Способ выращивания растительных культур in vitro и питательная среда для его осуществления

 

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: выращивание растительных культур in vitro заключается в приготовлении питательной среды и введении в нее биоингибитора, высадку экспланта и последующее культивирование, причем в качестве биоингибитора вводят инсекто-акарицид из группы пиретроидов. Питательная среда содержит макро-, микроэлементы, витамины, регуляторы роста и другие добавки, при этом дополнительно она содержит инсекто-акарицид из группы пиретроидов в количестве 20,0-1200,0 мг/л среды. 2 с.п. ф-лы, 3 табл.

Эаявляемое изобретение относится к биотехнологии растений, в частности к микроразмножению растений на искусственных питательных средах.

В процессе культивирования стерильные культуры могут заражаться бактериями, грибами и другими организмами. Известны способы снижения контаминации путем предварительной промывки источников эксплантов, их стерилизации различными химическими препаратами и соблюдением стерильности при операциях введения эксплантов в стерильную культуру и пересадках для субкультивирования [1] Известен способ, уменьшающий эараженность культур во время длительного культивирования, заключающийся во включении в питательные среды антибиотиков, в частности тетрациклина, что снижает выживаемость отдельных микроорганизмов, случайно попавших на поверхность питательной среды во время пересадок [2] Известны способы, препятствующие расселению клещей в культивационных помещениях и перезаражению культур, заключающиеся в фумигации лабораторных помещений и различных видах наружного применения химических препаратов [3] Недостатки этих известных способов и питательной среды заключаются в том, что они не обеспечивают надежной зашиты культур от активно передвигающихся паразитов, какими являются клещи и их личинки. Это объясняется тем, что проникшие в культуральные сосуды клещи могут там размножаться, а затем расселяться по стоящим рядом сосудам, перенося на поверхности тела споры микроорганизмов. В новых культуральных сосудах этот процесс повторяется и, если его не прервать, то он становиться лавинообразным и влечет за собой существенные потери материала.

Известная питательная среда [2] содержащая антибиотики, не может препятствовать размножению и развитию личинок клещей in vitro.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в повышении эффективности защиты культур in vitro от вредителей в культивационных сосудах и увеличении выхода стерильных культур за счет исключения возможности инфицирования культур в процессе инкубации.

Поставленная задача достигается тем, что в cпособе защиты культур in vitro, включающем приготовление питательной среды, высадку эксплантов и обработку акарицидом, в питательную среду для выращивания культур in vitro перед автоклавированием вводят инсекто-акарицид из группы пиретроидов, после чего проводят высадку эксплантов.

Поставленную задачу решают также и тем, что питательная среда для осуществления способа защиты культур in vitro от вредителей, включающая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, кальций хлористый, кислоту борную, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, железо сернокислое, трилон-Б, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, сахарозу, агар-агар, 6-бензиламинопурин и воду, дополнительно содержит инсекто-акарицид из группы пиретроидов при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 1640-1660, калий азотнокислый-1890-1910, кальций хлористый 430-450, магний сернокислый 360-380, калий фосфорнокислый-160-180, железо сернокислое - 55-56, марганец сернокислый 22,2-22,4, цинк сернокислый 8,5-8,7, калий йодистый 0,82-0,84, натрий молибденовокислый 0,24-0,26, медь сернокислая - 0,024-0,026, кобальт хлористый 0,024-0,026, кислота борная 6,1-6,3, трилон Б 74-76, тиамин 0,4-0,6, пиридоксин 0,4-0,6, никотиновая кислота - 0,4-0,6, аскорбиновая кислота 0,9-1,1,6-бензиламинопурин 0,2-3,0, сахароза 20000-40000, агар-агар 5500-8500, инсектоакарицид из группы пиретроидов - 100-1100, вода остальное.

Именно использование предлагаемой питательной среды, приводящей к гибели клещей в культивационных сосудах, содержащей инсекто-акарицид в указанных концентрациях, обеспечивает согласно способу получение культур, не зараженных клешами и отсутствие возможности перезаражения стерильных культур в культивационных сосудах друг от друга. Это позволяет сделать вывод, что заявляемые изобретения связаны между собой единым изобретательским замыслом.

Сравнение заявляемого технического решения с прототипом позволило установить соответствие их критерию "новизна", т.к. оно содержит новый технологический прием и новый компонент питательной среды инсекто-акарицид из группы пиретроидов.

Предлагаемое техническое решение не является очевидным для специалистов, занимающихся выращиванием стерильных культур in vitro, так как хотя из источников информации [3] и известно использование акарицида для защиты стерильных культур от вредителей, но в этом известном способе акарицид добавляют в краску, которой окрашены поверхности оборудования лаборатории или применяют его для фумигации помещения, что полностью не решает вопросы защиты культур in vitro от вредителей, тем более, что в этих случаях используют акарициды другой группы.

При изучении других известных технических решений в данной области признаки, отличающие заявляемые изобретения от прототипа, не были выявлены. Поэтому можно сделать вывод, что заявляемое техническое решение обладает изобретательским уровнем.

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Готовили агаризованную питательную среду, состоящую из минеральных солей по рецепту Мурасиге-Скуга, мг на 1 л раствора: аммоний азотнокислый 1650, калий азотнокислый 1900, кальций хлористый 440, магний сернокислый 370, калий фосфорнокислый 170, железо сернокислое - 55,6, трилон Б 74,6, кислота борная 6,2, марганец сернокислый 22,2, цинк сернокислый 8,6, калий йодистый 0,83, натрий молибденовокислый 0,25, медь сернокислая 0,025, кобальт хлористый 0,025 с добавлением витаминов - тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,5, аскорбиновая кислота 1,0, сахароза 30000, агар-агар 7000, 6-бензиламинопурин 1,0, в которую перед автоклавированием вносят инсекто-акарицид из группы пиретроидов в следующих количествах, мг/л: 0 (контроль), 10, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 1200, 1500 и 2000. Приготовленную среду доводили до кипения, разливают по культивационным сосудам и подвергали термической стерилизации в автоклаве при давлении 1 атм в течение 15-20 мин.

После охлаждения на поверхность питательной среды производили высадку эксплантов малино-ежевичных гибридов Тейберри и Санберри. Сосуды с высаженными эксплантами помещали в культивационные помещения, в которых отмечались случаи поражения культур клешами. Учеты проводили через 10, 20 и 30 дней, для чего выделяли учетные делянки площадью 625 квадратных сантиметров, на которых находилось по 25 культивационных сосудов. Отмечали инфицированность культур бактериями и грибами. Присутствие клещей обнаруживали с помощью прямого микроскопирования культивационных сосудов под стереоскопическим микроскопом МБС-9. Результаты наблюдений представлены в табл. 1. Как видно из приведенных в табл.1 данных, надежный акарицидный эффект проявляется начиная с концентрации 25 мг/л препарата. Для изучения возможного фитотоксичного действия инсекто-акарицида проводили расчет среднего коэффициента размножения по каждому варианту и определение средней длины побега. Суммарные данные приведены в табл.2.

Обработка полученных данных показала существенное снижение на 0,01% уровня значимости как коэффициента размножения (F=56,2), так и средней длины побегов (F= 37,8) при концентрациях в среде инсекто-акарицида 1500 и 2000 мг/л.

Пример 2. На приготовленную вышеописанным способом питательную среду с включением инсекто-акарицида из группы пиретроидов в концентрациях 10, 20, 50, 100, 500, 1000 и 2000 мг/л были высажены экспланты розы миниатюрной сорта Цвергкенинг и спустя месяц культивирования в световой камере, где отмечали случаи поражения стерильных культур клещами провели оценку зараженности сосудов и развития эксплантов. Результаты наблюдений представлены в табл.3.

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что интервал эффективных концентраций инсекто-акарицида из группы пиретроидов при включении его в питательную среду находится в пределах 20 1200 мг/л. Более низкие концентрации не препятствуют расселению и размножению вредителей, а более высокие оказывают фитотоксичное действие на развивающиеся в культивационных сосудах экспланты различных культур.

Источники информации 1. Поликарпова Ф.Я. Высоцкий В.А. Тарашвили З.Т. Методические указания по клональному микроразмножению черной и красной смородины. М. 1986.

2. Иванов А.И. Приходько Ю.Н. Приходько Д.П. Богомолов А.А. Совершенствование методики получения растений земляники методом культуры апикальных меристем. В сб. Селекция и агротехника выращивания плодовых и ягодных культур в Среднем Поволжье. Куйбышевское книжное из-во, 1989, c.63-75.

3. Blacke J. Mites and trips as bacterial and fungal vectors between tissue cultures. Acta Horticulturae, 1988, N225, p.163-66 (прототип). ТТТ1 ТТТ2

Формула изобретения

1. Способ выращивания растительных культур in vitro, включающий приготовление питательной среды, введение в среду биоингибитора, высадку экспланта и последующее культивирование, отличающийся тем, что в качестве биоингибитора в питательную среду вводят инсектоакарицид из группы пиретроидов.

2. Питательная среда для выращивания растительных культур in vitro, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, железо сернокислое, трилон-Б, кислоту борную, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, сахарозу, агар-агар, 6-бензиламинопурин и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит инсектоакарицид из группы пиретроидов, при следующем соотношении компонентов, мг/л: Аммоний азотнокислый 1640-1660 Калий азотнокислый 1890-1910 Кальций хлористый 430-450 Магний сернокислый 360-380
Калий фосфорнокислый однозамещенный 160-180
Железо сернокислое 55-56
Трилон-Б 74-76
Марганец сернокислый 22,2-22,4
Цинк сернокислый 8,5-8,7
Калий йодистый 0,82-0,84
Натрий молибденовокислый 0,24-0,26
Медь сернокислая 0,024-0,026
Кобальт хлористый 0,024-0,026
Кислота борная 6,1-6,3
Тиамин 0,4-0,6
Пиридоксин 0,4-0,6
Никотиновая кислота 0,4-0,6
Аскорбиновая кислота 0,9-1,1
Б-Бензиламинопурин 0,2-3,0
Сахароза 20000-40000
Агар агар 5500- 8500
Инсектоакарицид из группы пиретроидов 20,0-1200
Вода Остальное До 1 л

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4