Способ получения диагностикума риккетсиозного провачека, корпускулярного

 

Использование: производство диагностических препаратов. Задача: увеличение выхода целевого продукта - единых корпускулярных риккетсиозных антигенов. Сущность изобретения: диагностикум получают путем инактивации желточной культуры риккетсий Провачека, их гомогенизации, двух высокоскоростных и одного низкоскоростного центрифугирований с фильтрацией и стандартизацией. Новым в способе являются две дополнительные гомогенизации осадков: одна после первого высокоскоростного, другая после низкоскоростного центрифугирований, а также дополнительное низкоскоростное центрифугирование с последующей фильтрацией надосадочной жидкости и объединением фильтратов.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано при производстве диагностических препаратов.

Известен производственный способ приготовления корпускулярных риккетсиозных антигенов для реакции агглютинации из желточных оболочек куриных эмбрионов, инфицированных риккетсиями Провачека методом эфирной обработки и дифференциального центрифугирования (П.Ф.Здродовский, Е.М.Голиневич. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. М. Медицина, 1972 г. с.111).

Однако получаемые по этому способу антигены имеют узкую направленность и могут быть использованы только в реакции агглютинации, но не в методе флоуресцирующих антител (МФА) из-за наличия в них тканевых компонентов и спонтанных агглютинатов. Кроме того, из-за низкой активности данный диагностикум непригоден для использования в реакции нейтрализации антигена (PHAг) и в реакции связывания комплемента (РСК). Выход целевого продукта мал.

Известен способ-прототип получения в условиях полупроизводства из желточной культуры риккетсий Провачека единого диагностикума риккетсиозного для РСК, РНАг, МФА (ЭПР N 401-92. Диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный сухой для РСК, РНАг, МФА). Способ заключается в гомогенизации предварительно инактивированной формалином желточной культуры риккетсий Провачека, осаждении из суспензии риккетсий центрифугированием при 10000 мин^-1 в течение 30 минут, суспендировании осадка в 1 M растворе хлорида калия, центрифугирования при 1000 мин^1- в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отбирают в фильтрационную ячейку, фильтруют через мембрану Миллипор с размером пор 1,2 мкм в атмосфере азота под давлением 19,6 Па. Затем из фильтра риккетсии осаждают центрифугированием при 10000 мин^-1 в течение 30 минут, осадок ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе (ФБР) pH 7,2 ед. pH, стандартизируют и используют в РСК, РНАг и МФА.

Однако выход целевого продукта по способу-прототипу остается небольшим, несмотря на то, что он в 1,5 раза выше, чем в базовом способе.

Изобретение направлено на решение задачи: увеличение выхода целевого продукта единых корпускулярных риккетсиозных антигенов.

Решение данной задачи достигается путем дополнительных к способу-прототипу приемов: двух дополнительных гомогенизаций и дополнительного низкоскоростного центрифугирования с последующей фильтрацией надосадочной жидкости и объединением фильтратов.

Существенные признаки заявляемого способа: ограничительные инактивация желточной культуры риккетсий Провачека, их гомогенизация, два высокоскоростных и одно низкоскоростное центрифугирования, фильтрация и стандартизация; отличительные две дополнительные гомогенизации осадков: одна после первого высокоскоростного, а другая после низкоскоростного центрифугирований, а также дополнительное низкоскоростное центрифугирование с последующей фильтрацией надосадочной жидкости и объединением фильтратов.

Способ осуществляют следующим образом.

Желточные оболочки куриных эмбрионов, инфицированные риккетсиями Провачека, инактивируют формалином в течение 5-7 суток. Затем их гомогенизируют на размельчителе тканей РТ-2. Риккетсии и тканевые компоненты из гомогената осаждают высокоскоростным центрифугированием. Осадок ресуспендируют в ФБР и вновь гомогенизируют на РТ-2. Затем гомогенат центрифугируют при 1000 мин^-1 в течение 10 мин два раза. Надосадочную жидкость отбирают в фильтрационную ячейку и фильтруют через мембрану, например, МФАС-ОС фирмы "Владипор". Фильтрацию проводят в атмосфере азота под давлением 19,6 Па. С целью увеличения выхода риккетсий осадки после низкоскоростного центрифугирования, содержащие риккетсии в тканевых частицах, ресуспендируют в ФБР, объединяют и гомогенизируют. Гомогенат фильтруют на ячейке. Фильтраты объединяют и риккетсии осаждают высокоскоростным центрифугированием. Осадок риккетсий суспендируют в ФБР, определяют концентрацию риккетсий и стандартизуют. Проводят контроль диагностикума в РСК, РНАг, МФА. При соответствии показателей регламентированным данным в диагностикум добавляют стабилизатор сахарозу, разливают в ампулы по 0,5 мл и лиофильно высушивают.

Пример. К 50 мл желточных оболочек риккетсий Провачека добавили 150 мл 0,4% -ного формалина на 1 М растворе хлорида калия, инактивировали в течение 5 суток. Затем желточные оболочки гомогенизировали на размельчителе тканей РТ-2 при 5000 мин^-1 в течение 5 мин. Из гомогената риккетсии и тканевые частицы осаждали центрифугированием при 10000 мин^-1 в течение 30 минут. Осадок ресуспендировали в 150 мл ФРБ и вновь гомогенизировали на РТ-2. Затем гомогенную взвесь центрифугировали при 1000 мин^-1 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отобрали в микрофильтрационную ячейку, а осадок ресуспендировали в ФБР и гомогенизировали на РТ-2. Гомогенат вновь центрифугировали при 1000 мин^-1 в течение 10 минут, надосадочную жидкость отобрали в микрофильтрационную ячейку. Фильтрацию проводили через мембрану марки МФАС-ОС "Владипор". Фильтраты, содержащие риккетсии, объединили, центрифугировали при 10000 мин^-1 в течение 30 мин. Для получения взвеси с концентрацией риккетсий в 2 млрд в 1 мл осадок ресуспендировали в 150 мл ФБР. Выход диагностикума 150 мл, т. е. в 2 раза выше, чем по способу-прототипу. После положительной оценки активности препарата в РСК, РНАг, МФА диагностикум стабилизировали добавлением сахарозы до конечной концентрации 10% разлили по 0,5 мл в ампулы и лиофильно высушили.

Выход целевого продукта диагностикума по предлагаемому способу в 2 раза выше, чем по способу-прототипу и в 3 раза выше, чем по общепринятому базовому способу.

Формула изобретения

Способ получения диагностикума риккетсиозного Провачека, корпускулярного путем инактивации желточной культуры риккетсий Провачека, их гомогенизации, двух высокоскоростных и одного низкоскоростного центрифугирований с фильтрацией и стандартизацией, отличающийся тем, что проводят две дополнительные гомогенизации осадков: одну после первого высокоскоростного и другую после низкоскоростного центрифугирования, а также дополнительное низкоскоростное центрифугирование с последующей фильтрацией надосадочной жидкости и объединением фильтратов.

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 10.10.2004        БИ: 28/2004

---