток эмбрионов СПФ кур вносят по 200 мл поддерживающей питательной среды следующего состава, мас. Среда 199 или Игла 98; сыворотка крови КРС (рН 7,4-7,6) 2 и вируссодержащую суспензию в количестве 10 мл (15000 ФОЕ). Сосуды с зараженной культурой помещают в термостат при 37-38^оС на 48-124 ч, затем удаляют поддерживающую среду и вносят в сосуды 0,25%-ный раствор трипсина из расчета 30 мл на одну бутыль. Раствором трипсина смачивают монослой, трипсин сливают. Бутыли вращают со скоростью до 10 об/мин в течение 5-10 мин. После чего вносят в тех же объемах поддерживающую среду без сыворотки крови крупного рогатого скота. Энергичным встряхиванием отслаивают клетки от стекла и суспендируют в среде. Затем клеточносвязанным вирусом первого пассажа осуществляют заражение монослойных культур клеток (2-й и 3-й пассажи). Инфицированные клетки третьего пассажа снимают с поверхности бутылей в защитную среду по 12 мл на литровую бутыль следующего состава, мас. среда Игла или среда 199 80-90; сыворотка крови КРС 5-10; диметилсульфоксид 5-10.

Среда Игла или среда 199 добавляется при разведении клеток, затем вводится сыворотка крови крупного рогатого скота. А непосредственно перед расфасовкой в вакцину постепенно, по каплям, добавляют ДМСО при постоянном перемешивании суспензии. Объем маточной производственной расплодки вируса 500 мл с концентрацией клеток 6-7 млн/мл. Маточную производственную расплодку вируса контролируют на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибковой флорой, микоплазмами и чужеродными вирусами, инфекционную активность. Активность вируса в маточной производственной расплодке 10³ 10⁵ ФОЕ/мл.

Далее готовят производственную серию вакцины. Для этого проводят 5 последовательных пассажей вируса от маточной производственной расплодки в культуре клеток, аналогично описанному. Используют вирус со 2-го по 5-й последовательные пассажи в культуре клеток. Зараженную культуру клеток в бутылях инкубируют при 37-38^оС в течение 48-124 ч. Затем при наличии типичных для вируса изменений на монослое (на 50-80% площади клеточного монослоя) питательную среду сливают, инфицированные клетки снимают с поверхности бутылей с помощью трипсина, клетки центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10-15 мин, и осадок разбавляют питательной средой с последующим добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота до конечной концентрации клеток 6-7 млн/мл.

После этого составляют поливалентный препарат.

Для этого базовый компонент на основе ВГИ, содержащий не менее 7 млн. клеток в 1 мл и разведенный растворителем, имеющим следующий состав, среда Игла или среда 199 90; сыворотка крови крупного рогатого скота 10, объединяют с усиливающим компонентом ВГК штаммом N 42 и/или штаммом N 50. Усиливающий компонент добавляют в количестве 1-50% от базового.

В базовом компоненте содержится не менее 1000 ФОЕ ВГИ в 0,2 мл (прививная доза) и 10-500 ФОЕ ВГК штамм N 42 и/или штамм N 50 в этом же количестве вакцины на цыпленка.

До смешивания би-поливалентной вакцины отбирают по 10 мл каждого вируса, объединяют с ДМСО, расфасовывают по 1 мл и оставляют для испытания на инфекционную активность.

В полученную суспензию инфицированных клеток, содержащую две разновидности ВГК 2-го серотипа, добавляют среду Игла или 199 80% сыворотку крови крупного рогатого скота 10% затем добавляют по каплям, при интенсивном перемешивании 10% ДМСО.

Полученную суспензию расфасовывают в ампулы по 1,0-3,0 мл, постепенно охлаждают, замораживают до -40^оС и погружают в жидкий азот (-196^о). Все ампулы полученной клеточной вакцины подвергают контролю на целостность ампул, внешний вид, наличие посторонних примесей (ТУ 46-21-157-80).

Полученная клеточная вакцина представляет собой замороженную суспензию желто-розового цвета, при разбавлении разбавителем представляет собой гомогенную взвесь. Вакцина подвергается контролю на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибковой флорой, микоплазмами и чужеродными вирусами, инфекционную активность.

Инфекционная активность полученной вакцины 10⁶ ФОЕ/мл для ВГИ, а для второго компонента 10³ 10⁵ ФОЕ/мл.

Вакцина стабильна в течение 24 мес. при температуре 196^оС.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Выделение вируса. Для выделения апатогенного вируса 2-го серотипа подбирали благополучные птицехозяйства по БМ. Отбирали 100 голов кур 180-200-дневного возраста, клинически здоровых, физиологически развитых, маркировали (от N 1 до N 100) и отбирали индивидуально от каждой курицы сыворотку крови. С помощью метода ИФА определяли наличие антител к ВГК 2-го серотипа по известной методике (Лукина В.А. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. М. 1992).

По номерам проб, в которых обнаружен высокий уровень антител к ВГК 2-го серотипа, изымали птиц и в лабораторных условиях выделяли вирусы из перьевых очинов.

Без предварительной адаптации и аттенюации в 1-м пассаже культивирования вируса на культуре клеток эмбрионов СПФ кур обнаруживали отчетливые мелкоточечные очаги размножения вируса диаметром 0,01-0,05 мм (фокус размножения вируса).

Таким образом были выделены вирусы от кур под NN 42, 50. В ИФА установили, что эти вирусы относятся ко 2-ому серотипу и поэтому при создании поливалентной вакцины их использовали как самостоятельные штаммы.

Выделенные вирусы прошли контроль и являются неонкогенными, авирулентными, апатогенными.

П р и м е р 2. Накопление вируса в культуре клеток. Выделенный по примеру 1 вирус размножали в больших объемах для применения в качестве вторых (усиливающих) компонентов.

Первоначально готовили маточную расплодку вируса. Для чего в культуральные сосуды с 48-часовой культурой клеток эмбрионов СПФ кур вносили по 200 мл поддерживающей питательной среды следующего состава, мас. среда 199 98; сыворотка крупного рогатого скота 2,0 (рН 7,4-7,6) и вносили вируссодержащую суспензию в количестве 10 мл (15000 ФОЕ) на бутыль емкостью 1 л. Сосуды с зараженной культурой помещали в термостат при 38^оС на 72 ч. Затем удаляли поддерживающую среду и вносили в сосуды 0,25%-ный раствор трипсина из расчета 30 мл на бутыль емкостью 1 литр. Раствором трипсина смачивали монослой, затем раствор трипсина сливали, бутыли вращали со скоростью 10 об/мин в течение 10 мин, после чего вносили в тех же объемах поддерживающую среду без сыворотки крупного рогатого скота. Энергичным встряхиванием отслаивали клетки от стекла и суспендировали в среде. Затем клеточносвязанным вирусом первого пассажа осуществляли заражение монослойных культур клеток (2-й и 3-й пассаж). Инфицированные клетки третьего пассажа снимали с поверхности бутылей в защитную среду (по 12 мл на одну бутыль) следующего состава, мас. среда 199 80; сыворотка крови КРС 10; ДМСО 10.

Среду 199 добавляли при разведении клеток, затем вводили сыворотку крови КРС. Непосредственно перед расфасовкой вакцины постепенно по каплям добавляли ДМСО при постоянном перемешивании суспензии.

Объем маточной производственной расплодки вируса составил 500 мл с концентрацией клеток 6 млн/мл. Контроль маточной производственной расплодки вируса проводили на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибковой флорой, микоплазмами и чужеродными вирусами, инфекционную активность.

Активность вируса в маточной производственной расплодке 10⁴ ФОЕ/мл. Далее готовили производственную серию вакцины. Для этого проводили 5 последовательных пассажей вируса от маточной производственной расплодки в культуре клеток, аналогично вышеописанному. Использовали вирус со 2-го по 5-й последовательные пассажи в культуре клеток. Зараженную культуру клеток в бутылях инкубировали при 38^оС в течение 96 ч. Затем при наличии типичных для вируса изменений на монослое питательную среду сливали, инфицированные клетки снимали с поверхности бутылей в трипсин, клетки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, а осадок разбавляли питательной средой с последующим добавлением сыворотки до конечной концентрации клеток 7 млн./мл.

П р и м е р 3. Составление бивалентного препарата. Базовый компонент на основе ВГИ, содержащий 10 млн. инфицированных клеток в 1 мл, разведенный растворителем, содержащий, мас. среда 199 90; сыворотка крови КРС 10, объединяли с усиливающим компонентом ВГК штамм N 42 (пример N 2) в соотношении 100% базового компонента и 50% усиливающего компонента.

В базовом компоненте содержалось 1000 ФОЕ/мл ВГИ в 0,2 мл (прививная доза) и 500 ФОЕ/мл ВГК в этом же количестве (на 1 цыпленка) (До смешивания бивалентной вакцины отбирали по 10 мл каждого вируса, объединяли с ДМСО, расфасовывали по 1 мл и оставляли для испытаний на инфекционную активность).

В полученную суспензию, содержащую две разновидности вакцинных вирусов, среду 199 80% сыворотку крови КРС 10% добавляли по каплям, при интенсивном перемешивании 10% ДМСО.

Полученную суспензию расфасовывали в ампулы по 2 мл, постепенно охлаждали, замораживали до -40^оС и погружали в жидкий азот (-196^оС). Все ампулы полученной клеточной вакцины подвергали техническому контролю на целостность ампул, внешний вид, наличие посторонних примесей.

Полученная клеточная вакцина представляет собой замороженную суспензию желто-розового цвета, при разбавлении разбавителем представляет собой гомогенную взвесь. Вакцина подвергалась контролю на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибковой флорой, микоплазмами и чужеродными вирусами, инфекционную активность.

Инфекционная активность полученной вакцины 10⁶ ФОЕ/мл для ВГИ и 5˙10⁵ ФОЕ/мл для ВГК (1000 доз ВГИ и 500 доз в ВГК в ампуле).

П р и м е р ы 4-6. Получение бивалентной вакцины проводили аналогично примеру 3. Изменяли только количество усиливающего компонента по отношению к базовому. В базовом компоненте содержалось 1000 ФОЕ/мл ВГИ. Данные приведены в табл. 1.

П р и м е р 7. Получение поливалентного препарата. Базовый компонент на основе ВГИ, содержащей 10 млн. клеток, разведенный раствором, имеющим следующий состав, мас. среда 199 90; сыворотка крови КРС 10, объединяли с усиливающими компонентами ВГК штаммами NN 42, 50 в соотношении: 100% базового компонента, 25% штамм N 42 (3,5 млн. клеток), 25% штамм N 50 (3,5 млн. клеток).

В базовом компоненте содержалось 1000 ФОЕ ВГИ в 0,2 мл (прививная доза), и в усиливающем компоненте 250 ФОЕ ВГК штамм N 42 и 250 ФОЕ ВГК штамм N 50 в этом же количестве вакцины на цыпленка.

(До смешивания поливалентной вакцины отбирали по 10 мл каждого вируса, объединяли с ДМСО, расфасовывали по 1 мл и оставляли для испытания на инфекционную активность).

В полученную суспензию, содержащую 3 разновидности вакцинных вирусов, среду 199 80% сыворотку крови КРС 10% добавляли по каплям, при интенсивном перемешивании 10% ДМСО.

Суспензию расфасовывали в ампулы по 2 мл, постепенно охлаждали, замораживали до -40^оС и погружали в жидкий азот (-196^оС). Все ампулы полученной клеточной вакцины подвергали техническому контролю на целостность ампул, внешний вид, наличие посторонних примесей.

Полученная клеточная вакцина представляет собой замороженную суспензию желто-розового цвета, при разбавлении разбавителем представляет собой гомогенную взвесь. Вакцина подвергается контролю на стерильность, отсутствие контаминантности бактериальной и грибковой флорой, микоплазмами и чужеродными вирусами, инфекционную активность.

Инфекционная активность полученной вакцины 10⁶ ФОЕ/мл для ВГИ, 2,5˙10⁵ ФОЕ/мл для ВГК штамма N 42 и 2,5˙10⁵ ФОЕ/мл для ВГК штамм N 50 (1000 доз ВГИ, 250 доз ВГК штамма N 42, 250 доз ВГК штамм N 50 в ампуле).

Вакцина стабильна в течение 24 мес при температуре -196^оС.

П р и м е р ы 8-10. Получение поливалентной вакцины проводили аналогично примеру 7. Изменяли только количество усиливающего компонента по отношению к базовому. Составляющие усиливающего компонента брали в равных количествах. В базовом компоненте содержалось 1000 ФОЕ/мл ВГИ. Данные приведены в табл. 2.

П р и м е р N 11. Испытание инфекционной активности вакцины проводили следующим образом.

Каждый компонент вакцины разводили питательной средой 199 последовательными 10-кратными разведениями от 10^-1 до 10^-4 и вносили во флаконы емкостью 50 мл с 24-часовым монослоем культуры клеток куриных эмбрионов (предварительно сменив в них ростовую среду на поддерживающую) по 0,5 м л разведений 10^-1 и 10^-4, используя на каждое разведение 4 флакона.

Флаконы инкубировали при 37^оС в течение 5 сут для ВГИ и 7 сут для ВГК. После инкубации вируса монослой во флаконах окрашивали раствором амидового черного в течение 15 мин.

После чего краску сливали и подсчитывали фокусы по известной методике (ТУ 4621-157-80).

П р и м е р 12. Испытание иммуногенной активности вакцины, полученной по примерам 3-10 в лабораторных условиях, проводили в сравнении с известной вакциной (ВГИ), представляющей собой базовый компонент, на суточных цыплятах и контролем (без вакцинации).

Суточным цыплятам вводили внутримышечно известную и предлагаемую вакцины. Через 17 дней после вакцинации цыплят заражали высоковирулентным ВБМ штаммом SM путем внутрибрюшинного введения.

Учет результатов проводили через 90 дней после заражения.

Результаты испытаний представлены в табл. 3 и 4.

П р и м е р 13. Испытание иммуногенной активности вакцины в полевых условиях проводили в сравнении с известной вакциной, представляющей собой базовый компонент, на суточных цыплятах и контролем (без вакцинации).

Суточным цыплятам вводили внутримышечно известную вакцину и предлагаемую.

Наблюдение за цыплятами вели в течение 230 дней после вакцинации. Результаты испытаний вакцины в полевых условиях представлены в табл. 5.

В связи с проявлением БМ у кур в старшем возрасте (140-200 дней) и с усилением патогенных и онкогенных свойств вируса БМ, которые обнаружились в последнее время, потребовалась разработка препарата эффективного в данном случае.

Установлено, что оптимальное количество усиливающего компонента составляет 1-50% от базового. При таком количестве усиливающего компонента эффект вакцинации резко возрастает. Добавление усиливающего компонента более 50% от базового не приводит к увеличению иммуногенной активности.

При добавлении усиливающего компонента в количестве менее 1% от базового препарат оказывает эффект, аналогичный известной моновакцине на основе ВГИ.

Составляющие усиливающего компонента берутся в равных количествах.

Количество усиливающего компонента (от 1% до 50%) в поливалентной вакцине зависит от эпизоотической ситуации птицеводческих регионов и в отдельных птицехозяйствах.

Формула изобретения

1. Поливалентная вакцина для профилактики болезни Марека, содержащая суспензию клеток, инфицированных вирусом герпеса индейки 3-го серотипа и вирусом болезни Марека 2-го серотипа в стабилизирующей среде, отличающаяся тем, что из вирусов 2-го серотипа она содержит вирус герпеса кур штамм "42" и/или штамм "50".

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве стабилизирующей среды содержит, мас.

Среда Игла или среда 199 80 90 Сыворотка крови крупного рогатого скота 5 10
Диметилсульфоксид Остальное
3. Способ изготовления поливалентной вакцины для профилактики болезни Марека, включающий раздельное инфицирование культуры клеток вирусом герпеса индейки 3-го серотипа и вирусом болезни Марека 2-го серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вирусосодержащей клеточной массы с последующим их объединением, добавлением стабилизатора и получением целевого продукта, отличающийся тем, что из вирусов болезни Марека 2-го серотипа берут вирус герпеса кур штамм "42" или штамм "50", дополнительно пассируют его в культуре клеток и для инфицирования используют его со второго по пятый последовательный пассаж.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2