Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 71 ki

 

Использование: генная инженерия, биотехнология. Сущность изобретения: в результате целенаправленного поиска штаммов - продуцентов рестиктаз среди клинических изолятов (г. Киев) при помощи специально разработанного метода тестирования активности в экстрактах, полученных из отдельно взятых колоний, выросших на агаризованной среде, с последующим электpофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле, выделен штамм Е.coli ВКМ В-200 6 Д. Полученный штамм является продуцентом рестриктазы ЕСО 71 R1, изошизомера известной эндонуклеазы рестрикции Еco 31 1; содержание фермента в предложенном штамме - не менее 200000 ед. /г сырой биомассы клеток; выход очищенного фермента - 5000 ед./г биомассы клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов: 5'-GGCTCTCN! 3'; 3'-CCAGAGNNNNN! 5' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Еco71кI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером известной рестриктазы Есо31I и может найти применение в генно-инженерных исследованиях как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм Escherichia coli RFL31, продуцирующий рестриктазу Есo311[1] Выход фермента не приводится.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с высоким выходом, быстро растущего на обычных питательных средах.

Предлагаемый штамм Escherichia coli 71к был получен в результате целенаправленного поиска штаммов продуцентов рестриктаз среди клинических изоляторов (г. Киев) при помощи разработанного нами метода тестирования активности в экстрактах, полученных из отдельно взятых колоний, выросших на агаризованной среде, с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле. Содержание рестриктазы Есо71кI в предлагаемом штамме 200000 ед./г сырой биомассы клеток.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ В-2006Д.

Штамм Escherichia coli ВКМ В-2006Д имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые палочковые, размером 0,7 0,8 мкм в поперечнике и 2 3, иногда 5 мкм, в длину, подвижные, грамотрицательные, с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные.

Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 50^oС, оптимальная температура роста 37^oС, оптимум pH 6,8 7,4.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Нитраты восстанавливают до нитритов.

Желатину не разжижают.

Индол не образуют.

Генетические признаки: Клетки обладают устойчивостью к тетрациклину (20 мкг/мл).

Условия хранения штамма: Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2006Д хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при от -20 до -70^oС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.

Пример 1. Тестирование ферментов рестрикции.

Для поиска рестриктаз использовали экспресс-метод, представляющий собой модификацию метода Белавина и соавт. [2] Для этого одну-две большие колонии (около 5·10⁶ 1·10⁷ клеток) суспендируют в 20 мкл буфера А (20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 12,5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), содержащего 10 мг/мл лизоцима, и инкубируют при комнатной температуре (18^oC). Через 30 мин добавляют равный объем буфера В (20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 2% тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), и инкубируют еще 60 мин при 4^oС. Клеточную суспензию (1 и 4 мкл) смешивают с 2 мкг ДНК фага ⊘ 80 vir в 40 мкл буфера С (10 мМ трис-НCl, pH 7,6, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 50, мМ NaCl). Гидролиз проводят при 37^oС в течение 10 мин. Кроме того, 4 мкл клеточной суспензии дополнительно инкубируют в 40 мкл буфера С без субстрата с целью проверки возможного наличия в растворе экстрахромосомной ДНК. Реакцию останавливают экстракцией равным объемом водонасыщенного фенола. Для электрофоретического анализа используют 20 мкл гидролизата.

Пример 2. Получение и очистка рестриктазы.

Культуру клеток Е.coli 71к выращивают в 1 л LB-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37 град.С до титра 4·10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера содержащего 10 мМ трис HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА 10 мМ 2- меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, экстракт получают центрифугированием при 2^oС (48000g).

Для определения активности рестриктазы Есо71кI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис HCl pH 7,5, 50мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1мМ ЭДТА, 10 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37^oС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле.

За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 часа.

Уровень активности рестриктазы Есо71кI, определенный в бесклеточном экстракте штамма Е. coli 71к, около 200000 ед. в пересчете на 1 г сырой биомассы.

Рестриктаза Есо71кI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонках с DEAE-целлюлозой (DE-52 Whatman) и фосфоцеллюлозой Р-11 (Whatman) с последующей хромографией на гидроксилапатите, карбоксиметилцеллюлозе (СМ-32 Whatman) и ДНК-агарозе. Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против буфера: 15 мM Трис-HCl, pH 7,5; 150 мM NaCl; 7 мM 2-меркаптоэтанол; 1мM ЭДТА, 50% глицерин. Выход очищенного фермента 5000 ед на 1 г сырой биомассы.

Очищенный фермент стабилен при -20^oС в течение полугода. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

Пример 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Есо71kI и места гидролиза ДНК.

Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность: 5'-GGTCTCN!-3' 3'-CCAGAGNNNNN!-5', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах первичной нуклеотидной последовательности ДНК фага лямбда: 11424, 42715.

Для подтверждения полученных данных проводят картирование участков узнавания рестриктазой Есо71kI на ДНК фага лямбда, используя совместный гидролиз рестриктазами: ЕсоRI- и Есо71kI, BamHI и Есо71kI, CfrBI и Eco71kI.

Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Есо71kI была использована ДНК фага o 80. Полученные при гидролизе фрагменты ДНК дефосфорилируют фосфатазой из кишечника теленка, фосфатазу инактивируют прогреванием проб при 65^oС в течение 15 мин, смешивают с ДНК-лигазой и в присутствии 0,5 мМ АТФ, проводят реакцию лигирования. В отдельной пробе полученные фрагменты смешивают с фрагментами ДНК фага o 80, полученными при гидролизе Есо31I, не обработанными фосфатазой. Сравнение электрофоретических профилей фрагментов ДНК после обработки ДНК-лигазой позволяет сделать вывод о том, что место гидролиза для рестриктаз Есо31I и Есо71kI идентично, Проведенные эксперименты показывают, что рестриктаза Есо71kI является истинным изошизомером рестриктазы Есо31I.

Полученная рестриктаза Есo71kI характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК 6 5'-GGTCTCN!-3'; 3'-CCAGAGNNNNN!-5'; оптимальное значение pH для действия рестриктазы 7,8 8,0; оптимальная температура действия 37^oС.

NaCl 50 мM БСА 100 мкг/мл Таким образом, полученный штамм Е.coli ВКМ В-2006Д, как продуцент специфической эндонуклеазы Есо71kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 200000 ед./г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет 5000 ед./1 г биомассы клеток.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2006Д продуцент эндонуклеазы рестрикции Есо 71 k1.