Фрагмент днк, кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая полипептид со свойствами нитрилгидратазы, штамм бактерий eshcerichia coli - продуцент полипептида со свойствами нитрилгидратазы, способ получения полипептида со свойствами нитрилгидратазы

 

Использование: биотехнология, микробиология. Сущность изобретения: охарактеризована аминокислотная и нуклеотидная последовательность α - и b -субъединиц нитрил-гидратазы Н-типа, выделенной из Rhodococcus rhodochrous J-1. Фрагмент ДНК, кодирующий нитрил-гидратазу, внедряют в вектор экспрессии, и рекомбинантный вектор используют для трансформации E. coli. Полученный штамм способен продуцировать нитрил-гидратазу в большей степени, чем обычно применяемые микроорганизмы. 4 с.п. ф-лы, 5 табл.,9 ил.

Изобретение относится к фрагменту ДНК, полученному из Rhodococcus rhodochrous J-1 и кодирующему полипептид с нитрил-гидратазной активностью, который гидролизует нитрил в амид. Изобретение также относится к рекомбинантной ДНК, содержащей вышеуказанный фрагмент ДНК, и штамму E. Coli, трансформированному рекомбинантной ДНК. Кроме того, оно относится к способу получения нитрил-гидратазы с использованием рекомбинантного штамма.

Нитрил-гидратаза или нитрилаза известна, как фермент, гидролизирующей нитрилы в амиды. Микроорганизмы, образующие нитрил-гидратазу, включают организмы, принадлежащие к роду Bacillus, роду Bacteridium, роду Micrococcus и роду Brevibacterium (см. JP-B-62-21517/1989, US P N 4001081), роду Corynebacterium и роду Nacardia (см. JP-B-56 17918/1989, USP N 4248968), роду Pseudomonas (см. JP-3-59-37951/1984, USP N4637982/, роду Rhodococcus, роду Arthrobacter и роду Microbacterium (см. JP-A-61-162193/1986, EP-A-0188316) Rhodococcus rhodochrous (см. JP-A-2470/1990, EP-A-0307926).

В изобретении, используя методы генной инженерии, микроорганизмы преобразуют с тем, чтобы они содержали множественные копии рекомбинантной ДНК, кодирующей нитрил-гидратазу. Полученный рекомбинант продуцирует нитрил-гидратазу на заметно более высоком уровне по сравнению с обычно применяемыми микроорганизмами.

Создателями изобретения ранее описан фрагмент ДНК, полученный из Rhodococcus N-774 (FERM BP-1936), который тоже кодирует полипептид с нитрил-гидратазной активностью JP-A-2-119778/1988/.

В отличие от вышеприведенной ссылки в изобретении для продуцирования нитрил-гидратазы используется фрагмент ДНК, полученный из Rhodococcus rodochrous J-1. Нами выделен ген, кодирующий нитрил-гидратазу, ген внедрен в приемлемый плазмидный вектор, которым трансформирован соответствующий хозяин, и получен трансформант, продуцирующий нитрилгидратазу, которая с высокой активностью гидролизует нитрилы, в т.ч. и ароматические.

Изобретение относится к (1) фрагменту ДНК^(H), кодирующему полипептид с нитрил-гидратазной активностью, который включает α^(H)и β^(H) субъединицы следующих аминокислотных последовательностей, приведенных в табл.1 и 2, (2) фрагменту ДНК^(H) по пункту (1), содержащему нуклеотидные последовательности, кодирующие альфа ^(H) и бета ^(H)-субъединицы, а именно ДНК последовательность альфа ^(H)-субъединицы ( см.табл.3) и ДНК последовательность бета ^(H)-субъединицы ( см.табл.4), (3) рекомбинантной ДНК, включающей ДНК^(H) по пунктам (1)-(2), и векторную последовательность, (4) штамму, трансформированному рекомбинантной ДНК по пункту (3), (5) способу получения нитрил-гидратазы, заключающемуся в культивировании рекомбинантного штамма, охарактеризованного в пункте (4), и выделении из культуры нитрил-гидратазы, Ниже изобретение описывается более подробно.

Изобретение осуществляют проведением этапов (1)-(3): Кислотное секвенирование нитрил-гидратазы Из Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM BP-1478) выделяют и очищают два типа нитрил-гидратазы (обозначены соответственно как H-тип и L-тип), оба фермента разделяют с помощью ВЭЖХ на альфа и бета-субъединицы. Определяют часть аминокислотной последовательности каждой субъединицы (фиг.1).

(2) Получение ДНК-зонда на ген нитрил-гидратазы ДНК-зонд получают из JM105/pYUK121 (FERM BP-1937) по методике Р-А-2-119778/1990, что связано с высокой степенью гомологичности в аминокислотной последовательности между нитрил-гидратазой бета-субъединицы Rhodococcus N-774, охарактеризованной в указанной публикации из Official Gazette патентов Японии, и субъкдиницами Rhodococcus rhodochrous J-1. Плазмиду pYUK121, содержащую ген нитрил-гидратазы, происходящий из Rhodococcus N-774, получают из культуры JM105/pYU-K121. ДНК pYU K121 гидролитически расщепляют с помощью SpnI и SalI. SphI-SalI-фрагмент содержит ген нитрил-гидратазы Rhodococcus N-774 (Рис.2). Фрагмент ДНК радиометят.

(3) Детектирование сегмента ДНК, содержащего ген нитрил-гидратазы из хромосом Rhodococcus rhodochrous J-1.

Хромосомную ДНК получают из культуры Rhodococcus rhodochrous J-1. Хромосомную ДНК расщепляют с помощью ферментов рестрикции и гибридизуют с зондом этапа (2) по методике гибридизации Саузерна (Southern E.M. J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)).

(4) Конструирование рекомбинантной плазмиды.

Рекомбинантную плазмиду конструируют вставкой хромосомного фрагмента ДНК этапа (3) в плазмидный вектор.

(5) Трансформация и отбор трансформанта, содержащего рекомбинантную плазмиду Трансформант получают с помощью рекомбинантной плазмиды этапа (4). Содержащий рекомбинантную плазмиду трансформант отбирают с помощью зонда этапа (2) по методике гибридной колонии (R. Bruce Wallace и др. Nuc. Aci. Res. 9, 879 (1981). Кроме того, присутствие гена натрил-гидратазы подтверждают методом гибридизации Саузерна. Отобранную в результате плазмиду обозначают как PNHJ 10H.

(6) Выделение и очистка плазмидной ДНК и конструирование рестрикционной карты
Выделяют и очищают полученную на этапе (5) плазмидную ДНК PNH J 10H. Для определения содержащей ген нитрил-гидратазы области конструируют ее рестракционную карту (фиг.6).

(7) Секвенирование ДНК
Добавочный сегмент внедренного ДНК фрагмента в плазмиде pNHJ10H отщепляют с помощью соответствующего фермента рестрикции. Внедренный фрагмент затем применяют для секвенирования. Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК (фиг.7) показывает, что в ней содержится последовательность, прослеженная на основании аминокислотной последовательности этапа (1).

(8) Получение нитрил-гидратазы и превращение нитрилов в амиды
Культивируют трансформант этапа (7). Бактериальные клетки смешивают с нитрилами (субстрат нитрил-гидратазы) и получают амиды.

Rhodococcus rhodochrous J-1 депонирован в исследовательском институте ферментации агентства и промышленных наук и технологий, где ему присвоен регистрационный номер FERM BP-1478.

Характеристики штамма J-1 (FERM BP-1478) представлены ниже:
(1) Источник и депонирование
Штамм j-1 выделен из почвы в Сакио-ку Киото и депонирован в международном депозитарии, в соответствии с Будапештским договором, в научно-исследовательском институте ферментации, Японском агентстве промышленных исследований под номером FERM BP-1478.

(II) Бактериологические свойства
(a) Морфология
(1) Форма и размер клеток 0,9 1,0 мк x 3-10 мк
(2) Полиморфизм клеток: клетка представляет собой длинную палочку на начальной стадии, которая затем растет с изменением формы (изгибаясь) и делится на короткие бациллы.

(3) Подвижность нет
(4) Споры не образует
(5) Граммоположительный
(6) Кислотоустойчивость отрицательная
(7) Гетерофильный гранулоцит обнаруживается
(б) Состояние роста на различных средах культивирования при 30^oC
(1) на ровном агаре круг диаметром 1 мм (после 48 ч) с неправильной, плоской и гладкой поверхностью, довольно сухой и непрозрачный, бледно оранжево-розовый;
(2) на косом агаре нить с гладкой поверхностью, довольно гладкий, бледно оранжево-розового цвета;
(3) на жидком агаре мучнистый рост, формирование мембраны бактериальной клетки и рост сопровождается образованием мутности и осадка;
(4) рост при уколе на желатиновой среде прекрасно растет на поверхности, но не в нижнем слое, разжижения в желатине не наблюдается,
(5) лакмусовое молоко не изменяет
(в) Физическо-химические свойства:
(1) разложение нитратов положительно
(2) денитрификация отрицательно
(3) МР тест отрицательно
(4) YP тест отрицательно
(5) продуцирование индола положительно
(6) продуцирование сероводорода положительно
(7) гидролиз крахмала отрицательно
(8) Утилизация лимонной кислоты:
культуральная среда Кокура отрицательно
культуральная среда Кристензена положительно
(9) утилизация неорганических азотных источников нитрата положительно
соли аммония положительно
(10) образование цвета отрицательно
(11) Уроаза положительно
(12) оксидаза отрицательно
(13) каталаза положительно
(14) гидролиз целлюлозы отрицательно
(15) Параметры роста pH 5-10, температура: 10 41^oC
(16) аэробный
(17) разложение тирозина положительно
(18) разложение аденина положительно
(19) фосфотаза положительно
(20) гидролиз Твина 80 положительно
(21) O F тест отрицательно
(22) термоустойчивость (в 10% снятых сливках при 2^oC в течение 15 мин) нет
(23) образование кислоты и газа из сахара(см. табл.5)
(24) Рост в среде в качестве использования единственного углеродного источника:
инозитол -
мальтоза +
D-маннитол +
рамноза -
D-сорбитол +
м-оксибензольная кислота +
адипат натрия +
бензоат натрия +
цитрат натрия +
лактат натрия +
тестостерон +
L-тирозин +
глицепин (1% масса/объем) +
Трегалоза +
p-оксибензольная кислота (1%) (масс/объем) +
+ положительно, отрицательно.

(25)Жирные кислоты и анализ клеточной стенки: содержание насыщенных и ненасыщенных кислот с прямой цепью и туберкулостериновой кислоты. TLC тест на миоликовую кислоту дает одно единственное пятно.

В результате классификации выше перечисленных бактериологических свойств в свете Определителя Берджи, штамм j-1 является аэробным. Граммположительный, слабо кислотоустойчивый, каталазопозитивный и не образующий эндоспоры и жгутики. Он также представляет собой бациллу вытянутой формы, похожую на мицелий на начальной стадии роста, далее растет с разветвлением и затем делится на короткие бациллы. Таким образом это доказывает принадлежность штамма бактериям Nocardia. Анализ состава жирных кислот показал, что бактерия содержит насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с прямой цепью, содержащие туберкуло-стеариновую кислоту. TLC анализ миколиковой кислоты дает одно единственное пятно, имеющее те же самые значения RF, что и стандарты вида Rodococcus rhodochrous (IFO 3338) и что, следовательно, отличает их от рода Mycodacterium Штамм также отличается от рода Nocardia составом (числом атомов углерода)миколиковой кислоты. В результате рассмотрения других биохимических свойств было доказано, что данный штамм принадлежит к виду Rhodococcus rhodochrous.

Микроорганизмы имеют тенденцию мутировать, соответственно нет необходимости указывать, что микроорганизмы, даже если он является мутантом компетентного шлама, такого как штамм j-1, может быть использован в заявленном способе, пока у него сохраняется способность продуцировать нитрил гидратазу в присутствии ионов кобальта.

Рекомбинантный штамм E.coli TGI/pNHJIOH, полученный в результате трансформации плазмидой pNHJIOH и отбора трансформантов, депонирован там же и ему присвоен регистрационный номер FERM BP-2777. Условия культивирования штамма приводятся ниже.

При реализации изобретения, кроме названного, могут быть использованы и другие векторы, в том числе
плазмидный вектор (напр. pAT153, pMP9, pHO624, pKS и т.д.), фаговый вектор (напр.лямбда Qt II (Тойобо), Чарон 4А (Амерсхем) и т.д.)
Ферменты, которые могут быть использованы, включают: Snh I, Sal T, Ecor I, Sca I, Bam H I и т.п. выпускаемые промышленностью (Такара Шузо). Для трансформации могут быть использованы разнообразные хозяева, в том числе E. coli JM105 И E.coli TGI, но без ограничения только ими.

Культуральной средой для трансформанта служат обычно применяемые для подобные целей среды.

Превращение нитрилов в амиды осуществляют использованием очищенной нитрил-гидратазы, сырой нитрил-гидратазы, рекомбинантного штамма, а также выделенных бактериальных клеток или обработанного материала клеток и т.п. полученных из названного штамма.

Приемлемые для изобретения нитрилы включают ароматические нитрилы с 4-10 атомами углерода в ароматическом фрагменте и алифатические нитрилы с 2 6 атомами углерода, описанные в публикации Европейского патента N 0307926. Типичные примеры нитрилов включают: 4-, 3- и 2-цианопиридин, бензонитрил, 2,6-дифторбензонитрил, 2-тиофекарбонитрил, 2-фуронитрил, цианопиразин, акрилонитрил, метакрилонитрил, кротононитрил, ацетонитрил и 3-гидроксипропионитрил.

Положительный эффект изобретения.

Изобретением описывается аминокислотная последовательность альфа- и бета субъединиц нитрил-гидратазы, происходящей из Rhodococcus rhodochrous J-1. Фрагмент ДНК, кодирующий нитрил-гидратазу, внедряют в вектор экспрессии, а полученный рекомбинантный вектор применяют для трансформации. Трансформант содержит множество копий и способен продуцировать нитрил-гидратазу на гораздо более высоком уровне по сравнению с обычно применяемыми микроорганизмами.

На фиг.1 представлены N концевые аминокислотные последовательности альфа и бета- субъединиц нитрил-гидратазы, продуцированных Rhodococcus rhodochrous J-1.

На фиг. 2 5 представлена ДНК последовательность гена нитрил-гидратазы Rhodococcus N-774, применяемого в качестве ДНК-зонда.

На фиг. 2-6 показана рестрикционная карта рекомбинантной плазмиды pNHJ10H.

На фиг.7-9 представлена ДНК- последовательность фрагмента ДНК в pNHJ10H, происходящего из Rhodococcus rhodochrous J-1, и прослеженной аминокислотной последовательности.

Изобретение подробно иллюстрируется нижеследующим примером, который не предназначен для ограничения изобретения.

В примере использованы следующие сокращения:
TE Трис-HCI (10 мМ, pH 7,8), ЭДТА (I мМ, pH 8)
TNE Трис-HCI (50 мМ, pH 8), ЭДТА (I мМ, pH 8), NaCI (50 мМ)
STE трис-HCI (50 мМ, pH 8), ЭДТА (5 мМ, pH 8), сахароза (35 мМ)
среда 2xYT 1,6% Триптон, 1%-ый дрожжевой экстракт, 0,5 NaCI
Пример. (1) Выделение и очистка нитрил-гидратазы и частичное аминокислотное секвенирование нитрил-гидратазы
Rhodococcus rhodochrous J-1 культивируют 80 часов в среде (3 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л KH₂PO₄, 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л MgSO₄·4H₂O, 0,01 г/л CoCI₂ и 3 г/л кротонамида, pH 7,2). Собирают бактериальные клетки. 50 г бактериальных клеток разрушают и фракционируют сульфатом аммония. Образец диализуют и диализат центрифугируют. Жидкую часть хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-Целлофином, колонке с Фенил-Сефарозой, колонке с Сефадексом G-150 и колонке с Октил-Сефарозой. Получают и диализуют две фракции с ферментативной активностью. Диализат переносят на колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (Сенцу Пак VP-304-1251, Сеншу Кадану) и получают соответственно две субъединицы (альфа и бета). С помощью белкового секвенатора модели 470А прикладных биосистем определяют N-концевые аминокислотные последовательности альфаI^(H), бетаI^(H)-, альфаI(L)- и бетаI^(L) субъединиц, Аминокислотные последовательности приведены на Рис. 1.

(2) Получение ДНК-зонда К гену нитрил-гидратазы
В 100 мл среды 2хУТ, с содержащей 50 мкг/мл ампицилина, культивируют 12 ч при 30^oC E.coli JM105 (FERM BP-1937), содержащей pJUK121. Бактериальные клетки собирают и к ним добавляют TNE. Клеточную суспензию затем центрифугируют. 8 мл STE и 10 мг лизоцина добавляют к осадку. Смесь инкубируют 5 мин при 0^oC, после чего добавляют 4 мл 0,25 М ЭДТА. Затем к смеси при комнатной температуре прибавляют 2 мл 10% Na-DC и 5 мл 5 М NaCl. Полученную смесь инкубируют 3 ч при 0 4^oC и затем ультрацентрифугируют. К супернатану добавляют 1/2 объема ПЭГ 6000. Смесь инкубируют 12 ч при 0 - 4^oC и центрифугируют. К осадку добавляют TNE с добавлением объема до 7,5 мл, после чего к суспензии прибавляют C_sCl. Смесь центрифугируют с удалением белков. Затем к супернатанту добавляют 300 500 мг/мл этидий-бромида. Смесь переносят в центрифужную пробирку, пробирку герметизируют нагреванием и ультрацентрифугируют. С помощью перистальтического насоса экстрагируют ковалентно замкнутую кольцевую ДНК. К экстракту добавляют насыщенный водной изопропиловый спирт в количестве, несколько превышающем равное количество, для извлечения этидий-бромида. Образец диализуют по ТЕ и получают 3 мл очищенной плазмиды pYUK121.

pYUK121 ДНК гидролитически расщепляют с помощью Sph I и Sal I и получают фрагмент ДНК в 2,07 т.п. о. содержащий ген нитрил-гидратазы, происходящий из Rhodococcus N-774. Фрагмент радиометят ³²p с получением зонда. Нуклеотидная последовательность зонда приведена на фиг.2.

(3) Получение фрагмента ДНК, содержащего хромосомный ген нитрил-гидратазы
В 100 мл среды (10 г/л глюкозы, 0,5 г/л KH₂PO₄, 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л MgSO₄ · 7H₂O, 1 г/л дрожжевого экстракта, 7,5 г/л пептона, 0,01 г/л (CoCl₂, 7,5 г/л мочевины, 1% глицина или 0,3 мкг/мл ампицилина, 1 л воды, pH 7,2) культивируют Rhodococcus rhodochrous J-1. Бактериальные клетки собирают и промывают TNE. Затем суспендируют в 10 мл TE. К суспензии добавляют 4 мл 0,25 М ЭДТА; 10 20 мг лизоцима, 10 20 мг ахромопротеазы и 10 мл 10 х Na-Dc. Суспензию инкубируют 3 ч при 37^oC и затем к ней добавляют 15 мл фенола. Смесь инкубируют 15 мин при комнатной температуре и затем центрифугируют. Верхний слой удаляют и к надосадочной жидкости добавляют 0,7 мл 2,5 М ацетата натрия и диэтиловый эфир. Смесь центрифугируют и верхний слой отбрасывают. К нижнему слою добавляют два объма этанола и извлекают ДНЕ стеклянной палочкой. ДНК ополаскивают по 5 мин в каждом случае смесью ТЕ-этанол в отношениях 2:8, 1:9 и 0:9 (об./об.). Затем ДНК вновь суспендируют в 2 4 мл ТЕ (37^oC). К суспензии добавляют 10 мкл смеси РНКазы А и T₁ и смесь инкубируют при 37^oC. К смеси добавляют равное количество фенола, после чего центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют более, чем равное, количество эфира. Смесь вновь центрифугируют, верхний слой отбрасывают, а нижний слой сохраняют. Нижний слой диализуют около суток в 2 л ТЕ, содержащего небольшое количество хлороформа, и дополнительно диализуют в свежем ТЕ в течение 3 4 ч. Получают 4 мл сырой хромосомной ДНК.

К 15 мкл сырой хромосомной ДНК добавляют 10 мкл ТЕ, 3 мкл реакционного буфера (10x) и 2 мкл Sac I. Полученную смесь инкубируют час при 37^oC и подвергают электрофорезу на агарозном геле (60 B, 3 ч). Гибридизацию хромосомной ДНК до Саузерну проводят с применением зонда этапа (2). Найдено, что фрагмент размером примерно 6 т.п.о. характеризуется сильной гибридизацией.

15 мкл хромосомной ДНК гидролитически расщепляют с помощью NaCl и подвергают электрофорезу на геле агарозы по вышеприведенной методике. В геле вырезают фрагмент ДНК размером 6 т.п.о. переносят его в три объема 8 NaClO₄. После солюбилизации раствор наносят в виде пятна на фильтровальную бумагу GF/c (Ватман) диаметром 6 мм. К фильтровальной бумаге добавляют десять капель ( 100 мкл) ТЕ, содержащего 6 M NaClO₄, и затем десять капель ( 100 мкл) 95% этанола. Бумагу сушат 3 мин на воздухе и помещают в пробирку Эппендорфа. В пробирку добавляют 40 мкл ТЕ и инкубируют 30 мин при 47^oC. Затем пробирку центрифугируют. В результате получают около 40 мкл надосадочной жидкости с фрагментом ДНК 6 т.п.о. содержащим ген нитрилгидратазы хромосомной ДНК.

Ниже приводится способ внедрения в вектор фрагмента ДНК в 6 т.п.о.

(4) Внедрение в вектор фрагмента хромосомной ДНК
К 10 мкл pUC19 добавляют 10 мкл TE, 3 мкл реакционного буфера (10х) и 2 мкл SacI и смесь инкубируют 1 ч при 30^oC. Затем для прекращения реакции к смеси прибавляют 2 мкл 0,25 m ЭДТА. После этого к смеси прибавляют 7 мкл Трис-HCl (1M, pH9) и 3 мкл бактериальной щелочной фосфатазы (БШФ). Смесь инкубируют 1 ч при 65^oC и затем прибавляют ТЕ до полного объема в 100 мкл. Смесь трижды экстрагируют равным количеством фенола. К экстракту добавляют равное количество эфира. Нижний слой отделяют и к нему прибавляют 10 мкл 3 M ацетата натрия и 250 мкл этанола. Смесь инкубируют 30 мин при -80^oC, центрифугируют, сушат и вновь суспендируют в ТЕ.

Смешивают 5 мкл полученной в результате ДНК pUC19 и 40 мкл фрагмента ДНК в 6 т.п.о. этапа (3). К смеси добавляют 6 мкл буфера легирования, 6 мкл АТФ (6 мг/мл) и 3 мкл T4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 12 ч при 4^oC получением рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагмент ДНК в 6 т.п.о. кодирующий целевой фермент в SacI сайте pUC19.

(5) Трансформация и отбор трансформантов
10 мл среды 2хУТ инокулируют E.col:TGI/Амершам) и инкубируют 12 ч при 37^oC. После инкубирования полученную культуру прибавляют к свежей культуре 2хУТ до концентрации 1% и полученную смесь инкубируют два часа при 37^oC. Культуру центрифугируют и осадок суспендируют в 5 мл холодного 50 мМ раствора CaCl₂. Суспензию оставляют на 40 мин на льду и затем центрифугируют. К осадку добавляют 0,25 мл холодного 50 мМ раствора CaCl₂ и 60 мкл рекомбинантной ДНК этапа (4). Смесь инкубируют 40 мин при 0^oC, подвергают тепловому шоку в течение 2 мин при 42^oC, 5 мин выдерживают на льду и прибавляют к 10 мл среды 2хУТ. Смесь инкубируют 90 мин при 37^oC со встряхиванием и затем центрифугируют. Твердую часть суспендируют в 1 мл среды 2xУТ и две аликвоты по 10 мкл суспензии наносят на 2xУТ агаровую пластинку, отдельно содержащую 50 мкг/мл ампицилина. Пластинку инкубируют при 37^oC. Выращенную на пластинке колонию отбирают методом гибридизации колонии, а именно колонию переносят на нитроцеллюлозный фильтр и гидролитически расщепляют. ДНК фиксируется на фильтре и гибридизируется с зондом этапа (2). Фильтр подвергают радиоавтографии и затем отбирают рекомбинантную колонию. Кроме того, присутствие гена нитрил-гидратазы в трансформате подтверждено методом гибридизации Саузерна.

(6) Выделение и очистка рекомбинантной плазмиды и конструирование рестрикционной карты внедренного фрагмента ДНК
Отобранный на этапе (5) трансформант выращивают 12 ч при 37^oC в 100 мл среды 2хУТ, содержащей 50 мкг/мл ампицилина. Бактериальные клетки собирают и к ним добавляют TNE. Клетки вновь собирают центрифугированием и к ним добавляют 8 мл STE и 10 мг лизоцима. Смесь инкубируют 5 мин при 0^oC и затем добавляют 4 мл 0,25 М ЭДТА, 2 мл 10% NaDC (при комнатной температуре) и 5 мл 5 М NaCl. Смесь инкубируют 3 ч при 0-4^oC и ультрацентрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют 1/2 объема 30% ПЭГ 6000, полученную смесь инкубируют 12 ч при 0-4^oC и вновь центрифугируют. К осадку добавляют TNE с доведением объема до 7,5 мл. Для удаления белков к суспензии прибавляют CsCl. Затем к надосадочной жидкости добавляют 300-500 мг/мл этидий-бромида и смесь переносят в центрифужную пробирку. Пробирку герметизируют нагреванием и ультрацентрифугируют. С помощью перисталтического насоса удаляют ковалентно замкнутую непрерывную кольцевую ДНК, к которой для удаления этидий-бромида добавляют несколько больше, чем равное количество изопропилового спирта, насыщенного водой. Образец ДНК диализуют в ТЕ с получением около 3 мл очищенной рекомбинантной ДНК. Полученная в результате рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент ДНК в 6,7 т.п.о. обозначена как pNHJIOH.

Полученную плазмидную ДНК гидролитически расщепляют с помощью ECORI, BamHI, PstI, SacI, SalI. Сконструированная рестракционная карта приведена на фиг.6.

(7) Секвенирование ДНК
Положение гена нитрил-гидратазы в фрагменте ДНК плазмиды pNHJIOH определяют в соответствии с конструированными рестрикционными картами и методом гибридизации Саузерна. Добавочный сегмент в pNHJIOH отщепляют с помощью PstI и SalI с получением из фрагмента ДНК в 6 т.п.о. фрагмента в 1,87 т.п.о.

Полученный фрагмент ДНК секвенируют по методике Зангера (Sauger F, Science 214, 1205-1210 (1981)) (с использованием фагового вектора М13. Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК в 1,97 т.п.о (pNHJIOH) и приведена на фиг.7.

Аминокислотная последовательность, отслеженная из нуклеотидной последовательности, как было найдено, оказалась полностью идентичной аминокислотной последовательности, определенной на этапе (1). Анализ последовательности, кроме того, выявил, что фрагмент ДНК содержит последовательность, кодирующую альфа и бета субъединицы.

(8) Получение и очистка нитрил гидратазы
Рекомбинантный штамм E.coIi, содержащий pNHJIOH, был культивирован аэробно в 10 мл, 2хУТ среды, содержащей 30 мг/мл ампицилина в 50 мл пробирке при 30^oC, и затем перенесен в 10 мл такой же среды в 500 мл качающуюся колбу с CoCl 26H20 (0,001% вес/объем) и мочевиной (0,75% вес/объем). После перемешивания при 30^oC IPIG был добавлен до конечной концентрации 1 миллимоль для индуцирования Lac промотора. После дополнительных 10 часов культивации клетки были собраны центрифугированием, суспендированы в 0,1 M HCPCO буфера (pH 7,5), разрушены путем обработки звуком в течение 10 мин (219 кГц, изонатор модель 201 М, Кубота, Токио, Япония) и центрифугированы при 12,00 х г/мин.

Полученную надостаточную жидкость используют для ферментативного анализа и подвергают дальнейшей очистке. Ферментивное испытание проводят в реакционной смеси (12 мл), содержащей 50 мМ калийфосфатного буфера (pH 7,5), 6 мМ бензонитрила и необходимое количество фермента. Реакцию осуществляют в течение 30 мин при 20^oC и прекращают добавлением 0,2 мл IM HCl. Количество образовавшегося в реакции бензамида определяют с помощью ВЭЖХ. Для контроля используют смесь, приготовленную по вышеприведенной методике, но из E.col: TG-1. Уровень нитрил-гидратазной активности в бесклеточных экстрактах E.col: cpNHJIOH составляет 1,75·10^-3 единиц/ мг при культивировании в среде 2хУТ в присутствии CoCl₂ и ИПТГ. В реакционной смеси TG-1/ pNHJIOH обнаружен бензамид, в то время в реакционной смеси TG-1 бензамид не обнаружен.

Для дальнейшей очистке полученную надосадочную жидкость фракционируют сульфатом аммония (30-60% масса/объем) и диализуют в 0,01 M Hepes буфере (pH 7,5). Отдиализованный раствор, наносят на колонку DEAESephacel (Pharmahim, Sweden) уравновешенную буфером 0,1 М Hepes (pH 7,5), содержащим 0,1 М хлорид калия, отмывают 0,1 М Hepes (pH 7,5), содержащим 0,2 М хлорида калия, и элюируют 0,1 М Hepes (pH 7,5), содержащим 0,3 М хлорида калия. Активные фракции выбирают, диализуют против буфера 0,1 М Hepes (pH 7,5). Раствор, содержащий фермент, наносится на колонку Phenil-Sepharose CL-4B (Pharmacia), уравновешенную буфером 0,1 М Hepes (pH 7,5), содержащим 10% насыщенного сульфата аммония. Колонка была отмыта в том же самом буфере и элюировна тем же буфером с обратным градиентом концентраций сульфата аммония (7,5-0%). Активные фракции далее собирают, наносят на колонку сверхтонкого разделения Sephacryl-s-300 и элюируют буфером 0,1 М Hepes(pH 7,5), содержащим 0,5 М хлорида калия. Активные фракции собирают, преципитируют 60% насыщенным сульфатом аммония и диализуют в буфере 0,1 М Hepes (pH 7,5).

Формула изобретения

1. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, полученный клонированием гена нитрил-гидратазы из Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM ВР-1478), включающий следующую нуклеотидную последовательность: α^(H)-субъединица:

Β^(Н)-субъединица:

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pNHJION, кодирующая полипептид со свойствами нитрилгидратазы, содержащая SacI-SacI фрагмент с геном нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous J-1 ВР 1478 размером 6,0 т.п.о. SacI-SacI-фрагмент вектора pUC 19 размером 2,686 т.п.о. уникальные сайты рестрикции: 2 сайта Sac 1; 2 сайта SalI, 1 сайт Bam Н1 и 1 сайт PSt1; генетический маркер; Amp^v ген резистентности к ампициллину.

3. Штамм бактерий Escherichia coli FERM ВР-2777 (TG1/pNHJIOH) продуцент полипептида со свойствами нитрилгидратазы.

4. Способ получения полипептида со свойствами нитрилгидратазы, предусматривающий культивирование штамма, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что культивируют штамм бактерий Escherichia coli FERM ВР-2777 (TGI/pNHJ IOH).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14