Производные трипептидов в виде r- или rs-формы или их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли, фармацевтическая композиция

 

Использование: в медицине и биохимии. Сущность изобретения: производные трипептидов в виде R или RS формы общей формулы: А-Pro-Arg-альдегид; A=RR, BC-, R-фенил, замещенный или незамещенный, тиенил, нафтил, замещенный или незамещенный, циклогексил, R₁-водород, низший алкил, β-низший алкил, низший алкокси, или N(R₂)(R₃), в которой R₂ и R₃ независимо:водород или низший алкил: или R₂-водород, а R₃-ацетил или N-Вос (низший) алкил; А-бицеклическая группа; 1, 2, 3, 4 - тетрагидроизохинолин-1- (или 3-) - ил-карбонил, Д-пергидроизохинолин-1-ил-карбонил или их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли, обладающие способностью ингибировать тромбин. Реагент 1: AProOH. Реагент II:C - защищенный аргининлактам в виде трифторацетата. Процесс ведут в ДМФ при температуре - 15 град. в присутствии N - метилморфолина в течение 4 часов, затем в течение примерно суток медленно нагревают до комнатной температуры, полученный лактам восстанавливают метилалюминий гидридом. 2 с. и 12 з.п. ф-лы,., 4 табл.

Настоящее изобретение относится к ингибиторам тромбина, полезным в качестве антикоагулянтов для человека и животных. В частности, изобретение относится к производным дипептида, а именно: L-пролин-L-аргининового альдегида, обладающим высокой противотромбозной активностью.

Ингибирование тромбина в настоящее время достигается введением гепаринов и кумаринов. Механизм действия указанных средств подвергался усиленному изучению. Гепарины могут вводиться исключительно перентерально, и их дозировки должны тщательно контролироваться. Действие кумаринов основано на блокировании или ингибирования образования протромбина, при этом необходимо некоторое время для достижения максимальной эффективности.

Хотя как гепарины, так и кумарины являются эффективными антикоагулянтами, тем не менее существует необходимость в антитромбиновых средствах быстрого действия с целью предотвращения образования сгустков крови, и не препятствующих действию плазмина по растворению существующих сгустков.

Ингибирующие тромбин соединения, даваемые настоящим изобретением, представлены нижеследующей формулой 1: (1) где А представляет 1 группу формулы: в которой R-фенил формулы: где а и а' независимо представляет водород, низший алкил, низшую алкоксигруппу, галоген, трифторметил, гидроксил; или R представляет тиенил; нафтил, незамещенный или моно- или дизамещенный низшей алкоксигруппой, циклогексил; R₁ представляет водород, метил или этил; В представляет низший алкил, низшую алкоксигруппу или аминогруппу формулы:
-N(R₂)(R₃),
в которой R₂ и R₃ независимо представляют водород или низший алкил, или же R₂-водород, а R₃-ацетил, N-Boc (низший) алкил, при условии, что когда R₁-метил или этил, тогда В отличен от метила или этила, или А представляет бициклическую группу формулы:

где Q -CH₂-CH₂-, , если Q
Y представляет одноуглеродный радикал -CH₂-;
R₅ представляет водород или трет-бутоксикарбонил;
R₆ представляет водород; и обозначенный пунктиром круг в пределах 6-членного цикла бициклической группы указывает на пергидро-цикл;
и их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли.

Пептиды формулы 1 применимы в качестве противотромбозных средств и могут быть использованы в виде вспомогательных средств при лечении тканей активатором плазминогена (АПт), стрептокиназой или урокиназой.

Эти соединения получают обычными способами. Например, Вос-D-Phg соединяют с эфиром L-пролина с образованием сложного эфира Вос-D-Phg-Pro. Сложноэфирную группу удаляют и Boc-D-Phg-Prg соединяют с лактамной формулой L-аргинина с получением лактама Boc-D-Phg-Pro-Arp в аминозащищенной форме. Лактамный цикл аргинина раскрывают восстановлением и после удаления аминозащитной группы в аргинине получают Boc-DPhg-Pro-Arg-альдегид. Полученные пептиды превращают в приемлемые солевые формы, такие как ацетаты и сульфаты.

Изобретением также дается способ предотвращения у человека и животных сгустков крови и фармацевтические составы, применимые в таком способе.

Соединения формулы 1 являются трипептидами, когда А представляют аминокислотный остаток, такой как фенилглицил (Phg), а когда А отличен от аминокислотного остатка, т. е. когда В представляет группу, отличную от аминогруппы или алкиламиногруппы, в этом случае соединения являются N-ацильными производными дипептида-пролин-аргинин-альдегида (Pro-Arg-H). Как показано формулой 1, асимметрический центр фрагмента: А(С=О) имеет R- или RS-конфигурацию, в то время как фрагментов пролина и аргинин-альдегида-L-конфигурацию.

Термины, применяемые при определении формулы 1, имеют следующие значения.

"Низший алкил" относится к С₁-C₄-алкилу нормального или изо-строения, такому как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил и т.п.

"Низшая алоксигруппа" относится к C₁-C₄-алкоксигруппе, такой как метокси-, этокси-, н-пропокси-, изопропокси-, н-бутокси-, трет-бутоксигруппе и т. п.

"Галоген" относится к фтору, хлору, брому или йоду.

"Моно- или ди(низший алкил) аминогруппа" относится к таким группам, как метиламино-, этиламино-, диметиламино-, метилэтиламино-, диэтиламино-, н-бутиламино-, н-пропиламино-группа и т.п.

Термин "C₁-C₆-алкил" относится к алкиду нормального или изо-строения, такому как C₁-C₄-алкил, определенный выше, и кроме того: н-пентил, изопентил, н-гексил, изомерные гексильные группы и т.п. "C₂-C₆-алкенил относится к ненасыщенным группам, таким как винил, аллил, бутенил, изомерные пентенильные и гексенильные группы, "C₃-C₇-циклоалкил" относится к циклическим углеводородам с 3-7 атомами углерода в цикле, таким как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Согласно определению формулы 1, когда А представляет группу (R)(R₁(B)C-, тогда R может быть фенилом, который может быть моно- или дизамещен. Примеры таких фенилов включают: фенил (а и а' Н), 4-метилфенил, 3-этилфенил, 4-метоксифенил, 3-метоксифенил, 3-этоксифенил, 2-метоксифенил, 3-изопропоксифенил, 4-гидроксифенил, 4-хлорфенид, 3-хлорфенил, 2-фторфенил, 3-фторфенил, 3-бромфенил, 4-фторфенил, 3-трифторметилфенил, 4-гидроксиметилфенил, 2-гидроксиметилфенил, 3-ваминофенил, 4-аминофенил, 3-амино-4-хлорфенил, 3,4-дихлоpфенил, 3-гидрокси-4-фторфенил, 3-гидрокси-4-метилфенил, 3-метокси-4-гидроксифенил, 3-хлор-4-этоксифенил и аналогичные моно- или дизамещенные фенильные группы.

Примеры R групп, когда R представляет нафтил или моно- или дизамещенный нафтил, включают: 1-нафтил, 2-нафтил, 6-метокси-2-нафтил, 8-гидрокси-1-нафтил, 8-амино-2-нафтил, 4-метил-1-нафтил, 6-хлор-2-нафтил, 4-гидрокси-6-этокси-2-нафтил, 8-метиламино-4-хлор-2-нафтил, 6,8-диметокси-2-нафтил, 6-этил-1-нафтил, 4-гидрокси-1-нафтил, 3-метокси-1-нафтил и аналогичные нафтильные группы.

Примеры группы, представленных в формуле 1, когда В аминогруппа формулы: -N(R₂)(R₃), включают: амино- (R₂ R₃ H), метиламино-, этиламино-, изопропиламино-, диметиламино-группу и аналогичные аминогруппы; и когда R₂ водород, а R₃ оксикарбонил формулы: R₄-O-C(O)-, тогда примеры таких групп включают: C₁-C₆-алкоксикарбониламиногруппы, такие как метоксикарбониламино-, этоксиикарбониламино-, трет-бутоксикарбониламино-, изоамилоксикарбониламиногруппа и т. п. C₂-C₆-алкенилоксикарбониламиногруппы, такие как винилоксикарбониламино-, аллилоксикарбониламино-, 2-бутенилоксикарбониламиногруппа и т. п. C₃-C₇-циклоалкосикарбониламиногруппы, такие как циклопропилоксикарбониламино-, циклопентилоксикарбониламино-, циклогексилоксикарбониламиногруппа и т.п. Оксикарбониламиногруппы, представленные символом В, кроме того, включают, например: бензилоксикарбониламино-, 4-нитробензилоксикарбониламино-, дифенилметоксикарбониламино-, фенилоксикарбониламиногруппу или замещенную фенилоксикарбониламиногруппу, в которой замещенный фенильный фрагмент принимает вышеприведенные значения, и т.п.

Примеры групп А(С=О) из формулы 1, когда А представляет радикал группы 1 формулы: (R)(P₁)(B)C-, включают: фенилглицил, 3-метоксифенилглицил, 4-метоксифенилглицил, 4-хлорфенилглицил, 3,4-дихлорфенилглицил, 3-трифторметилфенилглицил, N-(третбутилоксикарбонил)фенилглицил, N-(трет-бутилоксикарбонил-11-метил)фенилглицил, α-метилфенилацетил, a-этилфенилацетил, a-метоксифенилацетил, a-изопропоксифенилацетил, 1-нафтилглицил, 2-нафтилглицил, N-(трет-бутоксикарбонил)-2-нафтилглицил, 2-тиенилглицил, 3-тиенилглицил, N-(циклопентилоксикарбонил)-2-тиенилглицил, 2-фурилглицил, N-этил-2-фурил-глицил, манделоил, 4-хлорманделоил, 3-метоксиманделоил, a-гидрокси-a-(2-нафтил)ацетил, a-гидрокси-a-(2-тиенил)ацетил, 1,4-циклогексадиенилглицил, 1-циклогексенилглицил, N-(трет-бутилоксикарбонил)-1,4-циклогексадиенилглицил, циклогексилглицил и аналогичные А(СО) группы.

Пептидные производные, представленные формулой 1, где А-ахиральный 1-аминоциклопентил или 1-аминоциклогексил, отраженные нижеследующей структурной формулой:

где р представляет углерод-углеродную связь или -СH₂-; R₂ и R₃ принимают вышеуказанные значения. Примеры подобных трипептидов включают: N-(1-аминоциклогексаноил)-Pro-Arg-H, N-(1-аминоциклопентаноил)-Pro-Arg-H; N-(1-метиламиноциклогексаноил)-Pro-Arg-H, N-(1-трет-бутилоксикарбониламиноциклогесаноил)-Pro-Arg-H и т.п.

Примеры пептидов, представленных формулой 1, где А бициклическая группа вышеприведенной формулы 2, включают D 1,2,3,4-тетраизохинолин-1-илкарбонил- и D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-илкарбонил-11-ацильные производные Pro-Arg-H, отраженные ниже:
(A)
(B)
дигидроизоиндол-1-илкарбонильные производные, отраженные нижеприведенной формулой:
(C)
оксо-производные, представленные формулами:
(D)
(E)
и их пергидрированные производные. Символы R₆ и R₅ принимают вышеуказанные значения. R₅ предпочтительно-водород и предпочтительно-водород, метоксигруппа, этоксигруппа, хлор или метил.

Фармацевтически приемлемые соли пептидов изобретения включают соли с кислотами, образованные добавлением неорганических и карбоновых кислот. Примеры образующих соли неорганических кислот включают галоидводордные кислоты, такие как хлористоводороная кислота и бромистоводородная кислота; фосфорную кислоту и серную кислоту. Соли с карбоновыми кислотами образованы с такими кислотами, как уксусная, пропионовая, малоновая, малеиновая, лимонная, янтарная, яблочная, бензойная, фумаровая и аналогичными карбоновыми кислотами. Соли с кислотами получают обычным путем, например, нейтрализации соединения I в виде свободного основания кислотой. Рекомендуемые соли с кислотами включают сульфаты и гидрохлориды.

Рекомендуемые воплощения изобретения включают соединения формулы I, где А представляют группу формулы:

в которой R представляют фенил:

или нафтил, или замещенный нафтил, R₁-водород и В-аминогруппа формулы: -N(R₂)(R₃). Дополнительные рекомендуемые соединения представлены вариантом, в котором R₂-водород и R₃-оксикарбонил формулы: R₄O-C(O)-
Еще одно рекомендуемое воплощение изобретения включает соединения формулы I, где А бициклическая группа формулы (2). Рекомендуемые соединения такого воплощения представлены формулой I, где А(С=О) - 1,2,3,4,-тетрагидроизохинолин-1-илкарбонил (формула 2, Q -СH₂-CH₂-, Y -CH- и R₅ R₆ и 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-илкарбонил (формула 2,

Соединения формулы 1 получают известными способами соединения пептидов. Согласно одному из таких способов кислоту А-СООН, где А принимает значения, указанные для формулы 1, соединяют с защищенным по карбоксилу пролином с образованием дипептида (если А аминокислота) или сложного эфира N-ацилпролина (если А отличен от аминокислоты). Карбоксилзащитную сложноэфирную группу пролинового фрагмента в полученном продукте удаляют и дипептид в виде свободной кислоты соединяют с лактамной формой аргинина. Вышеприведенная реакционная последовательность иллюстрируется нижеследующей схемой:

где Р представляет аминозащитную группу.

Полученный присоединением Arg(P)-лактамный продукт (с) восстанавливают литийалюминийгидридом в инертном растворителе с раскрытием лактамного цикла и образованием трипептида в аргинин-альдегидной форме, представленного формулой:
A(C=O)-PRo-Arg(P)-H,
где Arg(P)-H представляет аминозащищенный аргинин-альдегид.

Лактамную форму аргинина получают внутримолекулярной реакцией аминозащищенного аргинина (Arg-OH). К примеру. Boc-Arg(CbZ)O, представленной формулой:

вначале превращают в активную сложноэфирную форму, такую как активный смешанный ангидрид в реакции с хлорформатом, например, от этилхлорформата до изобутилхлорформата. Образование сложного эфира проводят в присутствии третичного амина, такого как 11-метил-формалин. Добавление более сильного третичного амина, такого как триэтиламин приводит к внутримолекулярному ацилированию с образованием лактамной формы диаминозащищенного аргинина нижеприведенной формулы:

Перед использованием в реакции соединения с А(С=О)-Pro-OH согласно вышеприведенной схеме защитную Вос-группу селективно удаляют действием трифторуксусной кислоты с образованием необходимой свободной аминогруппы.

Присоединение соединения АСООН к сложному эфиру пролина, когда А - аминокислотный остаток, осуществляют первоначальной защитой аминогруппы аминокислоты. Используют обычные аминозащитные группы, часто применяемые для временной защиты или блокировки аминогруппы. Примеры подобных защитных групп включают: алкокси-, алкенилокси-, циклоалокси- и арилоксикарбонилдьные группы, такие как: этоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, трихлорэтоксикарбонил, бензилоксикарбонил, дифенилметоксикарбонил и аналогичные группы. Сложноэфирной группой, используемой для защиты карбоксила пролина в ходе реакции присоединения, может служить любая из обычно применяемых легко удаляемых сложно-эфирных групп, таких как: трет-бутил, бензил, п-нитробензил, п-метоксибензил, дифенилметил, трихлорэтил, фенацил или триалкилсилил, образующие сложный эфир. При проведении реакции присоединения для пролина используют сложноэфирную группу, которая может быть удалена в условиях, при которых аминозащитная группа остается нетронутой. Аминозащитная группа ацилирующей кислоты (АСООР) в результате остается в месте защиты аминогруппы в ходе последующего соединения с аргинин-лактамными производным и образования соединения с.

Соединения формулы 1, где А-группа (R)(R₁(B)C и В аминогруппа -N(R₂(R₃), где R₂ водород и R₃ низший алкил, получают на основе соответствующего соединения, в котором В аминогруппа, известными способами алкилирования. Например, N-метил-D-фенилглицил-L-пропил-L-аргинин-альдегид получают восстановительным алкилированием следующим образом. CbZ защищенный D-фенилглицин соединяют в ДМФА с трет-бутиловым эфиром L-пролина в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и гидроксибензотриазолла (ГОБт) с образованием дипептида: трет-бутилового эфира CbZ-D-фенилглицил-L-пролина. Полученный пептид гидрируют в этиловом спирте над палладием на угле с удалением защитной CbZ-группы, к продукту восстановления добавляют формальдегид и гидрирование продолжает с образованием трет-бутилового эфира N-метил-D-фенилглицил-L-пролина. N-метильную вторичную аминогруппу фенилглицильного фрагмента защищают CbZ-группой в реакции трет-бутилового эфира дипептида с бензилхлорформатом в ТГФ, содержащим N-метилморфолин, и образованием N-CbZ-N-метил-D-фенилглицил-L-пролин-трет-бутилового эфира. Сложноэфирную трет-бутильную группу удаляют при комнатной температуре в трифторуксусной кислоте, содержащей анизол, и получают N-CbZ-N-метил-D-фенилглицил-L-пролин. Полученный дипептид затем соединяют с CbZ-защищенный Arg-лактамом, после чего лактамный цикл раскрывают восстановлением с образованием Arg-альдегида по вышеприведенной методике. Обе CbZ-защитные группы трипептида удаляют гидрированием над Pd-C в качестве катализатора с получением N-метил-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинин-альдегида.

Соединения формулы 1, где А группу (R)(R₁)(B)C-, в которой R - циклогексадиенил или циклогексенил и В алкиламиногруппа формулы: -N(R₂)(R₃), могут быть синтезированы восстановлением амина, образованного в реакции с низшим алкиловым альдегидом, цианборгидридом натрия. Аналогично подобное N-алкилирование может быть осуществлено с помощью алкилйодида и гидрида натрия.

Соединения формулы 1, где А бициклическая группа формулы 2, получают теми же самыми вышеприведенными способами присоединения. Например, пептид формулы 1, где А представляет 1, 2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-ил, получают ацилированием сложного эфира пролина, такого как бензиловый эфир активным производным 1,2,3,4-тетрагидро-1-карбоксиизохинолина. Активные производные, которые можно при этом использовать, включают галоидангидриды кислоты, такие как хлорангидрид или бромангидрид, азид кислоты, а также активные сложные эфиры и ангидриды, типа тех, которые образуют вышеприведенным способом в реакции с хлорформатами. В ходе ацилирующего присоединения азот цикла в тетрагидроизохинолине (формула 2, R₅ H) защищают или алкилируют. Например, для ацилирования сложного эфира пролина применяют такой активный эфир, как N-Boc-1,2,3,4-тетрагидро-1-карбоксиизохинолин, образованный реакцией с изобутилхлороформатом. В полученном в качестве продукта пептиде-N-Вос-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-илкарбонил-пролин-слойный эфир удаляют эфирную группу, свободную кислоту превращают в активный эфир и последний присоединяют к лактамной форме аргинина. Полученную в качестве продукта лактам затем превращают вышеприведенным способом в альдегидную форму и получают соединение формулы 1, а именно: Вос-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-илкарбонил-Pro-Arg-H.

Пергидрированную бициклическую группу, представленную формулой 2, получают гидрированием обычным способом либо частично восстановленных, либо ненасыщенных кислот. К примеру, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-карбоновую кислоту гидрируют над оксидом платины в таком растворителе, как этанол или уксусная кислота, и получают пергидро(декагидро)изохинолин-1-карбоновую кислоту. Затем пергидрокислоту используют вышеприведенным способом для ацилирования сложного эфира пролина. Примеры подобных пергидропроизводных формулы 1 включают: N-(D-декагидроизохинолин-1-оил)-L-пропил-L-аргининальдегид и N-(D-декагидроизохинолин-3-оил)-L-пролил-L-аргинин-альдегид.

Вышеописанные реакции присоединения проводят на холоду, предпочтительно в температурном интервале от примерно -20^oC до примерно 15^oС. Реакции присоединения осуществляют в инертном органическом растворителе, таком как диметилформамид, тетрагидрофуран, хлористый метилен, хлороформ и аналогичные обычные растворители. При использовании в реакции присоединения активного эфира ацилирующей кислоты такую реакцию обычно проводят в безводных условиях.

Соединения изобретения лучше всего выделяют в виде солей с кислотами. Соли соединений формулы 1, образованные с кислотами типа, упомянутых выше, применимы в качестве фармацевтически приемлемых солей для введения противотромбоцитных средств и для приготовления составов таких средств. Для выделения и очистки пептидов могут быть использованы и другие соли с кислотами. Например, могут быть использованы соли, образованные с сульфокислотами, такими как метансульфоновая кислота, н-бутансульфоновая кислота, п-толуолсульфокислота и нафталинсульфокислота.

Рекомендуемым способом выделения и очистки соединений формулы 1 с одновременным получением целевой стабильной солевой формы является способ, согласно которому стабильные соли неорганических кислот, такие как сульфат и гидрохлорид, получают препаративной очисткой с помощью хроматографии над C₁₈ обращенной фазой. При этом водная фаза включает серную кислоту или хлористоводородную кислоту в концентрации 0,01-0,05% ацетонитрил, ТГФ, метанол или другой приемлемый растворитель служит органическим компонентом. Значение рН кислотного элюента выдерживают в интервале значений рН 4-6, при этом точное значение рН зависит от конкретного пептида и применяемой основной смолы, например, БиО-Рад-AG-1Х8 смолы в гидроксильной форме. После установления pH раствор соли трипептида, например, сульфат или гидрохлорид лиофилизуют с получением очищенной соли в виде сухого порошка. В примере такого способа сырой сульфат D-Phg-L-Pro-L-Arg-H, загрязненный примесью эпимерного сульфата D-Arg-H, растворяют в примерно 0,01%-ной серной кислоте и раствор переносят в колонку для ВЭЖХ с обращением фаз Втдак С₁₈. Для элюирования колонки в течение 10 часов используют градиент 2-10% ацетонитрила в 0,01%-ной H₂O₄. Отбирают ряд фракций и содержащие целевой продукт фракции (согласно аналитической ОФ-ВЭЖХ) объединяют. Значение рН в объединенных фракциях устанавливают в пределах 4-4,5 добавлением смолы Био-Рад AG-1Х8 в гидроксильной форме. После фильтроввания раствор лиофилизуют и получают чистый сульфат D-Phg-L-Pro-L-Arg-H.

Соединения изобретения формулы 1 ингибируют действие тромбина у человека и животных. Ингибирование тромбина показано in vitro ингибирования амидазной активности тромбина. В нижеследующей таблице 1 приведены кажущиеся константы равновесия (К_k для взаимодействия между испытуемым соединением (ингибитор) и тромбином. Приведенные в таблице данные получены в испытании, в котором тромбин гидролизует хромогенный субстрат-N-бензоил-D-фенилаланил-L-валил-L-аргинил-п-нитроанилид.

Испытание проводят в 50 мкл буфера (0,03 М трис, 0,15 М NaCl, рН 7,4) с 25 мкл раствора тромбина 0,21 мг/мл порошка тромбостата в 0,06 М Трис, 0,3 М NaCl, рН 7,4) и 150 мкл водного раствора хромогенного субстрата в концентрации 0,25 мг/мл. Добавляют растворы испытуемого соединения (25 мкл) в различных концентрациях. Степень гидролиза субстрата определяют анализом реакционной смеси при 405 нм на выделения п-нитроанилина. Строят стандартные кривые отложением концентрации свободного тромбина относительно степени гидролиза. Использованием стандартных кривых степени гидролиза, наблюдаемые в присутствии испытуемых соединений, затем переводят в значения "свободного тромбина" в соответствующих испытаниях. Связанный тромбин (связан с испытуемым соединением) подсчитывают вычитанием количества свободного тромбина, наблюдаемого в каждом испытании, из известного начального количества тромбина, применяемого в испытании. Количество свободного ингибитора подсчитывают в каждом испытании вычитанием числа молей связанного тромбина из числа молей добавляемого ингибитора (испытуемое соединение).

Значения К_k являются гипотетическими константами равновесия реакции между тромбином и испытуемым соединением (И).

Тромбин + И ⇄ Тромбин-И

Значение K_k рассчитывают для интервала концентраций испытуемых соединений и средние величины приводят в единицах литр на моль.

Антикоагулянтная активность соединений изобретения определена в стандартных испытаниях. В нижеследующей таблице 2 представлены данные, полученные для представительных соединений изобретения в испытаниях, использованных для определения времени протромбинового времени, тромбинового времени и времени активированного частичного тромбопластина (ВАЧТ). Цифровые значения в таблице относятся к концентрациям испытуемых соединений (нг/мл), необходимым для пролонгирования коагуляции в 2 раза в трех испытаниях. Выявление тромбинового времени осуществлено в плазме и отдельно определено в буферной системе при рН 7,5.

Представленные в таблице 2 данные получены с помощью прибора КоаСкинер фирмы Текан Инк. в испытаниях, осуществленных по нижеследующей методике.

Промтромбированное время: 50 мкл плазмы. 50 мкл солевого раствора, 7 мкл испытуемого раствора, 50 мкл тромбопластина (Дейд).

Тромбиновое время: 50 мкл плазмы, 50 мкл солевого раствора, 7 мкл испытуемого раствора, 50 мкл бычьего тромбина (2 ед. NI H/мл).

При определении тромбинового времени в буфере с рН 7,4 вместо плазмы используют фибриноген.

ВАЧТ: 50 мкл плазмы, 50 мкл Актина (Дейд), 7 мкл испытуемого раствора, 50 мкл CaCl₂ (0,01 М).

Антитромботическая активность представительных соединений изобретения определялась в испытаниях in vivo, проводимых на крысах. В испытаниях используют созданный искусственно тромбоз в сонной артерии крыс, при этом замеряют вливаемую дозу испытуемого соединения, необходимую для поддержания потока крови в течение пятидесяти минут после времени закупорки. Испытание проводят следующим образом.

У крыс искусственно создают тромбоз повреждением сонной артерии. Для повреждения сосуда используют нанесение местно раствора хлорида железа (III). Самцов крыс линии Спраг-Доли (375-450 г) анестезируют ксилазином (20 мг/кг, подкожно) и затем кетамин. HCl (100 мг/кг, п.к.). Животных помещают на водяное одеяло, в котором циркулирует вода с температурой 37^oC. Доступ к сонной артерии получают через середину цервикального разреза. Для обнаружения сосуда и отделения его от оболочки используют аккуратное отслаивание. Под артерией натягивают шелковую нить, поднимающую сосуд и создающую просвет для введения под сосудом термопары. Изменения температуры сосуда регистрируют на самописце с ленточной диаграммой, снабженным пишущими чернилами таймером. Небольшим пинцетом с раствором (35%) погружают дискит (диам. 3 мм) из ватмановской фильтровальной бумаги N 1. Диски вырезают одинаковыми по размеру с помощью заостренной трубочки (3 мм в д.) из нержавеющей стали, зажатой в патрон сверлильного пресса. Пропитанные диски накладывают на каждую сонную артерию выше термопары. Время между наложением FeCl₃ и временем резкого снижения температуры отмечают, как время закупорки сосуда (ВЗС). Среднее время, необходимое для закупорки обоих сосудов, используют для представления ВЗС для каждого зверька.

Испытуемые соединения растворяют в изотоническом солевом растворе. Для вливания растворов лекарства используют шприц-насос, и растворы начинают вливать за 15 минут до наложения FeCl₃ и продолжают вливать 60 минут после наложения HCl₃. Для определения связи между log₁₀ вливаемых дозировок и ВЗС поврежденных артерий строят кривые реакции на вводимые дозы. На основе кривых определяют сравнительный показатель антитромботической активности путем подсчета вливаемой дозы, необходимой для поддержания кровяного потока в течение 50 мин (ЭД 50 мин).

Связь между закупоркой сосуда и резким понижением температуры выявляют одновременной записью температуры и кровяного потока на одном самописце. Проксимально к термопаре вблизи к сонной артерии помещают пульсационный зонд потока Допплера. Зондом замеряют изменения в скорости потока, вследствие чего зонд устанавливают в момент отсутствия тромбоза, и когда внутренний диаметр сосуда остается постоянным в результате растяжения кровяным потоком. Нулевую линию для температуры и скорости потока (определяют пульсационным по направлению измерителем потока Допплера, модели 545-С, Университет штата Айова, Биоэнджениринг) устанавливают перед нанесением 35%-ного раствора хлорида железа (III). Результаты регистрируют в виде процента отклонения от начальной нулевой линии (6 мин до закупорки). Время, с которого температура сосуда быстро понижается, произвольно устанавливают, как нулевое, и температуру и значения скорости потока до и после закупорки сравнивают с этим моментом.

В нижеследующей таблице 3 содержатся результаты, полученные для испытуемых соединений в вышеописанном испытании с химически вызванным тромбозом у крыс.

Соединения изобретения ингибируют образование сгустков крови без заметного влияния на естественную способность организма лизировать кровяные сгустки, например, соединения оказывают низкое ингибирующее действие на фибринолизис.

Изобретением в одном из его аспектов дается способ ингибирования образования сгустков крови у человека и животных, заключающийся в ведении человеку или животному ингибирующей нетоксичной дозы соединения формулы 1. Антикоагулянтное соединение вводят перорально, парентерально, например: внутривенным вливаниеми (в.в.), внутримышечной инъекцией (в.м.) или подкожно (п.к. ). Рекомендуется введение осуществлять в.в. вливанием.

Эффективная, ингибирующая образование кровяных сгустков доза находится в интервале 5-1000 мг. Режим введения дозы может меняться, например, в профилактических целях может быть использована ежедневная разовая доза или же может оказаться приемлемым назначение в виде нескольких доз, например, 3 или 5 раз в день. В случае критических ситуаций соединение изобретение вводят в.в. вливанием со скоростью примерно между 1 мг/кг/ч и 50 мг/кг/ч, предпочтительно примерно 2,5-25 мг/кг/ч.

Способ настоящего изобретения также практикуют в сочетании с агентом лизирования кровяных сгустков, например, активатором плазминогена тканей (АПт), модифицированным АПт, стрептокиназой или урокиназой. В случаях, когда произошло образование сгустков и артерия или вена оказались блокированными частично или полностью, обычно используют агент лизирования кровяного сгустка. Соединение изобретения может быть введено одновременно с визирующим средством или после его использования для предотвращения повторного образования кровяного сгустка.

При осуществлении способа изобретения желательно использовать рекомендуемые изобретением соединения. К примеру, используют предпочтительные соединения описанного выше типа. К предпочтительным пептидам относятся: N-Boc-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинил-альдегид и N-метил-D-фенилглицил-L-пропил-L-аргинин-альдегид, которые находятся в виде соли, например, в виде сульфата или гидрохлорида. Особенно предпочтительным для использования этим способом является сульфат N-(D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-оил)-2-пролил-2-аргинин-альдегида.

Изобретение предоставляет также фармацевтические препаративные формулы для использования в описанном выше терапевтическом способе. Фармацевтические препаративные формы изобретения включают эффективное, ингибирующее образование сгустка крови количество соединения формулы 1 и фармацевтически приемлемый носитель. Для орального введения противотромбическое соединение приготавливают в виде желатиновых капсул или таблеток, которые могут содержать различные наполнители, такие как связующие средства, смазочные агенты, структурирующие агенты и т.п. Для парентерального использования противотромботическое средство вводят в фармацевтически приемлемый разбавитель, например, физиологический солевой раствор (0,9%), 5%-ную декстрозу, раствор Ринджера и т.п.

Противотромботическое соединение изобретения может преобразовываться в единичную дозирование формы, содержащие дозу примерно между 1 мг и 1000 мг предпочтительно соединение находятся в виде фармацевтически приемлемой соли, такой как, например сульфат, ацетат или фосфат. Например, единичный дозированный препарат содержит 5 мг сульфата N-Вос-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинин-альдегида в 10 мл стерильной стеклянной ампуле. Другой пример единичной дозированной формы содержит 10 мг сульфата N-метил-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинин-альдегида в 20 мл изотонического солевого раствора, заключенного в стерильную ампулу.

Предпочтительная препаративная форма представляет собой единичную дозировочную форму, содержащую 5-50 мг сульфата N-(D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-L-оил)-L-пролил-L-аргинин-альдегида в стерильных ампулах.

Соединения могут вводиться различными путями, включая оральный, ректальный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, носовой. Соединения настоящего изобретения предпочтительно перед назначением для приема преобразуются в препаративные формы, включающие эффективное количество соединения формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли, или сольвата в сочетании с фармацевтическими приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

Активный ингредиент в таких препаративных формах составляет от 0,1% до 99,9% весовых от формы. "Фармацевтически приемлемый" означает, что носитель, разбавитель или эксципиент должен быть совместимыми с другими ингредиентами препаративной формы и не причинять вреда реципиенту.

Настоящие препаративные формы получают по известным методикам с использованием известных или легко доступных ингредиентов. Композиции данного изобретения могут формулироваться так, чтобы обеспечивать быстрое, поддерживаемое на одном уровне или замедленное высвобождение активного ингредиента после введения пациенту, с использованием известных методик. При получении композиции или составов настоящего изобретения активный ингредиент обычно смешивают с носителем или разбавляют носителем или заключают внутрь носителя, который может быть в форме капсул, пастилок, бумажных или других контейнеров. Когда носитель служит как разбавитель, он может быть твердым, полу-твердым или жидким материалом, который действует как связующее вещество, эксципиент или среда для активного ингредиента. Так, составы могут быть в форме таблеток, пилюль, порошков, лепешек, пастилок, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердых веществ или в жидкой среде), мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиторий, стерильных растворов для инъекций, стерильных упакованных порошков и т.д.

Ниже приводятся примеры препаративных форм, которые иллюстрируют, но не ограничивают объем изобретения. "Активный ингредиент", конечно, означает соединение формулы 1 или его фармацевтически приемлемую соль, или сольват.

Препаративная форма 1
Твердые желатиновые капсулы готовят с использованием следующих ингредиентов (количество, мг/капсула)
Активный ингредиент 250
Крахмал, высушенный 200
Стеарат магния 10
Общий вес 460 мг
Препаративная форма 2
Таблетки готовят с использованием следующих ингредиентов (количество, мг/таблетку):
Активный ингредиент 250
Микрокристаллическая целлюлоза 400
Двуокись кремния 10
Стеариновая кислота 5
Общий вес 665 мг
Компоненты смешивают и прессуют с образованием таблеток каждая весом 665 мг.

Предварительная форма 3
Аэрозольный раствор готовят с использованием следующих компонентов (вес):
Активный ингредиент 0,25
Этанол 25,75
Распыляющее вещество, препеллент 22 (хлордифторметан) 70,00
Общий вес 100,00
Активное вещество смешивают с этанолом, и смесь добавляют к части пропеллента 22, охлажденного до -30^oC, и переносят в наполняющее устройство. Требуемое количество затем подают в контейнер из нержавеющей стали и разбавляют оставшимся пропеллентом. Затем устанавливают на контейнере вентиль.

Препаративная форма 4
Таблетки, каждая из которых содержит 60 мг активного ингредиента, изготавливают следующим образом:
Активный ингредиент 60 мг
Крахмал 45 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 35 мг
Поливинилпиролидон (в виде 10% раствора в воде) 4 мг
Карбоксиметилкрахмал натрия 4,5 мг
Стеарат магния 0,5 мг
Тальк 1,0 мг
Общее количество 150,00 мг
Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито с отверстиями N 45 мет США и тщательно перемешивают. Водный раствор, содержащий поливинилпирролидон, смешивают с получающимся в результате порошком и смесь пропускают через сито с отверстиями 14 мет США. Гранулы, полученные таким образом, сушат при 50^oC и пропускают через сито N 18 США. Карбоксиметилкрахмал натрия, стеарат магния и тальк, предварительно пропущенные через сито с отверстиями N 60 США, затем добавляют к гранулам, которые после перемешивания прессуют в таблетки и получают таблетки, каждая из которых весит 150 мг.

Препаративная форма 5.

Капсулы, каждая из которых содержит 80 мг активного ингредиента, приготавливают следующим образом:
Активный ингредиент 80 мг
Крахмал 59 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 59 мг
Стеарат магния 2 мг
Общее количество 200 мг
Активный ингредиент, целлюлозу, крахмал и стеарат магния смешивают, пропускают через сито с отверстиями N 45 и наполняют смесью твердые желатиновые капсулы в количестве 200 мг.

Препаративная форма 6
Суппозитории, каждая из которых содержит 225 мг активного ингредиента, приготавливают следующим образом:
Активный ингредиент 225 мг
Глицериды насыщенных жирных кислот 2000 мг
Общее количество 2225 мг
Активный ингредиент пропускают через сито с отверстиями N 60 США и суспендируют в глицеридах насыщенных жирных кислот, предварительно расплавленных с использованием минимально необходимого тепла. Затем смесь наливают в пресс-форму для суппозиториев с номинальной емкостью 2 г и оставляют охлаждаться.

Препаративная форма 7
Суспензии, каждая из которых содержит 50 мг активного вещества на 5 мл дозу, готовят следующим образом:
Активный ингредиент 50 мг
Натриевая карбоксиметилцеллюлоза 50 мг
Сироп 1,25 мл
Раствор бензиновой кислоты 0,10 мл
Отдушка по усмотрению
Краситель по усмотрению
Очищенная вода до общего количества 5 мл
Активный ингредиент пропускают через сито с отверстиями 45 мет США смешивают с натриевой карбоксиметилцеллюлозой и сиропом до образования равномерной пасты. Раствор бензойной кислоты, отдушку и краситель разбавляют порцией воды и добавляют при перемешивании. Затем добавляют достаточное количество воды до получения требуемого объема.

Препаративная форма 8.

Препаративная форма для внутривенного введения готовится следующим образом:
Активный ингредиент 100 мг
Изотонический солевой раствор 1,000 мл
Раствор представленного выше ингредиента обычно вводят внутривенно со скоростью 1 мл в минуту.

Нижеследующие примеры даются для дальнейшей иллюстрации изобретения, и не предназначены для его ограничения.

Значения R_f в нижеследующих примерах определялись с использованием тонкослойной хроматографии на Кизельгеле 60F-254 (Мерк, Дармштадт) в следующих системах растворителей;
(А) хлороформ-метанол-уксусная кислота (135:15:1 об./об./об);
(В) этилацетат-уксусная кислота абсолютный этанол (90:10:10 об./об./об. ).

В примерах использованы следующие аналитические методы ВЭЖХ.

Метод 1. Хроматограф Вотерс 600Е с колонкой с обращением фаз Видак С₁₈ размером 0,46 см х 10 см. Хроматограмма получена на LDC при 220 нм с применением градиента А 0,01 М ацетата аммония и В-ацетонитрила.

Метод 2. Хроматограф фармация FPLC с колонкой PepRPC размером 0,5 см х 5 см. Запись ведется на приборе Фармация UV-M при 214 нм с применением градиента либо А-0,01 М ацетата аммония, либо В ацетонитрила.

Используемые в примерах аббревиатуры имеют следующие значения.

Аминокислоты: Arg аргинин, Pro пролин, Phg фенилглицин;
Вос трет-бутилоксикарбонил;
BZ1 бензил;
СbZ бензилоксикарбонил;
ДЦК дициклогексилкарбодиимид;
ДМФА диметилформамид;
ДМСО диметилсульфоксид;
МС-ББА масс-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами;
МС-ДП масс-спектрометрия с десорбцией в поле;
ТГФ тетрагидрофуран;
ТСХ тонкослойная хроматография.

Пример 1. N-Boc-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинин-альдегид (Вос-D-Phg-Pro-Arg-H), полусульфат
1) Boc-D-Phg-Pro-OBZ1
Раствор Boc-D-фенилглицина (15 мг, 59,7 ммоля) и гидрохлорида бензилового эфира пролина (14, 43 г, 59,7 ммоля) с последующим прибавлением гидрата 1-гидроксибензотриазола (8,1 г, 59,7 ммоля) и ДЦК (12,3 г, 59,7 ммоля). Реакционную смесь перемешивают 3 дня при комнатной температуре, после чего фильтруют и фильтра испаряют в вакууме с получением масла. Полученное масло растворяют в 200 мл этилацетата и 150 мл воды и после встряхивания органический слой отделяют, трижды промывают порциями по 100 мл 0,1 н. HCl, один раз 150 мл воды, трижды порциями по 100 мл 5% бикарбоната натрия и снова 150 мл воды. Промытый органический раствор сушат над MgSO₄ и после испарения в вакууме получают в виде твердого вещества 24,8 г (95% от теории (Вос-D-Phg-Pro-ObZ1, ТСХ Rf (А) 0,75; МС-ББА 439 (М+).

2) Boc-D-Phg-Pro-OH
Полученный вышеприведенным способом Boc-Phg-Pro-ObZ1 (24,5 г, 55,7 ммоля) растворяют в 40 мл ДМФА и к раствору добавляют 225 мл изопропилового спирта и 1 г 5% Pd на угле в качестве катализатора. Через распределительную газовую трубку в реакционную смесь пробулькивают азот, затем 16 часов пробулькивают водород, после чего 5 минут пропускают азот. Катализатор отфильтровывают через фильтровальный слой хайфло и испарением фильтрата досуха в вакууме получают твердый остаток. Остаток кристаллизуют из диэтилового эфира, содержащего небольшое количество этилацетата. Получено 10,35 г (выход 53% ) продукта удаления сложноэфирной группы: Вос-D-Phg-Pro (2), ТСХ Rf (А) 0,32; МС-ББА 349 (МН⁺);¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ: 1,35 (с, 9Н), 1,71-2,1 (м. 4Н), 3,1 (м, 1Н), 3,74 (м, 1Н), 4,2 (м, 1Н), 5,45 (д, 1Н), 7,09 (д, 1Н), 7,25-7,4 (м, 5Н), 12,5 (уш.с. 1Н).

3) Вос-L-Arg(CbZ)-OH
В трехгорлой круглодонной колбе в 240 мл 5 н. NaOH растворяют гидрохлорид N-Мос-аргинина (Вос-Arg-OH.HCl) (82,1 г, 250 ммолей). Раствор охлаждают до -5^oC и по каплям в течение 55 минут прибавляют бензилхлорформат (143 мл, 1 моль, 4 экзв.), поддерживая рН в пределах 13,2-13,5 добавлением 5 н. NaOH (250 мл). По окончании прибавления хлорформата реакционную смесь перемешивают 1 час при -5^oC. Затем реакционную смесь разбавляют 100 мл воды и 500 мл диэтилового эфира, водный слой отделяют и дважды экстрагируют диэтиловым эфиром порциями по 40 мл. Водный слой подкисляют до рН 3 добавлением 3 н H₂SO₄ (560 мл) и экстрагируют 550 мл этилацетата. Отделенный водный слой экстрагируют один раз этилацетатом и экстракт объединяют с полученными ранее экстрактами этилацетата. Объединенные экстракты промывают водой, сушат над MgSO₄ и испаряют досуха в вакууме. Остаток ополаскивают эфиром и осажденный продукт фильтруют и сушат. Получено 66,1 г (65% от теории) 3) (Вос-Arg (CbZ)-OH, ТСХ Rf=(С) 0,43; МС-ДП 408 (М⁺).

¹Н-ЯМР (CDCl₃) d: 1,42 (с, 9Н), 1,61-1,91 (м, 4Н), 3,23-3,41 (м, 2Н), 4,17 (д, 1Н), 5,21 (с, 2Н), 5,62 (д, 1Н), 7,3-7,42 (м, 6Н), 8,37 (м, 1Н).

4) Вос-Arg(Cbz)-лактам
Раствор (3) Вос-Arg(CbZ)-OH (66 г, 0,162 моля), полученного вышеописанным способом, в 230 мл сухого ТГФ охлаждают в бане со льдом в ацетоне до -10^oC. К холодному раствору добавляют N-метилморфолин (18,7 мл, 1,05 экв.), затем добавляют изобутилхлорформат (22,5 мл, 1,05 экв.) и смесь перемешивают 5 минут при -10^oC. После этого добавляют триэтиламин (23,5 мл, 1,05 экв.) и смесь перемешивают 1 ч при -10^oC и еще 1 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь переносят в один литр смеси воды со льдом, в результате чего осаждается продукт (4). Осадок отфильтровывают, промывают холодной водой, сушат в вакууме и кристаллизуют из этилацетата. Получено 38,05 г (60% от теории) продукта (4): Boc-Arg(CbZ)-лактами, ТСХ Rf-(А) 0,77; МС-ДП 391 (МН⁺).

₁Н-ЯМР (CDCl₃ d: 1,48 (с, 9Н), 1,78-1,98 (м, 2Н), 2,5 (м, 1Н), 3,41 (м, 1Н), 4,43 (м, 1Н), 4,9 (м, 1Н), 4,16 (с, 2Н), 5,27 (м, 1Н), 7,28-7,45 (м, 6Н), 9,41 (м, 1Н), 9,68 (м, 1Н).

5) Arg(CbZ)-лактам, трифторацетат
Boc-Arg(CbZ)-лактам (4) (38 г, 0,097 моля) смешивают с 200 мл трифторуксусной кислоты, содержащими 20 мл анизола, и смесь перемешивают один час при 0^oC. Затем реакционную смесь испаряют в вакууме без нагревания и к остатку добавляют 400 мл диэтилового эфира. Твердый продукт отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакууме. Получено в качестве продукта 40,5 трифторацетата (5), ТСХ Rf (С) 0,29; МС-ДП 291 (МН⁺).

6) Boc-D-Pro-Arg(CbZ)-лактам
К раствору Вос-D-Phg-Pro (14,5 г, 41,6 ммоля, получение см. часть 2) выше) в 80 мл ДМФА, охлажденному до -15^o C, прибавляют 4,6 мл N-метилморфолина с последующим прибавлением 5,4 мл изобутилхлорформата и затем реакционную смесь перемешивают две минуты при -15^oC.

В отдельной колбе в 30 мл ДМФА растворяют Arg(CbZ)-лактам. ТФА (15,3 г, 37,8 ммоля, получение см. часть 5) выше), раствор охлаждают до 0^oC и к нему прибавляют 4,6 мл N-метилморфолина. После перемешивания раствора две минут при 0^oC его переносят в раствор Boc-D-Phg-Pro, полученный до вышеприведенной методике. Полученную реакционную смесь перемешивают 4 ч при -15^oC и затем оставляют нагреваться до комнатной температуры в течение примерно суток. Затем к реакционной смеси добавляют 5%-ный раствор NaHCO₃ (5 мл) и последующим испарением в вакууме получают масло. Масло растворяют в 175 мл этилацетата и 150 мл воды добавляют к раствору. После встряхивания органический слой отделяют, промывают 5% NaHCO₃ и водой, сушат над MgSO₄ и испарением досуха в вакууме получают 23 г (выход 98%) Boc-D-Phg-Pro-Arg(CbZ)-лактама (6) в виде аморфного вещества, ТСХ Rf (А) 0,72; МС-ББА 621 (МН⁺).

7) Boc-D-Pro-Arg(CbZ)-H
В 200 мл сухого ТГФ растворяют лактам (6) (23 г, 37 ммолей, получение см. часть 6) выше) и раствор охлаждают до -15^oC в атмосфере азота. К охлажденному раствору по каплям в течение 10 мин прибавляют 1 М раствор литийалюминийгидрида в ТГФ (37 мл, 37 ммолей) и по окончании прибавлением реакционную смесь нагревают до 0^oC, и перемешивают 1 ч. Смесь 12 мл ТГФ и 12 мл 0,5 н. H₂SO₄ медленно по каплям в течение 10 мин прибавляют по каплям к реакционной смеси. Затем реакционную смесь разбавляют 200 мл этилацетата и 200 мл воды и после встряхивания органический слой отделяют. Органический слой трижды промывают водой порциями по 150 мл, сушат на MgSO₄ и после испарения досуха в вакууме получают 19,2 г (выход 83%) Boc-D-Phg-Pro-Aro-H, МС-ББА 623 (МН⁺); (с 0,5, CHCl₃).

8) Вос-D-Phg-Pro-Aro-H, полусульфат
В 100 мл ТГФ и 100 мл воды растворяют Вос-D-Phg-Pro-Arg(CbZ) (7) (18,2 г, 29,2 ммоля) и к раствору добавляют 29,2 мл 1 н. H₂SO₄ b 2 u 10% Pd-C. В суспензию 5 мин через газораспределительную трубочку пробулькивают азот с последующим пропусканием 4 ч водорода. По окончании восстановления вновь 5 мин пробулькивают азот. Реакционную смесь фильтруют через слой хайфло с удалением катализатора и испарением в вакууме фильтрат концентрируют до 100 мл. К водному концентрату добавляют 200 мл н-бутанола и органический слой отделяют от водного слоя. Водный слой трижды экстрагируют н-бутанолом порциями по 100 мл, экстракты объединяют и присоединяют к органическому слою. Органический слой испаряют досуха в вакууме, остаток ополаскивают смесью диэтиловый эфирдиизопропиловый эфир (1:1 об./об.), твердое вещество отфильтровывают и сушкой в вакууме получают 10,26 г сухого продукта (8). Сырой продукт растворяют в 10%-ном водном ацетонитриле и раствор переносят в колонку (7,5 см х 53 см) смолы НР-20, предварительно приведенную в равновесие 10% -ным водным ацетонитрилом. Продукт элюируют из колонки ступенчатым элюированием с повышением концентрации ацетонитрилда в воде (10%-12%-15%). Отбирают ряд фракций, которые анализируют на наличие продукта с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами. Содержащие продукт фракции объединяют и их испарением досуха получают 5,42 г (выход 53%) чистого полусульфата Вос-D-Phg-Pro-Arg-H, (с 0,5, CHCl₃), МС-ББА 489 (МН⁺); время удерживания в ОФ-ВЭЖХ (метод 2, 10-50% В за 45 мин), время 32,3 мин.

Пример 2. N-(трет-Бутилоксикарбонил)-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргинин-альдегид (Вос-D-Phg-Pro-Arg-H), диацетат.

К раствору Boc-D-Phg-Pro-Arg(CbZ)-Н (получение см. часть 7) примера 1, 38 г. 61 ммоль) в 500 мл изопропилового спирта, содержащих 7,1 мл (2 экв.) уксусной кислоты, добавляют в качестве катализатора 2 г 10% Pd а угле. Смесь промывают поступающим через газораспределительную трубку азотом (5 мин) и затем через смесь 24 ч пропускают водород. По окончании восстановления через смесь вновь 5 мин пропускают азот. Затем реакционную смесь фильтруют через слой Хайфло с удалением катализатора и испарением фильтрата досуха получают 33,6 г сырого продукта в виде аморфного вещества. Продукт очищают порциями в 5 г на колонке (5 см х 25 см) Видак C₁₈. Полученный трипептид элюируют 8 ч градиентом 10-30% ацетонитрила в 0,01 М ацетате аммония. Собирают ряд фракций и содержащие по данным ВЭЖХ с обращением фаз продукт фракции объединяют, и сушат вымораживанием. Получено 11,7 г (35%) заглавного трипептида со следующими показателями: МС-ББА 489 (МН⁺).

Аминокислотный анализ: Phg 1,07, Pro 0,94. (с 0,6, CHCl₃).

Элементный анализ, рассчитанный для C₂₈H₄₄N₆O₉:
Теория: С 55,25, Н 7,29, N 13,81%
Найдено: С 55,52, Н 7,40, N 13,93%
Соединения, охарактеризованные в нижеследующих примерах 3 и 4, получены по методике примера 1, но с использованием соответственно фенилглицина и п-гидроксифенилглицина вместо фенилглицина примера 1.

Пример 3. N-Вос-D-1-нафтилглицил-Pro-Arg-H, диацетат (с 0,5, 50%-ная уксусная кислота); МС-ББА 539 (МН⁺);
ВЭЖХ (метод 1, градиент 20-60% В за 60 мин), время удерживания 42 мин.

Пример 4. N-Boc-D-2-нафтилглицил-Pro-Arg-H, диацетат ВЭЖХ (метод 2, градиент 30-60% В за 60 мин), время удерживания 18 мин
Элементный анализ, вычисленный для C₃₂H₄₆N₆O₉:
Теория: С 58,35, Н 7,04, N 12,76%
Найдено: С 58,59, Н 6,83, N 13,03%
Пример 5. N-Boc-D-(4-гидроксифенилглицил)-Pro-Arg-Н, диацетат ВЭЖХ (метод 2, градиент 10-40% В за 40 мин), время удерживания 26,5 мин
Аминокислотный анализ: 4-гидроксифенилглицил 0,99, пролин 1,01.

Пример 6-23 Перечисленные в нижеследующей таблице 4 соединения по методиками примера 1 использованием указанных аминокислот или замещенных уксусных кислот (А(С=О)) вместо применяемого в примере 1-фенилглицина. Все соединения таблицы 1 находятся в виде ацетатов.

Пример 27 D-1,2,3,4-Тетрагидроизохинолин-1-оил-L-пролил-L-аргининальдегид, сульфат
К раствору изохинолин-1-карбоновой кислоты (12,5 г, 0,072 моля) в 185 мл ледяной уксусной кислоты добавляют 2 г оксида платины и суспензию гидрируют при комнатной температуре и давлении водорода 60 psi (4,2 кг/см² в аппарате для гидрирования Парра 24 ч. Реакционную смесь фильтруют через фильтрующий слой (Целит) с удалением катализатора и фильтрат испаряют досуха в вакууме. Твердый остаток ополаскивают водой, фильтруют и после высушивания получают 8 г (выход 63% ) DL-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-карбоновой кислоты. ДП-масс-спектр 178 (МН⁺); ¹Н-ЯМР (ДМСО-d₆) δ: 2,8-3 (м, 1Н), 3,15 (м, 1Н), 3,3-3,4 (м, 2Н), 7,05-7,25 (м, 4Н), 7,7 (м, 1Н).

Полученный продукт (7,08 г, 0,04 моля) растворяют в 2 н. NaOH (40 мл, 0,08 моля) и к раствору добавляют 40 мл трет-бутилового спирта и 10,5 г (0,048 моля) ди-третбутилдикарбоната. После перемешивания 24 ч при комнатной температуре основное количество трет-бутилового спирта испаряют из реакционной смеси. Полученный водный раствор экстрагируют диэтиловым эфиром, водный слой отделяют и подкисляют 2 н. HCl до рН 2. Подкисленную водную фазу экстрагируют этилацетатом, экстракт сушат над MgSO₄ и испаряют досуха в вакууме. Остаточное масло растворяют в диэтиловом эфире и к раствору добавляют 7,9 мл (0,04 моля) дициклогексиламина. После выдерживанитя 4 ч при 4^oC осадок дициклогексиламиновой соли N-Вос-DL-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-карбоновой кислоты отфильтровывают, промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакууме. Получено 15,7 г (выход 86% чистой соли. ДП-масс-спект: 459 (МН⁺)
Элементный анализ, вычисленный для C₂₇H₄₂N₂O₄:
Теория: С 70,71, H 9,23, N 6,11%
Найдено: С 71,07, Н 9,37, N 5,87%
Вос-защищенное производное (73,4 г, 160 ммолей) суспендируют в 200 мл этилацетата, суспензию промывают, 1,5 н. лимонной кислотой и водой, сушат над MgSO₄ и испаряют досуха в вакууме. Остаточное масло растворяют в этилацетате, раствор охлаждают до 0^o C и к раствору добавляют 2,4,5-трихлорфенол (31,6 г, 160 ммолей) с последующим прибавлением ДЦК (33 г, 160 ммолей). Реакционную смесь перемешивают один час при 0^oC и 1,5 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь охлаждают до 0^oC, осадок отфильтровывают и фильтрат испаряют досуха в вакууме. Остаточное масло растворяют в 100 мл пиридина и к раствору добавляют пролин (18,42 г, 160 ммолей) и триэтиламин (22,3 мл, 160 ммолей). После перемешивания 24 ч при комнатной температуре реакционную смесь испаряют досуха в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате, к раствору добавляют воду и добавлением 2 н. NaOH устанавливают рН 9,5. Водный слой отделяют, подкисляют 2 н. HCl до рН 2 и экстрагируют этилацетатом. Экстракт сушат над MgSO₄, фильтруют и испаряют досуха в вакууме. Маслянистый остаток растворяют в хлористом метилене и этилацетате. После выдерживания 4 ч при 4^oC образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и перекристаллизовывают из смеси хлористый метилен-этилацетат. Полученный Boc-D-1,2,3,4-тетрагизроизохинолин-1-оил-L-пролин (Boc-I-Tig-Pro-OH) сушат в виде твердого продукта в вакууме и получают 19,6 г (выход 33%) чистого продукта. ТСХ Rf (А) 0,44; МС-ББА: 375 (MH⁺).

Элементный анализ, вычисленный для C₂₀H₂₆N₂O₅:
Теория: С 64,15, Н 7,00, N 7,48%
Найдено: С 63,26, Н 6,98, N 7,52%
(с 0,5, метанол).

В первой колбе в 100 мл ДМФА растворяют Boc-D-1-Tig-Pro (17,8 г, 47,5 ммоля), раствор охлаждают до -15^oC, после чего добавляют 5,3 мл (52,3 ммоля) N-метилморфолина и 6,2 мл (47,5 ммоля) изобутилхлорформата и смесь перемешивают две минуты при -15^oC.

Во второй колбе в 40 мл ДМФА растворяют Со-защищенный аргинин-лактам в виде трифторацетата (Arg(Z)-лактам, ТФА) (19,2 г, 47,5 ммоля), раствор охлаждают до 0^oC, после чего прибавляют 5,3 мл (52,3 ммоля) N-метилморфолина. Перед перенесением в первую колбу смесь перемешивают 2 мин при 0^o C. Реакционную смесь перемешивают 4 ч при -15^oC, затем в течение примерно суток медленно нагревают до комнатной температуры, после чего добавляют 5 мл 5% NaHCO₃. Испарением реакционной смеси в вакууме получают масло. Масло растворяют в 175 мл этилацетата и к раствору добавляют 150 мл воды. Органический слой отделяют, промывают 5% NaHCO₃ водой, 0,1 н. HCl и вновь водой, затем сушат над MgSO₄. Промытый и высушенный раствор испаряют досуха в вакууме с получением 24,3 г (выход 79%) Boc-D-1-Tig-Pro-Arg(Z)-лактама в виде аморфного вещества.

ТСХ Rf (А) 0,71;
МС-ББА: 647 (МН⁺);
(с 0,5, хлороформ).

Полученный вышеописанным способом Arg (Z)-лактам (23,4 г, 36,2 ммоля) растворяют в 300 мл сухого ТГФ и раствор помещают в атмосферу N₂. Затем раствор охлаждают до -20^o C и к охлажденному раствору в течение 30 мин по каплям прибавляют 37 мл 1 М раствора в ТГФ литийалюминийгидрида. По окончании прибавления смесь перемешивают 30 мин при -20^oC, после чего по каплям в течение 10 мин прибавляют смесь 20 мл ТГФ и 20 мл 0,5 н. H₂SO₄. Реакционную смесь прибавляют 400 мл этилацетата и к раствору добавляют 400 мл воды. Органический слой отделяют, дважды промывают водой порциями по 150 мл и сушат над MgSO₄. Испарением в вакууме промывают и высушенного раствора получают 21 г (выход 89%) Boc-D-1-Tig-Pro-Arg(Z)-H в виде аморфного вещества, ТСХ Rf (А) 0,28, 0,28. Полученный вышеописанным способом производное Arg(Z) гидрируют по нижеприведенной методике с удалением защитной Со-группы. Полученный продукт (18,1 г, 27,9 ммоля) растворяют в 200 мл ТГФ и 80 мл воды и к раствору добавляют 28 мл 1 н. H₂SO₄ и 3 г 5% Pd на угле. Через суспензию 5 мин пробулькивают азот, поступающий через барбатер, затем 5 ч пропускают водород и вновь 5 мин пробулькивают азот. Катализатор отфильтровывают и фильтрат концентрируют до объема в 100 мл. Концентрат разбавляют 200 мл н-бутанола и образовавшиеся слои разделяют. Водный слой трижды экстрагируют н-бутанолом порциями по 100 мл и экстракты присоединяют к органическому слою. Органический слой испаряют в вакууме, остаток ополаскивают смесью диэтиловый эфир-диизопропиловый эфир (1:1 об./об.), твердый продукт отфильтровывают и высушиванием в вакууме получают 11,08 г сырого продукта.

Продукт очищают и переводят в сульфат следующим образом. Полученный вышеописанным способом сырой продукт растворяют в 20 мл воды и 20 мл 10 н. H₂SO₄. Раствор нагревают 25 мин при 50^oC, охлаждают до комнатной температуры и добавлением смолы Био-Рад AG1-ХВ (гидроксидная форма) устанавливают рН 4. Смолу отделяют от раствора фильтрованием и лиофилизацией раствора получают 8,44 г сырого продукта в виде сульфата (D-1-Tig-Pro-Arg-H. H₂SO₄).

Полученный сульфат растворяют в 0,01% H₂SO₄ и раствор переносят в две колонки для ВЭЖХ с обращением фаз размером 5 см х 25 см (смола Видак С₁₈), соединенных последовательно. Для элюирования полученной соли используют градиент повышающейся концентрации ацетонитрила (2-10%). Отбирают фракции и объединяют на основе результатов аналитической ОФ-ВЭЖХ. Добавлением в объединенные фракции смолы AG1-Х8 (аналитическая анионообменная смола фирмы Био-Рад в 50-100 меш) в гидроксильном цикле устанавливают рН 4. Раствор фильтруют с удалением смолы и фильтрат лиофилизуют. Получено 2,4 г (57% от теории) очищенного продукта.

МС-ББА: 415 (МН⁺);
(с 0,5, 0,01 н. H₂SO₄);
Аминокислотный анализ: Pro 0,92, Tig 1,00;
Элементный анализ, рассчитанный для C₂₁H₃₂N₆O₇S:
Теория: С 49,21, Н 6,28, N 16,29, S 6,26%
Найдено: С 51,20, Н 6,17, N 16,88, S 5,37%

Формула изобретения

1. Производные трипептидов в виде R- или RS-формы общей формулы I

где А группа формулы

R фенильная группа формулы

где а и а₁ независимо водород, низший алкил, низший алкокси, галоген, трифторметил или гидрокси; тиенил; нефтил, незамещенный или моно- или дизамещенный низшей алкокси группой; или циклогексил;
R₁ водород, метил или этил;
В низший алкил, низший алкокси или аминогруппа формулы -N(R₂) (R₃), в которой R₂ и R₃ независимо водород или низший алкил или R₂ водород, а R₃ ацетил или N-Вос (низший)алкил, при условии, что, когда R₁ метил или этил, тогда В является отличным от метила или этила,
или А бициклическая группа формулы

Q -CH₂-CH₂- или
Q Y -CH₂-;
R₅ водород или трет-бутоксикарбонил;1 R₆ водород, обозначенный пунктиром круг указывает на то, что кольцо является пергидрокольцом,
или их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли.

2. Производные трипептидов по п.1 общей формулы

где А группа формулы

где R фенильная группа формулы

где а и а₁ независимо водород, низший алкил, низший алкокси, галоген, трифторметил или гидрокси,
или R тиенил; нафтил, незамещенный или моно- или дизамещенный низшей алкоксигруппой,
или R циклогексил;
R₁ водород, метил или этил;
В низший алкил, низший алкокси или аминогруппа формулы -N(R₂)(R₃), в которой R₂ и R₃ независимо водород или низший алкил, или R₂ водород, а R₃ ацетил или -N-Вос(низший)алкил, при условии, что, когда R₁ метил или этил, тогда В является отличным от метила или этила.

3. Производные трипептидов по п.2, в которых В аминогруппа формулы -N(R₂)(R₃),где R₂ и R₃ независимо- водород или низший алкил или R₂ водород, а R₃ трет.бутоксикарбонил.

4. Производное трипептида по п.3, представляющее N-Вос D-фенилглицил-L-пролил-L-аргиналь или его фармацевтически приемлемые нетоксичные соли.

5. Производное трипептида по п.3, представляющее N-метил-D-фенилглицил-L-пролил-L-аргиналь или его фармацевтически приемлемые нетоксичные соли.

6. Производные трипептидов по п.1, в которых А группа формулы

где R₅ водород или трет.бутоксикарбонильная группа;
R₆ водород;
обозначенный пунктиром круг указывает на то, что кольцо является пергидрокольцом,
или их фармацевтически приемлемые нетоксичные соли.

7. Производное трипептида по п.6, представляющее собой D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1- оил-L-пролил-L-аргининальдегидсульфат.

8. Производное трипептида по п.6, представляющее собой D-пергидроизохинолин-1- ил-карбонил-L-пролил-L- аргинин-альдегид или его фармацевтически приемлемые соли.

9. Производное трипептида по п.6, представляющее собой D-пергидроизохинолин-3-ил-карбонил-L-пролил-L-аргинин-альдегид или его фармацевтически приемлемые соли.

10. Производное трипептида по п.6, представляющее собой D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-оил-L-пролил-L-аргинин-альдегид или его фармацевтически приемлемые соли.

11. Производные трипептидов по любому из пп.1 10, обладающие противотромботическими свойствами.

12. Фармацевтическая композиция, ингибирующая свертывание крови, содержащая активное соединение, представляющее собой производное трипептида, в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или разбавителями, отличающаяся тем, что в качестве производного трипептида она содержит соединение формулы I по любому из пп.1 11.

13. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что она предназначена для орального применения и включает активное соединение в количестве примерно 1 - 1000 мг на единичную дозу в сочетании с таким эксципиентом, как желатин, связующее, смазочный агент или агент дезинтеграции.

14. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что она предназначена для парэнтерального применения и включает активное соединение в количестве примерно 1 1000 мг на единичную дозу в разбавителе, таком, как изотонический физиологический раствор.

Приоритет по признакам:
28.09.90 при

где R фенильная группа

где а и а₁ независимо водород, низший алкил, низший алкокси, галоген, трифторметилл или гидрокил, или R тиенил; нафтил, незамещенный или моно- или ди-замещенный низшей алкоксигруппой, или R циклогексил; R₁ водород, метил или этил; В низший алкил, низший алкокси или аминогруппа формулы NR₂, R₃, где R₂ и R₃ независимо водород или низший алкил, или R₂ водород, а R₃ ацетил или N Вос(низший)алкил, при условии, что когда R₁ метил или этил, тогда В отличен от метила или этила.

06.09.91 при А группа формулы

где R₅ водород или трет.бутоксикарбонил; R водород; обозначенный пунктиром круг указывает на то, что бензольное кольцо является пергидрокольцом.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4