Водорастворимый олигомер и способ его получения

 

Использование: для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа). Сущность изобретения: продукт: водорастворимый олигомер формулы: , где: Х-RO₃S-C₆H₄-SO₃R или 2-RO₃S-C₆H₄-C₆H₄-5-SO₃R, X¹ - не замещенный или замещенный низшим алкилом или 1 - 3 атомами хлора или брома фенил; X² - не замещенный или замещенный низшим алкилом или 1 - 3 атомами хлора или брома фенилкарбоксил; n = 6 - 9; R - водород или фармацевтически приемлемый катион. Реагент 1: соответствующий дифенол. Реагент 2: замещенный фенол и фосген. Условия реакции: в присутствии водного основания при pН 7 - 8 и температуре 0 - 40^oC. 6 з.п. ф-лы, 19 табл.

Настоящее изобретение относится к олигомерам, их использованию, а также к способу их получения. Олигомеры настоящего изобретения являются анионными соединениями и обладают значительной активностью против вируса человеческого иммунодефицита, а поэтому указанные олигомеры могут быть использованы для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа).

В настоящее время множество научных исследований направлено на разработку лекарственных средств для лечения вирусных заболеваний человека и животных. Особый интерес для ученых представляет СПИД и СПИД-ассоциированный комплекс (САК) человека, распространенность которых возрастает с угрожающей скоростью. Продолжительность жизни больных СПИДом составляет примерно 5 лет, и пациенты с этим заболеванием, чья иммунная система подвержена серьезным нарушениям, страдают от различных заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, например, саркомы Капоши, пневмоцитоза (Pneumocystis carninii pneumonia).

Эффективного средства от СПИДа пока не существует, а имеющиеся средства являются далеко не адекватными при их практическом использовании и вызывают множество неблагоприятных побочных эффектов. Страх перед заболеванием СПИДом у людей приводит к социальному остракизму и дискриминации против людей с заболеванием СПИДом или подозреваемых в этом заболевании.

Ретровирусы принадлежат к классу вирусов, содержащих рибонуклеиновую кислоту (РНК), которая реплицируется с помощью обратной транскриптазы, образуя нить комплементарной ДНК (кДНК), из которой продуцируется двухнитевая провирусная ДНК. Эту провирусную ДНК затем методом рандомизации вводят в хромосомную ДНК хозяйской клетки, делая возможной репликацию генома вируса путем поздней трансляции вирусной РНК из интегрированного вирусного генома.

Многие из известных ретровирусов являются онкогенными или вызывают образование опухолей. В самом деле, первые два ретровируса, обнаруженные у человека, так называемые вирусы I и II лимфолейкоза или HTLV I и II вызывают редкую форму лейкоза у человека после инфицирования Т-лимфоцитов. Третий вирус, обнаруженный у человека, НТLV-III, вызываемый в настоящее ВИЧ, вызывает гибель клеток после инфицирования Т-лимфоцитов и идентифицируется как возбудитель СПИДа и САК.

Белок оболочки вируса ВИЧ представляет собой гликопротеин 160 кД. Этот белок расщепляется протеазой с образованием внешнего белка 120 кД, др. 120, и трансмембранного гликопротеина, др.41. Белок др120 содержит аминокислотную последовательность, распознающую антиген CD4 на Т-хелперных (Т4) клетках человека.

Некоторые исследования были направлены на попытку помешать связыванию ВИЧ с его мишенью, Т4-клетками человека. Эти Т4-клетки имеют специфичную область, СD4-антиген, которая взаимодействует с др120. Если мешать этому взаимодействию, то инфицирование хозяйской клетки может быть ингибировано.

Интерференция путем образования вирусного оболочечного гликопротеина должна помешать начальному взаимодействию вируса и хозяйской клетки, или последующему слиянию, или должна помешать дупликации вируса путем предупреждения формирования собственного гликопротеина, требуемого для завершения вирусной мембраны. В работе Н.А.Blongh и др. [Biochem.Biophys. Res.Comm. 141(1), 33 38 (1986)] указывается, что неспецифичные ингибиторы гликосилирования 2-дезокси-D-глюкоза и β-гидрокси-норвалин ингибируют экспрессию ВИЧ-гликопротеинов и блокируют образование синдитиев. Вирусное размножение ВИЧ-инфицированных клеток, обработанных указанными агентами, прекращается, вероятно, из-за отсутствия гликопротеина, необходимого для формирования вирусной мембраны.

В другой работе [W.Me Dowell и др. Biochemistry 24 (27), 8145 52 (1985)] ингибитор гликосилирования 2-дезокси-2-фторо-1-манноза показывает ингибирование противовирусной активности против вируса гриппа инфицированных клеток путем предотвращения гликосилирования белка вирусной мембраны. В этой работе также исследовалась противовирусная активность 2-дезоксиглюкозы и 2-дезокси-2-фторглюкозы, и в результате этих исследований было обнаружено, что каждое из этих соединений ингибирует гликосилирование вирусного белка различными механизмами. Однако другие известные ингибиторы гликосилирования не обнаружили противовирусной активности. Поэтому противовирусная активность вообще и активность против конкретного вируса ингибиторов гликосилирования является абсолютно непредсказуемой.

В Южно-Африканском патенте 90\0094, выданном 31 октября 1990, указывается, что очищенная форма гепарина, сульфатированного полисахарида связывается посредством взаимодействия с вирусным белком, который является ответственным за распознавание клетки и способствует ограниченному ингибированию инфицирования хозяйской клетки. Однако гепарин оказывает некоторые побочные действия, например вызывает геморрагию, и ускоряет образование тромбов, а также вызывает тромбоцитопению. Использование гепарина противопоказано пациентам со склонностью к кровотечениям или пациентам с гемофилией, пурпурой, тромбоцитопенией, внутричерепным кровотечением, септическим эндокардитом, активным туберкулезом, повышенной проницаемостью капилляров, язвами желудочно-кишечного тракта, осложненной гипертензией, угрожающим абортом или раком внутренних органов. Эти противопоказания особенно касаются больных гемофилией, поскольку они особенно предрасположены к заболеванию, вызываемому ВИЧ.

Уже давно известно, что синтетические водорастворимые полимеры показывают широкий спектр биологической активности (R.M.Otteubrite. Biological Activities of Polymers, Amer.Chem.Soc.Symp.Ser, N182, стр. 205 220, изд. С.Е. Сarraher и G.G.Gebeleni (1982)).

Сополимер дивинилового эфира и ангидрида малеиновой кислоты обладает активностью против ряда вирусов, и возможность его использования в противораковой химиотерапии многие годы исследовалась Breslav D.S. [Pure and Applied Chem. 46, 103 (1976)] Полиакриловые, полиметакриловые и ряд других алифатических водорастворимых полимеров также показывают широкий спектр биологической активности [W.Regelson и др. Nature 186, 778 (1960)] К сожалению, слишком высокая токсичность этих полимеров не позволяет использовать их в клинических условиях. Кроме того, эти полимеры имеют общую молекулярную массу и не способны проходить через почечные мембраны.

Для решения проблем, связанных с токсичностью полимеров, были предприняты попытки синтезировать низкомолекулярные алифатические полимеры (1000 10000) [R. M.Ottenbrite. Biological Activities of Polymers, Amer Chem. Soc. Symp. Ser. N182, стр. 205 220, изд. С.Е. Сarraher и С.G.Gebeleni (1982)] Было обнаружено, что указанные полимеры являются менее токсичными, но при этом имеют более низкую противовирусную активность. Эти низкомолекулярные алифатические полимеры могут быть классифицированы как "статистические клубки".

Такие полимеры имеют непредсказуемую конфигурацию вследствие гибкости групп связи основной цепи. Конфигурация статистического клубка в растворе может быть, в основном, охарактеризована как глобулярная. Хотя механизм действия таких водорастворимых полимеров пока неизвестен, однако, в качестве предположения, можно сказать, что полимер связывается с вирусной мембраной, например, вируса энцефаломиокардита, посредством межионного притяжения, сообщая тем самым вирусу неспособность к инфицированию хозяйской клетки.

Еще один способ с использованием синтетического полимера направлен на то, чтобы поставлять ионные группы в основную цепь полимера, имеющего более определенную геометрию. Существует множество неионных синтетических полимеров, которые имеют более линейную геометрию в безводном растворе, чем алифатические полимеры, описанные выше [I.Macromolecular Sci-Rewiewsni Macromol. Chem. Phys. C.26 (4), 551 (1986)] Факторы, способствующие образованию таких структур нестатических клубков, являются сложными и мало изученными. В основном, указанные полимеры имеют либо очень ограниченное число вращательных связей, которые являются непараллельными полимерной оси, либо в этих структурах имеется связывающий водород или биполярные взаимодействия, которые благоприятствуют линейным структурам. Эти полимеры называют "жесткоцепными полимерами". Полиамид, происходящий от терефталевой кислоты и n-диамонобензола (известный под торговой маркой Кевлар ТМ (Kevlar^TM), поставляемый DuPont), является хорошо известным примером таких полимеров.

Жесткие, синтетические, водорастворимые полимеры обычно меньше используются, но известно очень мало таких полимеров, имеющих большую молекулярную массу (например, см. патент США N 4824916 и 4895660). Структура нестатистического клубка полимеров указанного класса приводит к высокой вязкости раствора для данной молекулярной массы и концентрации.

Очевидно, что было бы желательно найти средство для лечения СПИДа и САК, которое не оказывало бы побочного действия или обладало минимальным побочным действием и было бы значительно более эффективным, чем те полимеры, которые использовались до настоящего времени в фармацевтике.

Авторами настоящей заявки было обнаружено, что анионные олигомеры ингибируют репликацию вируса, не оказывая при этом побочного действия, свойственного гепарину и известным полимерам. Указанные олигомеры имеют упорядоченное межанионное расстояние и жесткую цепь и являются водорастворимыми.

Новые олигомеры настоящего изобретения являются анионными, карбонилсодержащими соединениями. Примерами указанных олигомеров являются полимочевины, поликарбонаты, сложные полиэфиры или полиамиды, имеющие среднечисленную молекулярную массу Мn < 10000 и упорядоченное межанионное расстояние и являющиеся жесткоцепными и водорастворимыми. Олигомеры, а также их соли являются фармацевтически приемлемыми и могут быть использованы в качестве лекарственных средств.

Другим применением указанных анионных олигомеров является их использование в качестве эффективных загустителей в водных растворах или в качестве мягких ионных детергентов, в основном, водорастворимые полимеры, включая олигомеры настоящего изобретения, имеют широкое применение в качестве загустителей, диспергаторов и флокулянта. Олигомеры настоящего изобретения могут быть использованы в нефтяной промышленности, горном деле, бумажной промышленности, текстильной промышленности, в косметике и технологии приготовления пищевых продуктов. Кроме того, низкомолекулярные полимеры настоящего изобретения, т.е. олигомеры, могут быть использованы в качестве исходных материалов для получения высокомолекулярных полимеров и сополимеров.

Таким образом, настоящее изобретение относится к водорастворимому, жесткоцепному олигомеру с молекулярной массой менее (<) 10000, содержащему повторяющиеся звенья, связанные посредством карбонильных связывающих групп; причем указанный олигомер имеет анионные группы, в основном линейную геометрию, такую, что расстояния между анионными группами этого олигомера в водной среде являются регулярными. Предпочтительно, если каждое повторяющееся звено имеет по крайней мере две анионные группы.

В настоящем изобретении может быть использован любой олигомер, удовлетворяющий вышеуказанным критериям. В частности, предпочтительными олигомерами являются полимочевины, поликарбонаты, сложные полиэфиры или полиамиды. Указанные олигомеры, предположительно, имеют линейную геометрию.

Новые олигомеры настоящего изобретения, которые могут быть представлены полимочевиной, поликарбонатами, сложными полиэфирами или полиамидами, имеют среднечисленную молекулярную массу M_n < 10000, структуру с упорядоченным межанионным расстоянием, в основном линейную геометрию в водной среде, и являются жесткоцепными и водорастворимыми. Указанные олигомеры являются предпочтительно линейными в своей основной цепи, а также могут быть в виде соли; особенно предпочтительными солями являются фармацевтически приемлемые соли.

Предпочтительными олигомерами настоящего изобретения являются соединения, представленные приведенной ниже формулой: поликарбонат формулы: где X означает: 5 , , 10 , , 15 , 20 , 25 30
где N является целым числом от 3 до 50 и
где Х¹ является НО-Х-группой, где Х определен выше или С₁-C₄-алкильной группой, фенильной группой или фенильной группой, замещенной от 1 до 2R¹-частями и до 3 заместителями, независимо выбранными из атома хлора, атома брома, или С₁-С₄-алкильной группы: и
X² является атомом водорода, или -СО₂X¹, где X¹ определен выше;
R¹ означает SO₃R², -CO₂R², -PO₃(R²)₂, или -OPO₃R²,
R² означает атом водорода или фармацевтически приемлемый катион.

Термин "фармацевтически приемлемый катион" означает катион, который является допустимым для использования в фармацевтических целях. Те катионы, которые являются, в основном, нетоксичными при введении их в дозах, необходимых для достижения желаемого эффекта, и сами по себе не обладают значительной фармакологической активностью, также подпадают под определение "фармацевтически приемлемый катион". В качестве примера можно указать соли щелочных металлов, таких как натрий или калий; щелочно-земельных металлов, таких как калий и магний; соли аммония; соли металлов группы IIIA, например алюминия; и органических первичных, вторичных и третичных аминов, таких как триалкиламин, например триэтиламин, прокаин, дибензиламин, N, N'-дибензидэтилендиамин, дигидроабиэтиламин, N-(C₁ - C₄)-алкилпиперидин, и других подходящих аминов.

Предпочтительными являются соли натрия и калия. Термин "фармацевтически приемлемый" означает приемлемый для введения теплокровным животным и человеку, и поскольку фармацевтически приемлемое средство является нетоксичным, оно не причиняет вреда теплокровным животным, а также может быть использовано в фармацевтических целях. Фармацевтически приемлемые катионы олигомеров настоящего изобретения могут быть получены путем стандартной ионообменной обработки или обработки R¹-кислоты соответствующим основанием.

Если лекарственные средства, полученные с использованием олигомеров настоящего изобретения, предназначены для иных применений, то могут быть использованы и неприемлемые в фармацевтическом отношении соли. Например, могут быть использованы аддитивные соли бария, цинка и титана.

Олигомеры настоящего изобретения являются низкомолекулярными, жесткоцепными и водорастворимыми полимерами. Кроме того, указанные олигомеры имеют структуру с упорядоченным межанионным расстоянием. Термин "упорядоченное межанионное расстояние" или "регулярное расстояние между анионными группами" означает, что указанные анионные группы (R¹) присутствуют в основной цепи полимера на расстоянии, определенном используемым материалом исходного реагента, и местоположение указанных анионных групп контролируется предсказуемым образом. Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, можно лишь указать, что анионные группы олигомеров настоящего изобретения, по всей вероятности, являются той частью, которая связывается с ВИЧ и/или клеточной мембраной, предотвращая тем самым способность вируса к репликации.

Термин "преимущественно линейная геометрия" в водной среде относится к конфигурации раствора олигомера. Для оценки конфигурации полимерных молекул в растворе существует известный специалистам способ, основанный на следующей формуле, называемой уравнением Марка-Хоувинка ["Introduction to Physical Polymer Science", изд. L.H.Sperling пуб. John Wilay Sons (1985), стр. 81 - 83]
[η]=КМα
где η характеристическая вязкость; М среднемассовая молекулярная масса; К постоянная, зависящая от размера связей в цепи; и a постоянная, определяемая конфигурацией полимера. Характеристическая вязкость для полимера типа статистического клубка соответствует 0,5 < a < 0,9; а для линейного полимера она соответствует 0,9 ≅ a < 1,8.

Эта формула выражает соотношение между вязкостью h и молекулярной массой М. В настоящем изобретении линейные полимеры определяются как полимеры со значением a, превышающим или равным 0,9. Для стержнеобразных жестких полимеров теоретическое значение (верхний предел) составляет 1,8. Для данной молекулярной массы более высокая вязкость раствора может быть получена с использованием полимеров с линейной конфигурацией по сравнению с вязкостью, полученной с использованием статистического клубка. Кроме того, следует отметить, что значение a зависит от используемого растворителя. Например, a для данного водорастворимого полимера могут отличаться при различных солевых концентрациях. В настоящем изобретении солевая концентрация берется в соответствии с уровнями присутствия солей в сыворотке (около 80 г/л NaCl, 4 г/л KCl).

Термин "олигомер", используемый в настоящем описании изобретения, включает в себя олигомеры со всеми возможными значениями П, например П 3 - 50. Предпочтительными являются линейные олигомеры с П, равным целому числу от 3 до 50, а более предпочтительно от 3 до 20, а еще более предпочтительно
от 3 до 15. Само собой разумеется, что величина непосредственно связана с молекулярной массой олигомера. Главное, чтобы указанные олигомеры имели достаточно низкую молекулярную массу, такую, чтобы с одной стороны они проходили через почечную выделительную мембрану, а с другой стороны, чтобы они обладали способностью к ингибированию вируса ВИЧ. Среднечисловая молекулярная масса регулируется стехиометрией реагентов. Среднечисловая молекулярная масса (М_n) составляет менее 10000, предпочтительно от около 500 до около 10000, а наиболее предпочтительно, от около 1000 до около 6000.

В целях настоящего изобретения, описываемые олигомеры и их физически приемлемые соли считаются эквивалентными. Понятие "физиологически приемлемые соли" относится к солям, основания которых могут образовывать соль по крайней мере с одной кислотной группой R¹-группы, и которое не оказывают неблагоприятного воздействия при введении их в организм. Подходящими основаниями, например, являются гидроокиси щелочных металлов и щелочно-земельных металлов, карбоната и бикарбоната щелочных и щелочно-земельных металлов, такие, как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, карбонат калия, бикарбонат натрия, карбонат магния и т.п. а также аммиак, первичные, вторичные и третичные амины и т.п.

Особенно предпочтительными основаниями являются гидроксиды, карбонаты и бикарбонаты щелочных металлов. Физиологически приемлемые соли могут быть получены с помощью стандартных ионообменных процессов, или путем обработки R¹-кислоты соответствующим основанием. Примеры аддитивных солей будут приведены ниже.

Композиции настоящего изобретения могут быть изготовлены как в твердой, так и в жидкой форме. Эти композиции могут быть изготовлены в виде набора лекарственных форм таким образом, что два компонента смешивают за определенное время до начала приема. Либо к этому препарату или набору подмешивают требуемый фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.

Олигомеры настоящего изобретения являются растворимыми в воде и в солевых растворах, особенно в растворе с физиологическим значением pH. Таким образом, олигомеры настоящего изобретения могут быть легко приготовлены в подходящей стандартной дозе в виде водного раствора. После введения в организм олигомер настоящего изобретения сохраняет свою растворимость in vivo.

Описанная выше формула I олигомеров имеет следующие предпочтительные определения значения Х:
,
5 или ; и
10 X представляет собой:
15 , , ,
20 , , ,
25
30
5 или ;
10 при этом особо предпочтительно, если X представляет собой:

АНТИ-ВИЧ анионные олигомеры могут быть использованы для предупреждения образования синцитиев в клетках, инфицированных ВИЧ-1 или другими родственными вирусами, имеющими поверхностный белок gp 120. Анти-ВИЧ анионные олигомеры могут быть использованы для лечения СПИДа и САК и других заболеваний, вызванных ретровирусом ВИЧ-1 или другими родственными вирусами, имеющими поверхностный белок gp 120.

Анионные олигомеры настоящего изобретения могут быть использованы в виде чистых соединений, или в виде смеси, такой, в которой значение II соответствует конкретному определению формулы I IV, или смесей соединений, принадлежащих разным вышеуказанным формулам, например, соединений формулы I и формулы II, или в виде смесей с другими известными агентами, использующимися в тех же целях, что и настоящее изобретение. Однако для всех полученных олигомеров II представляет собой среднечисловую длину повторов распределения в олигомерах всех формул.

Количество анти-ВИЧ анионных олигомеров, необходимое для предупреждения образования синцитиев в ВИЧ-инфицированных клетках, может быть любым эффективным количеством. Экспериментально было определено, что анти-ВИЧ анионные олигомеры при использовании их в виде водных препаратов в концентрации 100 мкг/мл показывали полное ингибирование образования синцитиев, а также способствовали снижениию количества присутствующего антигена gp 24, который является индикатором репликации вируса, до менее чем 300 пг/мл.

Количество анти-ВИЧ анионного олигомера, вводимое для лечения СПИДа и САКа, вызванных инфицированием ВИЧ, может широко варьироваться в зависимости от конкретно используемой разовой формы, периода лечения, возраста и пола пациента, природы и степени нарушений и других факторов, хорошо известных практикующим врачам. Кроме того, анти-ВИЧ анионные олигомеры могут быть использованы в сочетании с другими известными средствами, используемыми при лечении ретровирусных заболеваний, а также с известными средствами, используемыми для симптоматического лечения осложнений и состояний, вызванных ретровирусами.

Согласно настоящему изобретению анти-ВИЧ эффективное количество анти-ВИЧ анионного олигомера, вводимого в организм, в основном, составляет около 0,1 мг/кг до 500 мг/кг на вес тела пациента и может быть введено один раз или несколько раз в день. Анти-ВИЧ анионные олигомеры могут быть введены в сочетании с фармацевтическими носителями, которые обычно используются при составлении стандартных разовых форм для перорального или парентерального введения.

Для перорального введения анти-ВИЧ анионные олигомеры могут быть использованы в виде твердых или жидких препаратов, например в виде капсул, драже, таблеток, пастилок, расплавов, порошков, растворов, суспензий или эмульсий. Твердые разовые формы могут быть изготовлены в виде капсул жесткого типа и с мягкой желатиновой оболочкой, содержащих, например, поверхностно-активные вещества, замасливатели и инертные наполнители, такие как лактоза, сахароза, сорбит, фосфат кальция и кукурузный крахмал.

В другом варианте осуществления изобретения анионные олигомеры могут быть изготовлены в виде таблеток с использованием лактозы, сахарозы, кукурузного крахмала в сочетании со связующими, такими как аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; дивинтегрирующими агентами для облегчения разложения и растворения таблетки после введения, таких как картофельный крахмал, альгиновая кислота, кукурузный крахмал и хьюаровая камедь; замасливателями для улучшения текучести при гранулировании таблеток и предупреждения адгезии таблеточного материала с поверхностями экструзионных головок и пресс-форм, например таких, как тальк, стеариновая кислота или стеарат магния, кальция или цинка; красителями и ароматизирующими агентами для улучшения вкусовых качеств и внешнего вида используемых препаратов.

Подходящими наполнителями для пероральных жидких лекарственных форм являются разбавители, такие как вода, спирты, например этанол, бензиловый спирт и полиэтиленгликоль, которые могут быть использованы как сами по себе, так и в сочетании с фармацевтически приемлемыми поверхностно-активными веществами, суспендирующими агентами или эмульгирующими агентами.

Анти-ВИЧ анионные олигомеры настоящего изобретения могут быть также введены парентерально, то есть, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, в виде инъецируемых разовых форм, содержащих анионные олигомеры в физиологически приемлемых разбавителях в сочетании с фармацевтическими носителями, которыми могут быть стерильные жидкости или смеси жидкостей, таких как вода, солевой раствор, водные растворы декстрозы и родственных сахаров; спирты, такие как этанол, изопропанол или гексадециловый спирт; гликоли, такие как пропилен-гликоль или полиэтиленгликоль, глицериновые кетали, такие как 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол; простые эфиры, такие как поли(этиленгликоль)400; масла; жирные кислоты или глицериды, или ацетилированные глицериды жирных кислот, которые могут быть использованы отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемыми поверхностно-активными веществами (ПАВ), такими как мыла; детергентами; суспендирующими агентами, такими как пектин, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза; или эмульгирующими агентами и другими фармацевтическими адъювантами.

Примерами масел, которые могут быть использованы в парентеральных препаратах настоящего изобретения, являются нефтяное, животное, растительное или синтетическое масло, например арахисовое масло, соевое масло, кунжутное масло, масло из семян хлопка, кукурузное масло, оливковое масло, вазелиновое масло и минеральное масло. Подходящими для использования в настоящем изобретении жирными кислотами являются олеиновая кислота, стеариновая кислота и изостеариновая кислота. Подходящими сложными эфирами жирных кислот являются, например, этилолеат и изопропилмиристат. Подходящими мылами являются соли жирных кислот, образованные от щелочных металлов, аммония и триэтиламина, а подходящими детергентами являются катионные детергенты, например галиды диметилдиалкиламмония, галиды алкилпиридиния, ацетаты алкиламинов; анионные детергенты, например алкил-, арил- и олефиновые сульфонаты, алкилсульфаты, олефиновые сульфаты, эфирные сульфаты и сульфаты моноглицерида и сульфосукцинаты; неионные детергенты, например оксиды жирных кислот, алканоламиды жирных кислот и сополимеры полиоксиэтилена и полипропилена; и амфотерные детергенты, например алкил-бета-аминопропионаты, и соли 2-алкил-имидазолин-четвертичного аммония, а также их соли.

Парентеральные композиции настоящего изобретения, в основном, содержат от около 0,5 до около 25 мас. анти-ВИЧ анионного олигомера в растворе. Кроме того, могут быть использованы консерванты и буферы. В целях минимизации или устранения раздражений в месте введения инъекции указанные композиции могут содержать неионогенные ПАВ с гидрофильным-лиофильным балансом (НLB) от около 12 до около 17. Количество ПАВ в указанных композициях составляет от около 5 до около 15 мас. ПАВ может быть единственным компонентом, имеющим вышеуказанный НLB, или может быть смесью двух или более компонентов, имеющих нужный НLB. Примерами ПАВ, которые могут быть использованы в парентеральных композициях настоящего изобретения, являются соединения, относящиеся к классу сложных эфиров жирных кислот полиэтиленсорбитана, например сорбитанмоноолеат.

Олигомеры настоящего изобретения могут быть также использованы с профилактической целью, то есть, в целях предупреждения трансмиссии вируса от инфицированного организма к неинфицированной цели. Распространение вируса пропорционально обмену крови, но его трансмиссия может быть осуществлена также путем обмена других физиологических жидкостей. Таким образом, олигомеры настоящего изобретения могут быть составлены с использованием детергентов для использования при очистке, в частности при анализах в клинических лабораториях и больницах, где вручную обрабатываются пробы крови инфицированных пациентов. Композиции, содержащие олигомеры настоящего изобретения, могут быть использованы для очистки медицинских/хирургических инструментов и посуды, а также обработки рук и других участков кожи лаборантов в целях профилактики.

Олигомеры настоящего изобретения также могут быть использованы в виде жидких и порошковых композиций для наружного применения путем нанесения на поверхность противозачаточных средств, таких как презервативы, осуществляемого либо пользователем, либо производителем указанных противозачаточных средств до их продажи. Олигомеры настоящего изобретения могут быть составлены в композиции в виде влагалищных душей для использования женщинами перед половым актом с инфицированным партнером. Олигомеры настоящего изобретения могут быть также изготовлены в сочетании с замасливателями в виде сперматоцидных желе и лосьонов. И наконец, олигомеры настоящего изобретения могут быть также добавлены в виде композиций в горячие ванны, вибрационные ванны и плавательные бассейны в целях инактивации потенциальной вирусной активности.

Определения.

Термины, используемые в описании настоящего изобретения, имеют следующие значения:
II среднечисловая длина повторов в распределении олигомеров всех формул.

RРМI клеточные культуральные среды.

ТС1D50 единица тканевой инфекционной культуры, т.е. количество культуральной жидкости, эффективное для инфицирования 50% клеток.

МТТ бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия.

МТ 4 клеточная линия.

Р 24-тест-Аббот-анализ вирусного ядерного антигена с использованием набора для анализа поставляемого abbott.

Анализ на ВИЧ Conlter^TM радиоиммунный анализ на определение вирусного антигена Р 24 rs CDu рекомбинантный растворимый СD₄, содержащий 4 экстрацитоплазматических иммуноглобулина, аналогичных вариабельным (V) областям V₁-V₄.

Т 4-метиланилин или толуидин, за исключением тех случаев, когда используется термин "Т4-клетки" или "Т-хелперные клетки".

Р фосген.

C п-крезол.

МБС 4-метилбензоилхлорид.

ТРС 1,4-бензолдикарбонилхлорид или терефталоилхлоpид.

ТРСS 2,5-бис хлорокарбонил бензолсульфонат натрия, имеющий формулу:

НВDS дикалий 2,5-дигидрокси-1,4-бензолдисульфонат, имеющий формулу:

НВРDS дикалий 4,4'-дигидрокси(1,1'-бифенил)-2,2'-дисульфонат, имеющий формулу:

PDS-2,5-диамино-1,4-бензолдисульфоновая кислота, имеющая формулу:

БРDS-4,4'-диамино-(1,1'-бифенил)2,2'-дисульфоновая кислота, имеющая формулу:

St DS транс-2,2'-(1,2-этендиил)бис(5-аминобензолсульфоновая кислота), имеющая формулу:

БРDS (P/T - поли{амино[2,2'-дисульфо(1,1'-бифенил)-4,4'диил]иминокарбонил} альфа-{ [4-метилфенил)амино]карбонил}-омега-[(4-метилфенил)амино] и представлены формулой I (см. выше), где R является 4-метилфенилом, R² - водород, Х является:

где и определен выше в формуле I.

St DS (Р/Т - поли[имино(3-сульфо-1,4-фенилен)-1,2-этендиил-(2-сульфо-1,4-фенилен) иминокарбонил] альфа-{[(4-метил-фенил)-амино]карбонил}- омега-[(4-метилфенил)амино] и представлен формулой I, если R является 4-метилфенилом, R² является водородом, Х является:

где N определен в формуле I.

PDS (P/T - поли[имино(2,5-дисульфо-1,4-фенилен)иминокарбонил]альфа-{(-метилфенил)- амино] карбонил} -омега-[(4-метилфенил)амино] и представлен формулой I, где R является метилфенилом, R² является водородом, Х является

и N определено выше в формуле I.

НВDS (Р/С поли[окси(2,5-дисульфо-1,4-фенилен)оксикарбонил] альфа-[(4-метилфенокси)карбонил] -омега-(4-метил-фенокси) и представлен формулой II (см. выше), где Х¹ является 4-метилфенилом, R² является водородом, а Х является:
, X² является
и N определено в формуле I.

НВРDS (Р/С-поли{ окси[2,2'-дисульфо(1,1'-бифенил)-4,4'-диил]окси-карбонил} альфа-[(4-метилфенокси)карбонил]-омега-(4-метилфенокси) и представлен формулой II, где Х¹ является 4-метилфенилом, R² является водородом, Х является:
, X² является и N определен в формуле I.

НВРDS (ТРС-поли{ окси[2,2'-дисульфо(1,1'-бифенил)-4,4'-диил] оксикарбонил1,4-фениленкарбонил} - и представлен формулой III, R⁴ и R⁵ являются водородом, Х³ является n-фениленом, а Х является:

и N определен выше в формуле I.

НВDS (ТРС - поли[окси(2,5-дисульфо-1,4-фенилен)оксикарбонил-1,4-фениленкарбонил] и представлен формулой III, где R⁴ и R⁵ являются водородом, Х³ является n-фениленом, Х является:

где N определен в формуле I.

ВРDS (ТРС/МВС - поли{имино[(2,2'-дисульфо(1,1'-бифенил)-4,4'-диил]иминокарбонил-1,4- фениленкарбонил} альфа[(4-метилфенил)амино]карбонил}-омега-[(4-метилфенил)амино] и представлен формулой IV, где R⁶ является R-C(O)-NH-X-NH, R является 4-метиленфенилом, R² является водородом, R⁷ является 4-метилбензоилом, Х³ является n-фениленом, Х является:

где N определено формулой I.

Олигомеры получали путем модификации процедуры Кершнера (патент США N4896660, раскрытие которого вводится в настоящее описание в виде ссылки) путем замещения части одного из бифункциональных мономеров монофункциональным регулятором молекулярной массы и проведения реакции в отсутствие ПАВ. Среднечисловая молекулярная масса М_n регулировалась посредством стехиометрии реагентов.

Олигомеры настоящего изобретения получали с помощью различных реакций, описанных ниже.

Полимочевины и полиамиды (формулы I и III).

Ниже подробно описан предпочтительный способ получения полимочевины и полиамида формулы I и III, раскрытый в патенте США N4824916, а также описаны различные реагенты и условия проведения этого способа.

Диамины: имеется большое разнообразие алифатических и ароматических диаминов. Гидрокарбиленовыми двухвалентными радикалами, из которых состоят диамины, могут быть метилен, этилен, бутилен, изопропилиден, фенилен, бифенилен и другие бирадикалы. Ряд возможных заместителей также является достаточно широким и включает в себя гидроксил, алкенил, низшие алкильные группы, карбоксилат, сульфонат и галогены. Заместители не обязательно являются анионными при нейтральном рН в воде.

Бифункциональными электрофилами являются: фосген (карбонилдихлорид), карбонилдибромид, Сl₃COCOСl, Cl₃COCO₂CCl₃, первичные кислые галиды алифатических и ароматических двухосновных кислот, таких как щавелевая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, адициновая кислота, себациновая кислота, фталевая кислота, изофталевая и 2,6-нафталевая кислота.

Акцепторы кислоты: использовались некоторые основания, такие как карбонат натрия, гидроксид натрия и трибутиламин.

Различные добавки: могут быть добавлены различные ПАВ. Подходящими ПАВ являются неионогенные ПАВ, такие как сорбитанмонолаурат, сорбитанмоностеарат, этиленгликольдистеарат, полиэтиленокси/полипропиленокси полимер. Указанные ПАВ трудно удаляются из продукта, и поэтому использование ПАВ нежелательно.

Растворители: в качестве растворителя использовались лишь полярные апротонные растворители, такие как N, N-диметилацетамид и N,N-диметилформамид. Проблемой также является комбинация воды и второго растворителя, такого как толуол, тетрахлорметан, бензол, ацетон, этилендихлорид и т.п. Типичное отношение органических и водных растворителей составляет около 0,5 2.

В способах, описанных в литературе, первичные кислые галиды добавляют к размешанным раствору или суспензии других исходных материалов. В некоторых случаях основание добавляют во время добавления карбонилдигалида. Температуру поддерживают в пределах от 0^o до 50^oC, а предпочтительно, от 20^o до 30^oC. Отношение реагентов (молярное отношение диамина к первичному кислому галиду) составляет от около 0,9 до 1,2, а предпочтительно использовать эквимолярные количества.

Реакцию размешивают со скоростью, достаточной для размешивания реагентов. Скорость реакции частично зависит от межфазной граничной площади, а поэтому предпочтительно весьма интенсивное размешивание. В этих целях могут быть использованы существующие в продаже смеси.

Способ, используемый для получения полимочевины настоящего изобретения, является модификацией способа, описанного выше.

Диамины: диамины настоящего изобретения являются, в основном, ароматическими соединениями с формулами, описанными в предыдущей главе. Указанные диамины являются замещенными по крайней мере одной группой, являющейся заряженной при нейтральном pН, предпочтительно сульфонатом. Приемлемыми также являются моновалентные алифатические заместители. Может быть использован небольшой набор связывающих групп, которые связывают вместе ароматические радикалы, например, таких, как трансзамещенный этилен и ацетилен. Предпочтительными диаминами являются такие диамины, в которых углерод-азотные связи являются параллельными, например, такие, как PDS, PDS, SFDS и 2,5-диаминобензолсульфоновая кислота.

Бифункциональные электрофилы: для получения полимочевин используют фосген (карбонилдихлорид) и карбонилдибромид и другие предшественники мочевины, такие как карбонилдиимидазол, гексахлорацетон, Сl₃COCO₂CCl₃, ССl₃COCl и Cl₃OCOCl. Для получения полиамидов используют ароматические двухосновные кислоты, такие как изофталевая и терефталевая кислота (ТРС), и 2,6-нафталиндионовая кислота. Указанные двухосновные кислоты могут иметь нейтральные и заряженные заместители, такие как моновалентный алкиловый радикал (метил, этил, бутил) и/или заряженные группы, такие как сульфонаты, фосфаты и т.п. Примером такого заряженного бифункционального электрофила является 2,5-бис хлорокарбонил бензолсульфонат натрия (ТРСS).

Акцепторы кислоты: в качестве акцепторов кислоты может быть использован ряд неорганических оснований, таких как гидроксиды, карбонаты, бикарбонаты и фосфаты щелочных металлов или двухвалентных металлов. Предпочтительными являются акцепторы кислоты с буферным действием, если все основания добавляют перед добавлением бифункционального электрофила. Могут быть также использованы органические основания, такие как триалкиламины, однако эти основания не являются предпочтительными.

Монофункциональный регулятор молекулярной массы: для ограничения молекулярной массы может быть использован ряд агентов. Такими агентами могут быть алифатические или ароматические соединения, которые регулируют с диаминами или бифункциональными электрофилами. Примерами подходящих монофункциональных агентов являются амины, такие как анилин, метиланилин, метиламин, этиламин, бутиламин, диэтиламин, аммиак, N-метиланилин, фенол и крезол. Примерами монофункциональных аминореактивных агентов являются бензоилхлорид, ацетилхлорид, биофинилхлороформат. Указанные регуляторы молекулярной массы могут также содержать заряженные заместители, например калий 2-сульфофенил или калий 4-сульфоанилин.

Различные добавки: добавление поверхностно-активных веществ не является обязательным или предпочтительным и может осложнить процесс выделения.

Растворители: один растворитель, вода, является предпочтительным, если бифункциональный электрофил является жидкостью при реакционной температуре. Примером такого бифункционального электрофила является фосген. Если указанный электрофил является твердым, то используются водонерастворимые реагенты и предпочтительным является использование небольшого количества водо-несмешивающегося сорастворителя. Например, если используется терефталоилхлорид, то для улучшения взаимодействия между реагентами может быть добавлено небольшое количество метиленхлорида. Примерами таких не смешивающихся с водой растворителей являются хлороформ, тетрахлорметан, толуол и метилхлорид, в основном отношение органических растворителей к водным растворителям составляет 0 1, а предпочтительно 0 0,1.

Способ осуществляют при температуре реакции, в основном, от около 0 до 100^oС. Предпочтительно температурой является температура от 0 до 25^oС. Если используются низкокипящие исходные материалы, например фосген (т.кип. 6^oC), то реакцию предпочтительно проводить при температуре точки кипения или ниже. Давление не является критическим параметром для данного способа, и, в основном, используется атмосферное давление. Для оптимизации процесса pН реакции должно тщательно поддерживаться. При низком pН (<6) реакция протекает очень медленно, а при высоком pН (>10) бифункциональный электрофил становится нестабильным под воздействием гидроокиси или другого основания. При высоком pН может также происходить деградация полимочевины. Предпочтительное значение pН составляет в пределах от 7 до 9.

Если не используется агент регуляции молекулярной массы, то этот контроль молекулярной массы может быть достигнут путем тщательной корректировки стехиометрии реагентов. Как диамин, так и бифункциональный электрофил могут быть использованы в избытке, например, в молярном избытке от 1 до 100%
Указанная стехиометрия должна рассчитываться для любого функционального электрофила, который разрушается гидролизом, перед реакцией с диамином. Например, если фосген используется при высоком pН, то большой избыток необходим для компенсации быстрой реакции с гидроксидом, который его разрушает. Поскольку степень этой побочной реакции трудно регулировать, то для контроля молекулярной массы предпочтительно использовать монофункциональный регулятор молекулярной массы. Хотя упомянутая выше техника может быть использована для регулирования молекулярной массы, однако полученные продукты являются смесями полимеров с несколькими молекулярными массами, характеризуемыми определенным распределением.

Порядок добавления реагентов не является решающим, однако предпочтительно сначала добавлять бифункциональный электрофил. Если используемый акцептор кислоты не является буфером, например гидроксиды, то наиболее предпочтительно часть его добавлять в начале для доведения pН до желаемого значения, а оставшееся количество добавлять вместе с бифункциональным электрофилом.

И наконец, указанные полимеризации желательно проводить при высоких концентрациях. Это позволяет снизить количество растворителя, которое должно быть удалено в целях выделения продукта. Кроме того, в некоторых случаях продукт осаждают из реакционного раствора незадолго до завершения реакции и выделяют путем простого декантирования растворителя. Большую часть неорганической соли, образующейся в результате реакции акцептора кислоты, удаляют в процессе осуществления способа. Концентрация не является критической и может составлять от 0,5 до 50 мас. по массе диамина растворителя. Предпочтительный интервал составляет 5 20 мас.

Продукт может быть выделен путем осаждения реакционного раствора в растворитель, являющийся водосмешиваемым, но плохим растворителем для продукта. Примером таких растворителей является ацетон, метанол, этанол и изопропанол. Поликарбонаты и сложные полиэфиры (формул II и IV).

Использовали способ, описанный выше для получения полимочевины и полиамидов, со следующими изменениями: вместо диаминов использовали дифенолы, при этом соответствующие ароматические дифенолы содержали по крайней мере один заместитель, который является анионным при pН 7. Эти дифенолы имеют структуры, идентичные структурам диаминов, за исключением того, что амины являются замещенными гидроксильными группами. Указанные диоды могут быть предварительно обработаны 1М или 2М основания для образования моно- или дефеноксидов. В качестве конкретных примеров можно привести дикалий 4,4'-дигидрокси(1,1'-бифенил)-2,2'-дисульфонат (НВРDS) и дикалий 2,5-дигидрокси-1,4-бензолдисульфонат (НВDS).

Условия проведения способа являются гораздо более критическими, чем в предыдущем случае, из-за нестабильности продуктов в водных растворах. Особенно важно осуществлять контроль за pН. При pН ниже 7 скорость полимеризации очень мала, а при высоком pН (>9) карбонатные или сложноэфирные группы в полимере подвергаются гидролизу. Интервал предпочтительных pН составляет 7 8, и для его сохранения желательно использовать автоматический pН-регулятор. Интервал используемых температур, при которых может быть проведена полимеризация, является более узким и составляет 0 40^oC, а предпочтительно 0 - 25^oС.

После завершения добавления первичного кислого хлорида желательно некоторое время подождать (обычно 15 120 минут), чтобы убедиться в завершении конверсии исходных материалов. В течение этого периода может быть добавлено еще некоторое количество основания, но при этом надо строго следить за тем, чтобы pН не поднимался выше установленного предела. Продукт выделяют в виде продуктового состава, описанного выше.

Настоящее изобретение более наглядно описывается с помощью приведенных ниже примеров.

Описание экспериментов.

Все растворители и реагенты были получены от коммерческих поставщиков и использовались без дополнительной очистки, за исключением того, что ВРDS очищали путем перекристаллизации из диметилсульфоксида в атмосфере азота.

PDS получали способом, описанным в патенте ФРГ N1393557 (раскрытие которого вводится в настоящее описание в виде ссылки), и полученный продукт перекристаллизовывали из 1% (об/об) Н₂SO₄.

Характеристическую вязкость измеряли при 0,5 г/дл в деионизованной воде и уравновешенном солевом растворе Ханка (НВSS) (поставляемом от Сигма Кемикел) при 25^oC, если это не оговорено особо.

Содержание воды в очищенных диаминах определяли путем титрования по способу Карла Фишера.

Протонное и С-ядерные магнитно-резонансные спектры регистрировались на VXP 300 или на спектрометре Varian^TM Gemini 300. Образцы растворяли в D₂O, если это не оговорено особо. Там, где это было возможно, среднечисловые молекулярные массы олигомеров подтверждали путем интеграции площади резонансов от метильных групп концевых "шапок" по отношению к ароматическим резонансам повторяющихся звеньев. Во многих случаях, в частности, для полиамидов, полученных из ВРDS или St DS и ТРС, резонансы имели слишком широкий интервал значений.

Анализ с помощью жидкой хроматографии высокого давления (ЖХВД) осуществляли на жидкостном хроматографе НР 1090 с использованием С-18-обращенно-фазовой колонки (200 мм х 2,1 мм). Колонку элюировали градиентом раствора, начиная 35% CH₃CN и 65% 5 мМ тетра-н-бутиламмонийбутилсульфата и кончая 55% СН₃CN и 45% тетра-н-бутиламмонийсульфата.

Реакцию фосгенирования осуществляли в специально предназначенном для этой цели стандартном аппарате, имеющем резервуар для фосгена из нержавеющей стали, соединенный с фосгеновым баком азотным трубопроводом и трубопроводом для подачи. Резервуар монтировали с таким расчетом, чтобы, при необходимости, подачу можно было осуществлять непосредственно из фосгенного бака. Количество поданного фосгена определяли как разницу в весе резервуара до и после реакции. В течение реакции скорость азотсодержащего потока поддерживалась равной 0,3 мл/мин, если это не оговаривается особо. Фосген вводили со скоростью 0,9 мл/мин (во время добавления фосгена полный газовый поток составлял 1,2 мл/мин). В реакционный сосуд фосген добавляли, в основном, в трехкратном избытке. Скорость размешивания составляла 300 об/мин, а температура раствора поддерживалась в пределах 10 15^oC.

Полученные продукты осушали стандартным способом в вакуумной печи при 40 50^oC в течение 15 часов, как минимум. Исходные материалы.

Пример А.

Получение НВРDS формулы:

В 2-литровой колбе, снабженной воронкой для добавления и стержнем магнитной мешалки, добавляли 49,99 г (0,145 М) 4,4'-диамино(1,1'-бифенил)-2,2'-дисульфоновой кислоты и 600 мл воды. Диамин солюбилизировали путем добавления 30 мл (0,15 М) 5 М NaOH. К полученному раствору добавляли 20,56 г (0,298 М) нитрита натрия. Затем реакционную смесь охлаждали до 0^oС и в течение 30 минут добавляли концентрированную Н₂SO₄, растворенную в 360 мл воды. В результате образовывалось желтое твердое вещество. Затем к смеси добавляли 300 мл воды и смесь поддерживали при 0^oC в течение 1 часа. Затем реакционную смесь фильтровали. Желтое твердое вещество, растворенное в 300 мл воды, помещали в 1-литровую колбу и нагревали до тех пор, пока не останется 50 мл воды. Азот выделялся в течение нагревания. К концентрированному раствору добавляли 20,14 г (0,146 М) К₂CO₃, после чего раствор кипятили. Затем добавляли абсолютный этанол (1,5 л) и полученное коричневое твердое вещество осаждали. Осадок отфильтровывали и осушали в течение ночи в печи при 50^oC. Продукт, НВРDS, получали с выходом 32,33 г (53%), а затем анализировали с помощью Н¹ЯМР.

¹НЯМР δ 6,70 (дд, 1H), 7,05 (д, 1H), 7,14 (д, 1H).

Пример В.

Получение ТРСS формулы:

В 600-мл колбу, снабженную механической мешалкой, термометром и дефлегматором, загружали 40,49 (0,143 М) мононатриевой соли 2-сульфотерефталевой кислоты, 160 мл хлорбензола, 2,4 мл (0,031 М) диметилформамида и 23 мл (0,315 М) тионилхлорида. Раствор нагревали до 105^oС и размешивали в течение 2 часов в атмосфере азота. В течение этого периода отмечалось выделение газа. Раствор охлаждали до комнатной температуры и твердое вещество осаждали. Осадок фильтровали и осушали в течение ночи в вакуумной печи при комнатной температуре, в результате чего получали твердый бледно-желтый продукт с выходом 20,56 г (47%).

Для подтверждения структуры продукта некоторое количество продукта превращали в его сложный метиловый эфир.

В 25-мл колбу, снабженную стержнем магнитной мешалки и барботером для азота, добавляли 0,9509 г (3,12 мМ) полученного выше продукта, 0,6874 г (6,47 мМ) Na₂CO₃ и 10 мл метанола. Реакционную смесь размешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере азота, после чего твердое вещество отфильтровывали, осушали в вакуумной печи в течение 6 часов при комнатной температуре и затем определили, что образовавшийся сложный диметиловый эфир продукта имеет следующие данные:
¹H ЯМР (δ) 3,34 (с, 6Н), 7,89 (д, 1Н), 7,97 (д, 1Н), 8,26 (с, 1Н), ¹³C ЯМР (d): 53,0; 136,0; 139,8; 140,9; 145,2; 146,8; 150,1; 183,5; 186,4.

Конечные продукты.

Пример 1.

Получение БРDS /Р/Т формулы:

Олигомер А (n 6).

В 1-литровую колбу, снабженную отверстием для шприца, карманом для термометра, pН-электродом, холодильником с охлаждением сухим льдом, трубой для впуска газообразного фосгена и механической мешалкой, добавляли 10,00 г (28,19 мМ) ВРDS; 1,35 г (9,40 мМ) толуидингидрохлорида и 400 мл воды. Реакционную смесь размешивали и охлаждали до 12^oC. Размешанную суспензию подвергали взаимодействию с 13 мл 5М NaOH до тех пор, пока не растворится все твердое вещество. После чего к реакционной смеси добавляли 10,1 г (102 мМ) фосгена в течение 27 минут. Во время добавления фосгена добавляли 5М NaOH с помощью шприца, что необходимо для поддерживания pН в пределах от 7 до 8 в крайних пределах pН 6 9. Затем добавляли все 31 мл NaOH, реакционную смесь продолжали размешивать еще 30 минут, а затем pН доводили до значения 9,5 и реакционную смесь размешивали еще 30 минут. После чего реакционную смесь переносили в 2-литровую колбу и неочищенный продукт осаждали путем добавления 1000 мл ацетона. Неочищенный продукт фильтровали, осушали воздухом и получали 18,6 г беловатого порошка, имеющего М_n 2500. Характеристическая вязкость составляла 0,39 дл/г в Н₂O и 0,15 дл/г в НВSS.

Затем продукт анализировали:
¹H ЯМР (δ): 2,2 (шир.с.); 6,7 7,4 (м); 7,9 8,3 (м). Олигомер В (n 9).

Повторяли процедуру примера 1А с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 1)
и получали продукт (12 г) в виде беловатого порошка с М_n 3600. Характеристическая вязкость составляла 0,52 дл/г в Н₂O и 0,21 дл/г в НВSS.

Пример 2.

Получение St DS /Р/Т формулы:

Олигомеры А (n 6).

Повторяли процедуру примера 1А с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 2). и получали продукт (7,4 г, М_n 2600) в виде желтого твердого вещества. Характеристическая вязкость составляла 0,14 дл/г в Н₂О. Анализ продукта показал:
¹H ЯМР (δ): 2,1 (шир.с); 6,7 8,1 (шир.м).

Олигомер В (n 9).

Повторяли процедуру примера 1А с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 3).

Около половины суспензии, полученной после добавления ацетона, фильтровали во избежание закупорки спекшейся смесью. В результате получали 3,5 г (M_n 3800) продукта в виде твердого желтого вещества. Характеристическая вязкость составляла 0,18 дл/г в Н₂O.

Пример 3.

Получение PDS /Р/Т формулы:

Олигомер А (n 9).

Повторяли процедуру примера 1А с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 4)
и получали 2,95 г продукта (М_n 2900) в виде коричневого порошка. Характеристическая вязкость составляла 0,12 дл/г в воде и 0,07 дл/г в HBSS.

Олигомер В (n 15).

Повторяли процедуру примера 1А с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 5)
и получали 3,83 г продукта (_n 4650) в виде коричневого порошка. Характеристическая вязкость составляла 0,12 дл/г в воде и 0,14 дл/г в НВSS.

Пример 4.

Получение HBDS /Р/C формулы:

Олигомер А (n 6).

В 1-литровую колбу, снабженную отверстием для шприца, карманом для термометра, pHН-электродом, холодильником для охлаждения сухим льдом, механической мешалкой и трубой для впуска газообразного фосгена, добавляли 10,16 г (29,35 мМ) НВDS, 1,06 г (0,81 мМ) n-крезола и 400 мл воды. Реакционную смесь охлаждали до 10^oC азотом, входящим в колбу через впускное отверстие для фосгена. Размешанную реакционную смесь обрабатывали 5М гидроокиси натрия до тех пор, пока pН раствора не достигнет 8,0. Затем к реакционной смеси добавляли 10,5 г (106,0 мМ) фосгена в течение 35 минут вместе с 42 мл 5М гидроокиси натрия, поскольку необходимо pН раствора поддерживать в пределах 7,0 7,5. После завершения добавления фосгена раствор размешивали 20 минут при 10^oC. Затем сухой лед удаляли из холодильника и раствор перемешивали еще 30 минут при 10^oC для выпаривания избытка фосгена. Водный раствор переносили в 2-литровую колбу и добавляли 100 мл воды, использованной для промывки реакционного сосуда. Продукт осаждали путем добавления 1000 мл ацетона, фильтровали и осушивали в течение ночи в вакуумной печи при комнатной температуре. Выход продукта составлял 2,11 г, характеристическая вязкость твердого продукта составляла 0,30 дл/г в воде, а М_n 2300.

Пример 5.

Получение НВРDS /Р/C формулы:

Олигомер А (n 6).

Повторяли процедуру примера 4 с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 6).

pН начального раствора составлял 10,0, а затем pН доводили до 6,1 с помощью концентрированной соляной кислоты. В течение 32 минут добавляли фосген вместе с 31 мл 5М гидроокиси натрия для поддержания pН между 7,5 и 8,0. После выпаривания фосгена реакционную смесь переносили в 2-литровую колбу и добавляли 100 мл воды, используемой для промывки реакционного сосуда. Продукт осаждали путем добавления 1400 мл ацетона, фильтровали и осушали в течение ночи в вакуумной печи при комнатной температуре. Выход продукта составлял 1,89 г, характеристическая вязкость твердого продукта составляла 0,17 дл/г в воде, а М_n 2700.

¹H ЯМР: (δ) 2,4 (с); 7,0 (с), 7,2 (с); 7,5 (шир.с).

Пример 6.

Получение НВРDS /ТРС формулы:

Олигомер А (n 4).

В 500-мл колбу, снабженную дефлегматором, воронкой для добавления и механической мешалкой, загружали 7,92 г (18,7 мМ) НВРDS, 3,16 г (37,6 мМ) бикарбоната натрия, 125 мл воды и 25 мл метиленхлорида. К размещенной реакционной смеси добавляли 3,8 г (18,7 мМ) ТРС в 100 мл метиленхлорида в течение 1 часа. Полученный раствор размешивали в течение 1,5 часа при комнатной температуре в атмосфере азота. Затем раствор переносили в 2-литровую колбу и добавляли 100 мл воды, использованной для промывки реакционного сосуда. Для расслоения эмульсии добавляли ацетон в избытке 250 мл. После добавления 1000 мл ацетона на дне колбы образовывалось твердое вещество, которое на вид было похоже на шарики, наполненные водой. Раствор фильтровали, осаждали 750 мл ацетона, снова фильтровали и осушали в течение ночи в вакуумной печи при комнатной температуре. В результате получали 4,89 г коричневого твердого порошка, характеристическая вязкость которого составляла 0,16 дл/г в воде, а М_n 2100. Затем продукт анализировали:
¹H ЯМР δ: 2,2 (с); 7,0 (шир.с); 7,25 (шир. с); 7,5 (шир.с); 8,0 (шир.с).

Пример 7.

Получение HBDS /ТРС формулы:

Олигомер А (n 3).

Повторяли процедуру примера 6 с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 7).

Полученный раствор размешивали в течение 1,5 часа при комнатной температуре в присутствии азота. Затем раствор переносили в 1-литровую колбу и добавляли 100 мл воды, использованной для промывки реакционного сосуда. В колбу добавляли 450 мл ацетона для расслоения эмульсии. В нижнем слое воды образовывался осадок. Затем раствор переносили в делительную воронку и низший слой отделяли. Затем водный раствор обрабатывали 500 мл ацетона. Образовавшееся твердое вещество фильтровали и осушали 2 дня в вакуумной печи при комнатной температуре. В результате получали продукт весом 4,38 г и с характеристической вязкостью 0,05 дл/г. Анализ с помощью ¹ ЯМР и ЖХВД показал значительное количество исходного дифенола.

Для удаления непрореагировавшего исходного материала 2,0 г вышеуказанного твердого продукта растворяли в 200 мл воды. Продукт осаждали путем добавления 700 мл ацетона, фильтровали и осушали в течение ночи в вакуумной печи при комнатной температуре. В результате получали 0,41 г твердого продукта, который имел характеристическую вязкость 0,11 дл/г в воде и М_n 1300.

Пример 8.

Получение BPDS /ТРС/МВС формулы:

Олигомер А (n 6).

В смеситель Уэринга добавляли 200 мл деионизованной воды и 2,65 г (25,0 мМ) карбоната натрия и смесь размешивали при малой скорости до тех пор, пока смесь не растворится. К реакционной смеси добавляли 2,217 г (6,25 мМ) ВРDS через воронку для добавления порошка. Воронку промывали 50 мл воды, которая протекала в смесь. В результате образовался прозрачный бесцветный раствор натриевой соли.

Затем приготавливали второй раствор, содержащий 1,088 г (5,357 мМ) ТРС и 0,193 мл (236 мг, 1,786 мМ) МВС в 200 мл хлороформа. Этот раствор сразу добавляли в раствор натриевой соли, при этом энергично размешивая. Полученную в результате суспензию белого цвета размешивали при малой скорости в течение 15 минут.

После размешивания в течение 15 минут суспензию переносили в 2-литровую колбу, а смеситель промывали около 200 мл воды, которую добавляли к суспензии. К суспензии добавляли 200 мл ацетона. Эмульсия расслаивалась на две фазы с неявным осадком. Нижний слой удаляли через делительную воронку; верхний слой возвращали в колбу. Затем в колбу добавляли 450 мл ацетона в целях осаждения. Осадок фильтровали через три слоя марли. Остаточные растворители удаляли из белого желатинообразного продукта путем сильного отжатия марли. Неочищенный продукт растворяли в 600 мл воды и снова осаждали путем разведения до полного объема 1000 мл ацетона. Осадок снова собирали, растворяли в 150 мл воды и осаждали путем добавления 850 мл ацетона. Осадок собирали как описано выше, затем осушали в вакуумной печи в течение ночи при 35 36^oC и получали 0,8 г волокнистого белого продукта.

Второй урожай продукта получали из первоначального маточного раствора с выходом 0,9 г. Объединенные твердые фракции растворяли путем добавления 500 мл ацетона, в результате чего получали 1,26 г беловатого твердого продукта, М 3450. Характеристическая вязкость составляла 3,85 дл/г в воде. Анализ продукта показал:
¹H ЯМР: δ 2,1 (с); 7,44 (с); 7,78 (с); 8,02 (шир.с).

Олигомер В (n 3).

Повторяли процедуру примера 8А с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 8) и получали 1,58 г (М_n 2000) продукта в виде беловатого порошка. Характеристическая вязкость составляла 1,93 дл/г в воде и 2,41 дл/г в НВSS.

Олигомер С (n 9).

Повторяли процедуру примера 8А с использованием следующих количеств реагентов (см. табл. 9)
и получили белый волокнистый продукт с выходом 1,42 г (M_n 4000), характеристическая вязкость составляла 4,23 дл/г в воде.

Биологические данные.

Пример I.

Способность анти-ВИЧ-олигомера для предупреждения образования синцитиев и экспрессия антигена Р24-вирусного ядра с использованием IМ-клеток и вирусного штамма GB8.

Для того, чтобы показать, что олигомер настоящего изобретения блокирует ВИЧ-инфекцию, Т-клетки CD4⁺ (IM) подвергали воздействию клинического изолята ВИЧ-1, GB8. Сначала вирус инкубировали с олигомером в течение 15 минут, а затем добавляли клетки. После 2-часовой адсорбции вирусный инокулят удаляли, а клетки промывали три раза для удаления следов введенного вируса. Противовирусную активность определяли после 3-дневной инкубации путем построения графической зависимости среднего числа синцитиев, обнаруженных в четвертичных культурах от log₁₀ концентрации анионного полимера или других испытуемых соединений. Способность олигомера также измеряли путем анализа на антиген вирусного ядра (Р24 тест-Абботт) в надосадочной жидкости. В качестве положительного контроля использовали гепарин, декстрансульфат, rsCD4, АТZ или ddC-данные, которые приведены в табл. 10 19.

Пример II.

Инфицирование вирусом IM-клеток осуществляли в присутствии различных концентраций испытуемых соединений. IM-клетки (1 х 10⁵) и 50 100 синцитийобразующих единиц вируса (GB8) добавляли в дублированные лунки планшеты для тканевых культур, содержащих 1 мл объемов среды, для выращивания без лекарственного средства и с содержанием лекарственного средства. Планшету инкубировали в течение 2 дней при 37^oC, а затем анализировали на присутствие синцитиев. В то же время клетки промывали и культуральную среду заменяли. Затем инкубировали еще дня два, бесклеточные супернатанты собирали и анализировали на концентрацию антигена Р24-вирусного ядра с использованием анализа Coulter^ТМ на ВИЧ-антиген. Результаты анализа приводятся в таблицах II IV. В указанных таблицах: N₁D не обнаружено и N₁A не анализировали.

Пример III.

Способность различных анти-ВИЧ-олигомеров к предупреждению гибели вирус-индуцированных клеток с использованием МТ4-клеток и штамма RF.

Различные олигомеры растворяли в RРМI-среде, а затем анализировали на анти-ВИЧ-активность путем удвоенных разведений растворов на 96-луночной планшете для микротитрования. Затем к каждой лунке добавляли 5 х 10⁴ клеток и 100 ТСID50 вируса и планшеты инкубировали в течение 7 дней при 37^oC. Затем к каждой лунке добавляли МТТ и планшеты инкубировали еще 2 часа. Голубые кристаллы формазана растворяли, используя кислый изопропанол, и измеряли поглощение при 540 нм. Результаты представлены в таблице 13.

Пример IV.

Исследование способности к предварительной обработке клеток различными олигомерами и к блокированию инфицирования ВИЧ-1 с использованием IM-клеток и GB8-штамма ВИЧ-1.

IM-клетки предварительно обрабатывали в течение ночи при 37^oC различными соединениями при 20 мкг/мл и оставляли необработанными. Клетки промывали 3 раза в RPMI-среде, а затем инфицировали ВИЧ-1 (GB8) в течение 2 часов при комнатной температуре.

Затем клетки опять промывали 3 раза в RPMI-среде, ресуспендировали в свежей среде для их распределения в публированных лунках и инкубировали при 37^oC. Через 2 дня подсчитывали синцитии, а бесклеточные супернатанты собирали и анализировали на присутствие антигена вирусного ядра, используя анализ на ВИЧ-антиген Coulter^TM. Результаты представлены в таблице 14.

Пример V.

Исследование способности анти-ВИЧ-1-олигомеров к предупреждению образования синцитиев и экспрессия антигена Р24-вирусного ядра с использованием различных вирусных штаммов (GB8 и RF) и клеток (IM и С8 166).

Клетки инфицировали штаммом RF или GB8 в течение 24 часов при 37^oC при множественности инфекции 0,001. Клетки промывали три раза для удаления остаточного вируса, а затем снова помещали на свежую культуральную среду. После чего клетки обрабатывали указанными концентрациями испытуемых соединений через 24 и 48 часов после инфицирования (p.i.). Через указанное количество дней p.i. определяли уровни синцитиев и Р24 описанными выше способами.

Результаты представлены в таблицах 15 17.

Результаты таблицы 15 показывают, что вирус-индуцированные цитопатологические изменения, такие как образование синцитив, могут быть ингибированы, даже если соединения вводятся в уже инфицированные клетки. Эти результаты также показывают, что анионные олигомеры действуют по механизму блокирования связывания вируса с поверхностным белком клеток СD4.

Результаты таблицы 16 показывают, что олигомеры настоящего изобретения являются эффективными против различных вирусных штаммов и различных типов клеток, даже если эти олигомеры добавляют через 24 часа после инифицирования вирусом.

Примечание к табл.17:
а) p.i. после инфицирования;
b) через 48 часов p.i. в контрольных лунках наблюдали приблизительно 50 синцитий/лунка. В то же время, лунки загружали 5 мкг/мл олигомера примера 1А и затем инкубировали. Синцитии подсчитывали на 3-й день p.i. На 4-й день p. i. клетки промывали в воде, содержащей 5 мкг/мл олигомера примера 1А, и затем инкубировали в 5 мкг/мл олигомера примера 1А. Вирус-контрольные клетки промывали в среде, не содержащей испытуемых соединений, и снова инкубировали параллельно. На 6-й день p.i. бесклеточную среду всех образцов собирали и определяли уровни антигена вируса Р24.

Результаты этих исследований показали, что олигомеры примера 1А очищают культуры от синцитиев, стабилизируют от инфекции и снижают уровни антигена вируса в клетках, зараженных вирусом.

Пример VI.

Протокол: С8166-клетки инфицировали ВИЧ (штаммом RF) в течение 1 часа при комнатной температуре до получения множественности инфекции приблизительно 0,01 инф. ед. на клетку. Затем клетки промывали три раза, ресуспендировали в свежей среде и распределяли по дублированным лункам, содержащим различные концентрации испытуемого соединения. После выдерживания в течение 2-х дней при 37^oC клетки исследовали на присутствие синцитиев, а супернатант анализировали на антиген Р24-вирусного ядра, используя метод анализа на ВИЧ-антиген Coulter.

Пример VII.

IM-клетки инфицировали ВИЧ (штаммом GBB) и получили приблизительно 200 синцитий (1х10⁵ клеток через 3 дня после заражения; инфицирование вирусом проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки промывали и ресуспендировали в свежей среде, распределяли по дублированным лункам планшеты для тканевой культуры, содержащим различные концентрации испытуемых соединений. Через 3 дня клетки исследовали, синцитии подсчитывали, а супернатант анализировали на антиген Р24-вирусного ядра с использованием метода ВИЧ-Аg-анализа Coulter.

Несмотря на проиллюстрированные и описанные выше конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам очевидно, что настоящее изобретение не ограничивается изложенными вариантами и что возможны различные его изменения и модификации, не выходящие, однако, за рамки существа и объема нижеследующей формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Водорастворимый олигомер с жестким скелетом, имеющий молекулярную массу менее 10000, содержащий анионные группы и повторяющиеся звенья, сочлененные с карбонильными связывающими фрагментами и имеющий преимущественно такую линейную геометрию, что существует регулярное расстояние между анионными группами в водной среде, общей формулы I

где Х группа

Х₁ незамещенный или замещенный С₁ C₄ алкилом или 1 3 атомами хлора или брома, фенил;
Х₂ незамещенный или замещенный С₁ C₄-алкилом, или 1 3 атомами хлора или брома, фенилкарбоксил;
n 6 9;
R водород или фармацевтически приемлемый катион.

2. Олигомер по п.1, отличающийся тем, что его средняя молекулярная масса 2000 3000.

3. Олигомер по п.1, отличающийся тем, что n 6.

4. Олигомер по п.1, отличающийся тем, что он представлен формулой

5. Олигомер по п.1, отличающийся тем, что он представлен формулой

6. Способ получения водорастворимого олигомера общей формулы I по п.1, отличающийся тем, что соответствующий дифенол подвергают взаимодействию с замещенным фенолом и фосгеном в присутствии водного основания при pH 7 8 и 0 40^oС.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что после добавления фосгена реакционную смесь выдерживают при pH 7 8 в течение 15 120 мин.