Способ регенерации растений люцерны in vitro

 

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: регенерацию растений люцерны в культуре ткани осуществляют путем вычленения экспланта, в качестве которого используют верхнюю часть проростка, разрезанного в середине гипокотиля, обработки его суспензий Agrobacterium tumefaciens и высадки на питательную среду срезом вверх. Кокультивируют с агробактерией в течение недели, после чего вычленяют со стороны среза вторичный эксплант в виде отрезка гипокотиля размером 2 - 3 мм, высаживают его на питательную среду, содержащую бактериостатический компонент без регуляторов роста. 1 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биологии и может быть использовано в физиологии, генетике и селекции растений, в частности для генетической трансформации растений.

Известен способ регенерации растений in vitro, включающий индукцию каллусной ткани из экспланта на питательной среде, содержащей регуляторы роста с последующей регенерацией из каллуса растений.

Недостатком данного способа являются трудоемкость и длительность процесса регенерации растений, а также необходимость добавления в среду определяемых регуляторов роста, концентрации которых подбираются в основном эмпирически. Кроме того, использование синтетических регуляторов роста в ряде случаев может искажать результаты эксперимента.

Цель изобретения упрощение, ускорение процесса регенерации растений и исключение из состава питательных сред регуляторов роста.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу в качестве эксплантов используется верхняя часть проростка, разрезанного в середине гипокотиля, и активно синтезирующая эндогенные регуляторы роста, которые перераспределяются в проростке в результате нарушения нормального транспорта и могут накапливаться в месте среза. Экспланты кокультивируют с суспензией нопалинового штамма Argobacterium tumefaciens на агаризованной безгормональной среде В5 Гамборга в течение 5 7 дней таким образом, чтобы срез проростка был направлен вверх. После кокультивирования от проростка отделяли отрезок гипокотиля размером 2 3 мм вместе со срезом и помещали на безгормональнуую среду, содержащую бактериостатический компонент, для подавления развития агробактерий. На данной среде происходит регенерация из гипокотиля побегов. Побеги доращивают и укореняют на безгормональной среде, содержащей бактериостатический компонент.

Пример. Регенерация растений путем прямого органогенеза in vitro у дикого вида люцерны (Medicago meyeri).

Семена люцерны стерилизовали 30 минут в растворе пантоцида и проращивали на агаризованной питательной среде В5 Гамборга без регуляторов роста. Девятидневные проростки разрезали в середине гипокотиля, окунали верхнюю часть проростка в разбавленную в 1000 раз ночную культуру штамма C58 Agrobacterium tumefaciens, и помещали на безгормональную среду В5 Гамборга таким образом, чтобы верхушки проростка были помещены в среду, а срез гипокотиля был направлен вверх. После семидневного кокультивирования от проростка отделяли отрезок гипокотиля размером 2 3 мм со срезом и помещали этот отрезок на питательную среду, содержащую 500 мг/л цефотаксима. Через 15 22 дней до 60% эксплантатов образовывали множественные побеги. Побеги разделяли и помещали на безгормональную среду, содержащую 150 200 мг/л цефотаксима, для доращивания и укоренения.

Предложенный способ значительно удешевляет процесс получения регенерантов, так как не требует использования экзогенных регуляторов роста, составляющих до 60% стоимости среды для культивирования. Кроме того, способ значительно ускоряет получение регенерантов, так как отсутствует целая стадия каллусогенеза (таблица). Количество дней, необходимых для регенерации растений люцерны по двум различным способам, приведено в таблице.

Формула изобретения

Способ регенерации растений люцерны in vitro, включающий вычленение экспланта, посадку его на питательную среду и культивирование до получения регенерантов, отличающийся тем, что выделяют первичный эксплант, в качестве которого используют верхнюю часть проростка, разрезанного в середине гипокотиля, обрабатывают его суспензией Agrobacteriim tumefaciens и высаживают на питательную среду срезом вверх, кокультивируют с агробактерией в течение недели, после чего вычленяют со стороны среза вторичный эксплант в виде отрезка гипокотиля размером 2 3 мм, высаживают его на питательную среду, не содержащую регуляторов роста и содержащую бактериостатический компонент.

РИСУНКИ

Рисунок 1