Способ подготовки биологического образца к гистологическому исследованию

 

Использование: в медицине, в частности в гистологии и может применяться в гистологических исследованиях биологических образцов (тканей, органов), взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии. Сущность изобретения: исследуемый образец обезвоживают в изопропиловом спирте с последующим его парафинированием. При этом в изопропиловый спирт добавляют 0,01-0,5 мас. % поверхностно-активного вещества, преимущественно неионогенного. Способ позволяет сохранить тканевые и клеточные структуры образца в процессе его подготовки к гистологическому исследованию. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологическим исследованиям биологических образцов тканей, взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии.

Обычная подготовка тканей к гистологическим исследованиям включает парафинирование образца ткани, получение среза парафинированного образца, укрепление его на предметном стекле и окрашивание. Парафинирование образца необходимо для предотвращения сминания тканей при получении среза и сохранения исследуемых тканевых и клеточных структур. Однако парафинирование тканей требует предварительного обезвоживания, т.к. содержащие воду ткани плохо или совсем не пропитываются парафином.

Обезвоживание тканей производят в жидкости, смешивающейся с водой; затем такую жидкость нужно заменить растворителем парафина, способным смешиваться с обезвоживающей жидкостью. Обычная процедура обработки тканей включает выдерживание их в нескольких порциях обезвоживающей жидкости с последующим выдерживанием в нескольких порциях растворителя парафина и занимает от 12 до 72 ч в зависимости от используемых пар жидкостей, свойств биологической ткани, размеров исследуемого образца и других условий.

Известен способ [1] подготовки биологического образца к гистологическому исследованию, включающий последовательное вымачивание образца в порциях 70% этилового спирта в течение 16 ч, 85% этилового спирта в течение 8 ч, 95% этилового спирта в течение 16 ч, 100% этилового спирта в течение 2 ч, смеси 100% этилового спирта с бензилом в соотношении 1:1 в течение 1 ч, в двух порциях бензола по 30 мин и последующее парафинирование. В качестве растворителя парафина, кроме бензола, можно использовать толуол, ксилол, петролейный эфир, сероуглерод, хлороформ и четыреххлористый углерод.

Кроме очень большой длительности обезвоживания (43 ч), способ [1] имеет тот недостаток, что все используемые в нем растворители парафина вредные вещества, особенно при постоянной с ними работе, поскольку их вредность имеет кумулятивный характер.

Также известен способ [2] подготовки биологических образцов к гистологическому исследованию, включающий обезвоживание путем четырехкратной выдержки в течение 20 минут в порциях свежего ацетона с последующими выдержками в бензоле и парафинированием.

Однако такой ускоренный способ применим только в случае, когда требуется экспресс-анализ, поскольку обработка ацетоном приводит к значительному нарушению тканевых и клеточных структур. Кроме того, ацетон не менее вреден, чем бензол или хлороформ.

Также известен способ [3] подготовки биологических образцов к гистологическому исследованию, включающий обезвоживание образцов 1,4-диэтиленоксидом (диоксаном) и последующее парафинирование. Диоксан одинаково хорошо смешивается как с водой, так и парафином, поэтому нет необходимости в обработке вторым растворителем для вытеснения обезвоживающего агента перед парафинированием, что заметно упрощает процесс.

Недостатком способа [3] является токсичность диоксана, имеющая к тому же кумулятивный характер, а также тот факт, что исследователь быстро перестает ощущать запах диоксана, что приводит к отравлениям.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ [4] подготовки биологических образцов к гистологическому исследованию, включающий обезвоживание образца в среде 99% изопропилового спирта с последующим его парафинированием. Как показано в [4] образцы можно подвергать парафинированию непосредственно после обезвоживания в изопропиловом спирте, не вытесняя его растворителем, хорошо смешивающимся с парафином, что значительно упрощает и удешевляет процесс.

Однако наши исследования показали, что при полном пропитывании парафином образца, обработанного по способу [4] на срезах наблюдается слабое расслоение коллагена и небольшие изменения жировой ткани по сравнению с образцами той же ткани, обработанными классическим способом [1] При исследовании образцов тканей, полученных при хирургических вмешательствах или при патолого-анатомических исследованиях подобные изменения, вызванные несовершенством способа, могут привести к неправильным выводам о состоянии ткани и вызвавших его причинах.

Целью предлагаемого изобретения является сохранение тканевых и клеточных структур биологического образца в процессе его подготовки к гистологическому исследованию при сохранении высокой производительности этого процесса.

Указанная цель достигается тем, что в способе подготовки биологических образцов к гистологическим исследованиям, включающем обезвоживание образца в изопропиловом спирте с последующей пропиткой образца парафином, в используемый для обезвоживания изопропиловый спирт вводят поверхностно-активное вещество в количестве 0,01-0,5 мас. В качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) лучше использовать неионогенные ПАВ, такие как оксиэтилированные эфиры ангидросорбита и жирных кислот, алкилфеноловые эфиры полиэтиленгликолей и др. однако возможно использование катионных ПАВ, таких как алифатические амины (моноалкиламины), диаминодиолеат или алкилтриметиламмонийхлорид, и анионных ПАВ, таких как кальций алкилбензосульфонат. Ограничением в выборе ПАВ служит растворимость этих веществ в изопропиловом спирте. Наилучший результат достигнут при использовании алкилфеноловых эфиров полиэтиленгликолей или оксиэтилированных эфиров ангидросорбита и жирных кислот.

Алкилфеноловые эфиры полиэтиленгликолей производит немецкая фирма Merck Co, например монооктилфениловый эфир полиэтиленгликоля общей формулы C₁₄H₂₁O(C₂H₄O)_nH, где n=9-10, под наименованием Triton X-100.

Оксиэтилированные эфиры ангидросорбита и жирных кислот производит американская фирма Sigma Chemical Co; полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат выпускается ею под наименованием Tween-20, полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеат под наименованием Tween-80.

Концентрация ПАВ в изопропиловом спирте должна быть 0,01-0,5 мас. При более низкой или более высокой концентрации ПАВ эффект не достигается.

Используемый в предлагаемом изобретении изопропиловый спирт выпускается промышленностью (ТУ 6-09-402-85).

Нами использовался гомогенизированный парафин с температурой плавления около 56^oC, также выпускающийся промышленностью (ТУ 6-09-4112-75).

Для подготовки образцов к гистологическим исследованиям может быть использовано любое обычно применяемое лабораторное оборудование, в том числе выпускающиеся промышленностью установки.

Обработанные согласно предлагаемому способу образцы сравнивали с обработанными по способу [4] Пример 1 (контрольный). Фрагменты кожи человека размером 1,0х1,0х0,5 см взяты при вскрытии с передней поверхности брюшной стенки. Фрагменты фиксированы в 4% растворе формальдегида в фосфатном буфере в течении 24 ч и отмыты проточной водой в течении 30 мин. Для обезвоживания фрагменты кожи последовательно выдерживали в 4-х сменах 99% изопропилового спирта по 3 часа в каждой смене. Обезвоженные фрагменты пропитаны парафином (T_пл.=56^oC) выдержкой в двух сменах расплавленного парафина по 2 ч.

Срезы толщиной 5 мкм изготавливали с помощью санного микротома. Помещенные на предметное стекло срезы депарафинировали в 2-х сменах ксилола, окрашивали гематоксилином-эозином и трихромом по Массону. Срезы исследовали под микроскопом при увеличении от 40Х до 1200Х.

Состояние образца хорошее, то есть при полном пропитывании парафином наблюдается, однако, слабое расслоение коллагена и небольшие изменения жировой ткани.

Примеры 2-5. Образцы той же кожи, что и в примере 1, обезвоживали в 99% изопропиловом спирте, в который были добавлены ПАВ тип ПАВ и его количество указаны в таблице.

Парафинирование, приготовление срезов, их обработка и исследование как в примере 1. Результаты микроскопического исследования приведены в таблице.

В таблице степень сохранности структуры тканей в срезах оценивалась в баллах. При этом отсутствие повреждений тканевых и клеточных структур оценивали в 5 баллов; возникновение повреждений, не препятствующих оценке структур, оценивали в 4 балла; существенные повреждения, местами искажающие структуру некоторых тканей в образце, оценивали в 3 балла; выраженные повреждения тканей, делающие образец малопригодным для исследования оценивали в 2 балла.

Как видно из таблицы, ткани, подготовленные заявляемым способом, сохраняют тканевые и клеточные структуры изучаемого образца, что исключает появление диагностических ошибок, приводящих к неправильным выводам о состоянии тканей и вызвавших его причинах.

Источники информации 1. Р. Лилли Патогистологическая техника и практическая гистохимия. M. Мир, 1969, гл. 4.

2. Там же.

3. Tannenberg. Am.J.Clin. 1949, 19, p. 1061.

4. Hauser. Mikroscopie, 1952, I, p. 208 прототип.

Формула изобретения

1. Способ подготовки биологического образца к гистологическому исследованию, включающий обезвоживание образца в изопропиловом спирте с последующим пропитыванием обезвоженного образца парафином, отличающийся тем, что в используемый для обзвоживания изопропиловый спирт вводят поверхностно-активное вещество в количестве 0,01 0,5 мас.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве поверхностно-активного вещества используют неионогенное поверхностно-активное вещество.

РИСУНКИ

Рисунок 1