Способ определения специфической сенсибилизации лимфоцитов

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения специфической сенсибилизации лимфоцитов при диагностике инфекционных, аллергических и др. заболеваний. Цель - упрощение способа определения специфицеской сенсибилизации лимфоцитов. Цельную кровь пациента инкубируют с антигеном того заболевания или состояния, на которое проверяется пациент. Через нужное время прибавляют флуоресцентный краситель или окрашивающий агент, обладающий аффиностью по отношению к отличительному свойству активированных лимфоцитов или лимфобластов. Инкубированную кровь выливают затем в прозрачную пробирку, содержащую поплавок, который концентрирует окружающие его слои после центрифугирования образца крови. Концентрированный лимфоцитарный слой проверяют затем на флуоресценцию или окрашивание, указывающее на присутствие активированных лимфоцитов или лимфобластов и на их концентрацию. Флуоресценцию или окраску можно качественно или количественно измерить автоматическим прибором.

Изобретение относится к методике определения того, подвергался ли ранее пациент воздействию некоторых антигенов, точнее антигенов, указывающих на заболевания, инфекции, аллергии и другие подобные заболевания.

При диагностировании пациента по поводу возможной болезни медик обычно проводит испытание крови на присутствие или отсутствие в крови агентов, указывающих на то, что пациент ранее перенес различные заболевания. Традиционные испытания по перенесенному воздействию антигенов на пациента, как правило, инфекционных антигенов, обычно основаны на испытаниях по определению присутствия или отсутствия циркулирующих гуморальных антител против предлагаемого антигена. Пример такого теста на крови включает в себя: определение иммунитета Rubella (краснухе) и к многим другим вирусным и бактериальным антигенам. Имеется много способов определения антител, которые включают в себя: латексную агглютинацию, где определяют агглютинацию или отсутствие агглютинации покрытых антигеном латексных частиц; ферментный иммуносубстратный анализ (ЕLISA), где определяют появление окрашивания либо визуально, либо спектроскопически; радиоиммуноанализ, где определяют радиоактивность; липосомную методику, где определяют присутствие (или отсутствие) и интенсивность окраски флюоресцентного красителя, содержащегося в липосомах; радиоиммуносорбентный анализ (RAST), где измеряют радиоактивность, вносимую в твердый субстрат; непрямую иммунофлюоресценцию, где антитела испытуемого образца реагируют с иммобилизованным интересующим антигеном, затем промывают антиген для удаления неспецифически сорбированных антител и наносят несущие флюоресцентную метку антитела против интересующего класса антител и определяют присутствие или отсутствие флуоресценции; осуществляют также другие методики. Если антитела присутствуют, то их можно оттитровать и определить, к какому классу иммуноглобулинов они относятся (наиболее интересны: иммуноглобулины М, свидетельствующие об остром заболевании, иммуноглобулины G, свидетельствующие о перенесенном заболевании, и иммуноглобулины, свидетельствующие об аллергическом состоянии), определяя таким образом, подвергался или нет пациент воздействию данного антигена. Все вышеуказанные испытания являются определениями функционирования группы лимфоцитов, называемых В-лимфоцитами. В случае тех заболеваний, в которых не развивается или слабо развивается иммунный ответ в виде выработки антител, вышеуказанные испытания не позволяют выявить ранее перенесенное пациентом заболевание.

Однако многие заболевания и клинические состояния могут не приводить к выработке заметного количества гуморальных антител, т.е. к В-лимфоцитарному ответу, но фактически вызывают клеточный иммунитет, т.е. Т-лимфоцитарный ответ. Примеры таких заболеваний, и клинических состояний, где доминирует Т-лимфоцитарный ответ, включают в себя многие паразитарные заболевания, туберкулез, сальмонеллоз, гонорею, грибковые заболевания, риккетсиальные инфекции и заболевания Лима. Как недавно сообщалось Датвилером и др. (New England Journal of Medicine, vol 319, р. 1441, 1988), у значительной части пациентов, включая тех, которые ранее принимали антибиотики при заболевании, не вырабатывается заметное количество антител к спирохете заболевания Лима, но развивается Т-лимфоцитарный ответ.

Имеется два основных способа определения того, имеется ли в крови Т-лимфоцитарный ответ на ранее перенесенные заболевания, инфекционные агенты и т. п. Первая методика основана на присутствии морфологических клеточных изменений, возникающих в результате перенесенного заболевания. Ранее перенесшие воздействия Т-лимфоциты приобретают бластоподобные характеристики при повторном контакте со специфическим антигеном. Например, в Т-лимфоцитах развиваются более крупные, чем обычные, ядра и обильная безофильная цитоплазма. Происходят также биохимические изменения, указывающие на активацию, например: усиленный обмен мембранных фосфолипидов; усиленный синтез РНК и белков; изменение внутриклеточной концентрации Са⁺⁺; экспрессия поверхностных рецепторов для Т-клеточного фактора роста интерлейкина 2; повышение введения 3Н-тимидина, а также другие явления, суммированные недавно Шатила Т, и др. (New England Medical Journal, vol 320, р. 696, 1989).

В прошлом для определения Т-лимфобластов использовался анализ на поглощение насыщенного тимидина (анализ на поглощение ЭН-тимидина), и именно этот метод использовали Датвилер и др. при изучении заболевания Лима для определения присутствия или отсутствия специфического Т-лимфоцитарного ответа на определяемый антиген. Этот анализ сложен, требует использования радиоактивных изотопов и выделения относительно чистых популяций лимфоцитов, для его проведения нужно несколько дней.

В данном изобретении предлагается простая методика определения присутствия или отсутствия предварительно подвергшихся воздействию Т-лимфоцитов в крови пациента. Цельную кровь пациента инкубируют с антигеном предполагаемого заболевания, диспергированным в подходящей рН-регулируемой среде, например в буферном солевом растворе. Это инкубирование приводит к активации ранее подвергшихся воздействию лимфоцитов и к приобретению ими бластоподобной морфологии, т. е. они становятся лимфобластами. После нужного периода инкубирования к образцу крови прибавляют флюоресцентный краситель, такой как ацетометиловый эфир кальцийчувствительного красителя фура-2 или другой краситель, обладающий аффинностью по отношению к активированным лимфоцитам или лимфобластам. Краситель может связываться с активированными лимфоцитами или результирующими лимфобластами химическими связями, т.е. взаимодействием с избытком ионов кальция, или другими способами, например, введением как флюросцентной метки в антитела, специфические к трансферрину, Leu-23, поверхностному рецептору Т-клеточного фактора роста интерлейкина-2 и т.п. Добавление красителя или флюоресцентно меченного антитела будет дифференцировано выявлять любые соответствующие лимфоциты или лимфобласты в образце крови. Следует отметить, что высвечивающая добавка может быть связана с соответствующими лимфоцитами, либо до, либо после превращения их в настоящие лимфобласты. Поэтому лимфоциты с предварительно повышенной чувствительностью могут связывать краситель до завершения полного морфологического превращения. Обработанную кровь затем центрифугируют в прозрачной пробирке с поплавком, концентрируя таким образом все лимфоциты, включая любые лимфобласты, в небольшом объеме в пробирке. Эта методика концентрирования клеток описана в патенте США N 4027660, выданном 7 июня 1977 Стефану Кларку Вордлау и др. Пробирка может быть капиллярной или предварительно откачанной большой пробиркой. После концентрирования клеток слой лимфоцитов проверяют на уровень окраски или флуоресценции, указывающий на присутствие лимфобластов в слое лимфоцитов. Определение окраски или флуоресценции можно проводить с помощью инструмента, описанного в патенте США N 4156570, выданном в мае 1978 и N 4558947, выданном в декабре 1985 Стефану К.Вордлау.

Таким образом, целью данного изобретения является разработка методики диагноза перенесенного пациентом воздействия предполагаемым антигеном, повысившего чувствительность лимфоцитов в крови пациентов.

Еще одним предметом данного изобретения является описываемая методика, где к образцу крови прибавляют оптически детектируемый индикатор для оптического высвечивания соответствующих лимфоцитов в образце крови.

Дополнительным объектом данного изобретения является описываемый здесь способ, где сенсибилизированные лимфоциты являются Т-лимфоцитами.

Еще одной целью данного изобретения является разработка описываемой здесь методики, где образец крови центрифугируют в прозрачной пробирке для концентрирования лимфоцитов в полосу, которую затем анализируют на высвечивание.

Изобретение позволяет включать отрицательный и положительный контроли. Отрицательный контроль используют для того, чтобы определить, что Т-лимфоциты не реагируют на неспецифическое стимулирование. Положительный контроль используют для того, чтобы определить, способны ли лимфоциты пациентов реагировать на антигены индивидуально или в сочетании с информированием врача о том, что пациент в прошлом подвергался действию анатоксина тетануса, анатоксина дифтерии, монолии или химикатов, известных как активаторы лимфоцитов, таких как фитогемагглютинины, фторид алюминия и т.п.

Кровь пациента можно поместить в три отдельные емкости или контейнера: контейнер отрицательного контроля, контейнер образца и контейнер положительного контроля, каждый из которых имеет герметичную крышку, через которую можно переносить кровь. Краситель можно прибавлять отдельно или заранее покрывать им внутреннюю часть контейнеров.

Контейнер отрицательного контроля имеет внутри антигенную среду, но не антиген. Кровь добавляют в антигенную среду, инкубируют, проводя аналогичные операции с испытуемым образцом, и прибавляют краситель или флюоресцентный агент. Образец крови центрифугируют затем в центрифужной пробирке, содержащей пластиковый поплавок, ограничивающий пространство, занимаемое полосой клеток лимфоциты/моноциты. Эту полосу затем проверяют на высвечивание. Если что-либо наблюдается, то истинность аналогичного результата сомнительна, так как в образце крови активация лимфоцитов может наблюдаться спонтанно. Если изменения цвета не происходит, то это подтверждает истинность результата, полученного с испытуемым образцом, т.е. подтверждается, что спонтанная активация в образце крови отсутствует.

Контейнер положительного контроля используют для смешения образца крови с антигеном (как указано выше) инфекционных агентов, который известен как агент, активирующий лимфоциты у подавляющего большинства пациентов. Инкубационную смесь положительного контроля центрифугируют с красителем или флюоресцентным агентом, обладающим аффинностью к индуцированным дрожжам лимфобластам, образующимся в инкубированном образце крови. Присутствие или отсутствие окрашенных лимфобластов отмечают затем в полосе клеток. Если они присутствуют, то это подтверждает пригодность крови пациента для испытания. Если она отсутствует, то врач констатирует, что тест непригоден для данного пациента, и затем можно определить причину отсутствия положительной реакции на испытуемые антигены заболевания и отрицательная реакция на испытуемый антиген не может рассматриваться как доказательство того, что в прошлом пациент не перенес заболевания и не сенсибилизирован к нему.

Пригодность испытания для пациента подтверждается, следовательно, положительной реакцией в положительном контроле и отрицательной реакцией в отрицательном контроле.

Данное изобретение отличается от известного способа следующими признаками.

1. В отличие от счетчиков индивидуальных клеток, в котором определяется флюоресцентный сигнал каждой единичной клетки, в данном изобретении используется интегральная флуоресценция полной популяции концентрированных лимфоцитов (несколько сотен тысяч содержатся в лимфоцитарно) моноцитарной полосе центрифужной капиллярной пробирки, содержащей 110 мкл крови).

2. Данное изобретение не требует предварительных операций выделения и очистки лимфоцитов и поэтому способ может осуществляться с использованием цельной крови (с антикоагулянтом).

3. В данном способе не нужны какие-либо радиоактивные изотопы.

4. Использование интегральных отрицательного и положительного контролей вместе с заданным количеством антигена в сочетании с испытательным набором и матобеспечением для интерпретации результата позволяет среднетехническому персоналу легко проводить определение.

Нельзя переоценить потенциальную полезность легко проводимого испытания ответа Т-лимфоцитов на антиген. Кроме помощи при диагностике перечисленных выше заболеваний методика по данному изобретению может быть полезна в следующих случаях: диагностика затоpможенных гиперчувствительных реакций, таких как экзема или контактные дерматиты; диагноз некоторых вирусных инфекций в инкубационном периоде, до появления измеримого количества антител; при аутоиммунном заболевании; при диагностике на присутствие опухолевых антигенов или при измерении противоопухолевого иммунитета.

Испытание можно проводить с широким набором антигенов, например, с антигенами различных видов малярии. Если имеется положительная реакция, то можно провести испытания на индивидуальные виды для определения вида малярии. Панельное испытание аллергенов можно проводить с последующими специфическими испытаниями.

Изобретение описано для пациентов-людей, но может быть использовано и для животных.

Так как многие изменения и варианты описанного варианта изобретения могут быть сделаны, не выходя за рамки концепции изобретения, то описанный вариант не ограничивает данное изобретение каким-либо образом, кроме содержания формулы изобретения.

Формула изобретения

Способ определения специфической сенсибилизации лимфоцитов путем инкубирования образца крови в прозрачной пробирке с последующим центрифугированием и анализом лимфоцит-моноцитарных клеток, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени исследования, перед центрифугированием к образцу крови добавляют специфический антиген и антитела, меченные флуоресцентным красителем и специфичные к активированным Т-лимфоцитам или Т-лимфобластам, далее центрифугируют в пробирке с поплавком и анализ ведут путем измерения интенсивности оптического высвечивания.