Соли 2-дезокси-2-амино (или 2-метиламино)-d-глюкозы с n- акридонуксусной кислотой, обладающие противомикробной активностью

 

Заявляются синтетические биологически-активные соединения, относящиеся к классу производных аминосахаров. Соли 2-дезокси-2-амино (или 2-метиламино)-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой, общей формулы, приведенной в тексте описания, где R = -H или -CH₃, обладающие противомикробной активностью. Предложенны химическая и структурная формулы, примеры синтезов и результаты биологических испытаний на моделях бактерий ДНК- и РНК-содержащих вирусов. 4 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к синтетическим биологическиактивным соединениям, относящимся к классу производных аминосахаров.

Соли 2-дезокси-2-амино (или 2-метиламино)-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой общей формулы где R= -H или -CH₃ Оба предлагаемых соединения обладают выраженным действием в отношении ряда патогенных микроорганизмов: ДНК- и РНК-геномных вирусов, а также способны устранять резистентность грамположительных и грамотрицательных бактерий к действию антибиотиков различных классов.

Основным компонентом (катион) заявляемых соединений является 2-дезокси-2-амино (или 2-метиламино)-D-глюкоза.

Уровень техники.

Известно, что аминосахарами называют производные углеводов, содержащие вместо одного или нескольких спиртовых гидроксильных групп амино- или аминоалкильные группы.

Самую многочисленную группу природных аминосахаров, имеющих важнейшее биологическое значение, составляют 2-дезокси-2-амино-гексоальдозы.

Они являются структурными компонентами гликопротеидов, мукополисахаридов, аминополисахаридов и ряда антибиотиков (аминогликозиды).

Наибольшее биологическое значение имеет 2-дезокси-2-амино-D-глюкоза (хитозамин) и 2-дезокси-2-метиламино-D-глюкоза (метилхитозамин) [1] Известно, что оба из перечисленных аминосахаров принимают участие в ключевых этапах клеточного метаболизма. Так, фруктозо-6-фосфат при взаимодействии с глютамином переходит в 2-дезокси-2-амино-глюкозо-6-фосфат. Это соединение, взаимодействуя с ацетилкоэнзимом А, превращается в 2-дезокси-2-ацетиламиноглюкозо-6-фосфат, который изомеризуется в 2-дезокси-2-ацетиламино-глюкозо-1-фосфат, и в дальнейшем, через ряд стадий, образует N-ацетилмурамовую и N-ацетилнейраминовую кислоты, являющихся индукторами образования интерлейкина-2 (Т-клеточный ростовой фактор), являющегося ключевым фактором иммунного ответа при инфицировании микроорганизмами [2,3] Оба названных аминосахара принимают прямое участие в синтезе глютаминсинтетазы, которая связывается с рядом промоторных участков ДНК микроорганизмов и активирует транскрипцию целого ряда генов (в том числе гена нитрогеназы), что нарушает целостность оболочки бактерии и, следовательно, ее жизнеспособность [4] Важнейшее биологическое значение природных амино(алкиламино)гексоз явилось предметом многочисленных исследований по созданию фармакологических препаратов на их основе. Хорошо известны, например, соли N-метилхитозана с полиеновым макролидным антибиотиком амфотерицином В (амфоглюкамин), а также с 5-метилурацилом (амиглурацил), нашедших широкое применение в медицинской практике [5] Вторым биологически активным компонентом (анион) является акридонуксусная кислота.

В 1972 году Fryer и Grunberg впервые обнаружили, что некоторые производные акридонов обладают выраженными противовирусными свойствами [6] В дальнейшем Inglot A.D. et al. показала, что натриевая соль N-акридонуксусной кислоты обладает интерферониндуцирующей активностью в опытах на мышах [7] Проведенные дополнительные исследования позволили создать на основе акридонуксусной кислоты высокоактивные медицинские препараты: камедон и его структурный аналог неовир [8-11]
Работы, проведенные в 1991-1994 году, позволили обнаружить крайне интересную особенность: N-акридонуксусная кислота и /или ее соли при сочетанном использовании с различными моносахаридами, как со свободными функциональными группами, так и снабженными защитой, резко изменяют свои свойства, в ряде случаев приобретая новые виды фармакологической активности, не свойственные компонентам, взятым в отдельности [12]
Интересна попытка авторов Международной заявки на патент N PCT/RU 94/00032 [13] получить соединение акридонуксусной кислоты с 1-дезокси-1-метиламиногексозой. Авторы патентуют N-метил-N-/α,Δ -глюкопиранозил/аммония-2/-акридон-9-он-10-ил/ацетат, названный ими циклоферон, обладающий по их данным интерфероногенной, противовирусной, в том числе анти-ВИЧ, антипаразитарной, антипромоторной, радиопротективной активностью, формулы

Это соединение является наиболее близким структурным аналогом описываемых соединений.

Предлагаемое авторами прототипа соединение идентично заявляемым соединениям своим акридоновым фрагментом, но резко отличается строением углеводного компонента, так как использована 1-дезокси-1-метиламина- гексоза. Известно, что аминосахара 1-дезокси-1-метиламиногексозы в природе не встречаются, крайне нестабильны в растворах, относительно высокотоксичны и крайне дороги. Синтез этих соединений из природных гексоз (глюкоза, галактоза) включает ряд трудоемких стадий, протекающих с низкими выходами и в жестких условиях. Кроме того, пути метаболизма этого соединения в клетке совершенно не изучены [14, 15]
Задачей изобретения является получение новых химических соединений - производных природных 2-дезокси-2-амино (или 2-алкиламино)-D-глюкозы, обладающих выраженной антимикробной активностью: в отношении ДНК- и РНК-геномных вирусов, а также обладающих способностью устранять резистентность грамположительных и грамотрицательных бактерий к действию антибиотиков различных классов и обладающих более низкой токсичностью, а также более высокой стабильностью в растворах и меньшей трудоемкостью синтеза, чем прототип.

Сущность изобретения.

Поставленная задача решается синтезом новых химических соединений, а именно солей 2-дезокси-2-амино (или 2-метил-амино)-D-глюкозы, общей формулы

где R= -H или -CH₃
Известно, что один из фрагментов молекулы: 2-дезокси-2-амино-D-глюкозу и 2-дезокси-2-метиламино-D-глюкозу в настоящее время получают в промышленных масштабах, гидролизуя хитин (панцири крабов и других ракообразных) в щелочных условиях, с выходом конечных продуктов более 80% [16]
Физико-химические свойства этих аминосахаров хорошо изучены [17, 18]
2-Дезокси-2-амино-D-глюкоза и ее N-метильный аналог разрешены к использованию в медицине, где нашли широкое применение [5]
Второй фрагмент заявляемых соединений (анион): N-акридонуксусная кислота, также производится в промышленных масштабах и разрешена к медицинскому применению [10-13]
Синтез заявляемых соединений осуществляется путем солеобразования за счет существенно разных кислотно-основных свойств. Известно, что такие соединения из-за слабовыраженных кислотно-основных свойств обычно крайне нестабильны в растворах, поэтому изготовление лекарственных форм на их основе считалось невозможным. В процессе проведенных заявителями исследований неожиданно обнаружилось, что использованные соединения 2-дезокси-2-амино(или 2-метиламина)-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой позволили получить устойчивые при длительном хранении (более 2 лет) водные растворы заявляемых солей, обладающих всеми фармакологическими свойствами прототипа и, кроме того, значительно более высокой противовирусной активностью, а также новым свойством: способны устранять резистентность грамположительных и грамотрицательных бактерий к действию антибиотиков различных классов.

При этом разработанные заявителями методы синтеза более экономичны, чем у прототипа.

Сущность изобретения поясняется двумя примерами синтеза и четырьмя таблицами биологических испытаний.

Пример 1. Способ синтеза соли 2-дезокси-2-амино-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой.

Пример 2. Способ синтеза соли 2-дезокси-2-метиламина-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой.

Таблица 1. Противовирусная активность заявляемых препаратов, камедона и прототипа при венесуэльском энцефаломиелите лошадей в опытах на белых мышах.

Таблица 2. Защитное действие заявляемых препаратов, камедона и прототипа на модели оспенной инфекции у хлопковых крыс.

Таблица 3. Влияние заявляемых препаратов и прототипа на течение пневмококковой пневмонии у белых мышей.

Таблица 4. Влияние заявляемых препаратов и прототипа на течение колисепсиса у мышей.

Спектры ЯМР H¹ и C¹³ измеренные на спектрометре Bruker-200 и подтверждающие строение полученных соединений, могут быть дополнительно предоставлены по запросу экспертизы.

Пример 1. 100 г N-акридонуксусной кислоты растворяют в 480 мл горячего абсолютного этилового спирта, небольшими порциями при интенсивном перемешивании вносят 71,15 г 2-дезокси-2-амино-D-глюкозы. Полученный светло-желтый раствор кипятят с обратным холодильником в течение 20 минут, охлаждают до 5^oC, фильтруют. Осадок на фильтре промывают 150 мл холодного абсолютного этанола, высушивают в вакууме при температуре 65-70^oC. Получают 157,5 г (выход 92% ) светло-желтого кристаллического осадка -соли 2 -дезокси-2-амино-D-глюкозы с N-акридонуксуской кислотой. При использовании исходных компонентов чистоты не ниже 98% полученное соединение не нуждается в перекристаллизации.

Соль 2-дезокси-2-амино-D-глюкозы с N-акридонуксуской кислотой не имеет четкой температуры плавления, выше 130^oC медленно обугливается.

Для характеристики чистоты синтезированного соединения наиболее удобен метод УФ-спектроскопии. Проведенные исследования показали, что при чистоте соединения 99,5% коэффициент удельной экстинкции E^1%_1см составляет 200±1.

Молекулярная масса: 432, 43
Брутто-формула: C₂₁H₂₄N₂O₈
Элементный анализ:
Вычислено, C 58,33 H 5,59 N 6,48
Найдено, C 58,37; H 5,62; N 6,42
Данные ЯМР (характеристические сигналы) H1 DMSO d6:
7,3-8,4 м. д. область сигналов ароматической гетероциклической системы акридона (8 H);
4,9 м.д. (s, 2H) сигнал протонов N-метиленкарбоксизаместителя;
4,45 м.д. (d, 1H)- сигнал H1 протона аминосахара;
3,1 м.д. (d, 2H)- сигнал H6 протонов аминосахара;
C13 DMSO (d6):
176,75 171,18 м.д. карбонильный и карбоксильный атомы углерода N-акридонуксусной кислоты;
93,92 м. д. атом углерода в аминосахаре с полуацетальной гидроксильной группой;
50,32 м.д. атом углерода в аминосахаре, связанный с аминогруппой.

LD 50 (внутривенно, белые мыши) составляет 620 мг/кг.

Пример 2. 150 г N-акридонуксусной кислоты растворяют при кипячении в 520 мл 95% этанола. Во избежании перегрева, мелкими порциями, в течение 15 мин вносят 115 г 2-дезокси-2-метиламино-D-глюкозы. Полученную смесь кипятят с обратным холодильником 30 мин и затем охлаждают до температуры 0-2^oC. При этом образуется нижний слой густого темно-желтого маслообразного продукта. Верхний спиртовый бесцветный слой, практически не содержащий продукта реакции, декантируют, маслянистый остаток промывают 2 раза абсолютным этанолом и 1 раз этилацетатом, затем высушивают в вакууме при температуре не более 90^oС. Получают 235 г (выход 89%) желтого, прозрачного, стеклообразного, твердого, гигроскопичного продукта соли 2-дезокси-2-метиламино-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой. Полученное соединение перекристаллизовывают из абсолютного этанола.

Температура плавления выше 85^oC медленно разжижается.

Удельный коэффициент экстинкции E^1%_{1 см} 194±1
Брутто-формула C₂₂H₂₆N₂O₈
Молекулярная масса: 446,46
Элементный анализ:
Bычислено, C 59,19 H 5,87; N 6,27
Hайдено, C 59,11; H 5,85 N 6,23
Данные ЯМР (характеристические сигналы) H1 DMSO d6
7,2-8,4 м. д. область сигналов ароматической гетероциклической системы акридона (8H);
4,85 м.д. (s, 2Н) сигнал протонов N-метиленкарбоксизаместителя;
4,85 м.д. (d, 1H)- сигнал H1 протона аминосахара;
2,4 м.д. (s, 3H)- сигнал протонов N-CH₃ группы аминосахара;
C13 DMSO (d6):
176,78 171,26 м.д. карбонильный и карбоксильный атомы углерода N-акридонуксусной кислоты;
116,47 м. д. атом углерода в аминосахаре с полуацетальной гидроксильной группой;
50,55 м.д. атом углерода в аминосахаре, связанный с аминогруппой;
33,04 м.д. атом углерода в N-CH₃ группе.

LD 50 (внутривенно, белые мыши) составляет 580 мг/кг.

Промышленная применимость.

В опытах по определению биологической активности использовали 10% стерильные водные растворы препаратов: соединений соли 2-дезокси-2-амино-D-глюкозы(1) и соли 2-дезокси-2-метил-амино-D-глюкозы (2), а в качестве препаратов сравнения использовали камедон в виде 12,5% водного раствора производства НИФ "Медитэр" и циклоферон (прототип) в виде 12,5% водного раствора производства ТОО "Полисан". Оба препарата сравнения были приобретены в ветеринарной аптечной сети Санкт-Петербурга.

Изучение противовирусной активности заявляемых соединений: (1) соли 2-дезокси-2-амино-D-глюкозы и (2) соли 2-дезокси-2-метиламино-D-глюкозы проводилось на модели экспериментального энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ).

Эксперименты выполнены на неинбредных белых мышах-самцах массой 16-18г. Возбудитель ВЭЛ вводили в дозе 6 и 60 ЛД50 Препараты (1) и (2) применяли подкожно в дозе 50 мг/кг, по профилактической (-4 ч до заражения), лечебной (+2 ч после заражения) и лечебно-профилактической (-4 ч +72 ч +144 ч) схемам, в качестве препаратов сравнения использовали камедон и циклоферон. Эффективность противовирусного действия препаратов оценивали по уровню гибели мышей. Результаты эксперимента представлены в табл.1
Как следует из представленных данных, препараты (1) и (2) обладают выраженным защитным эффектом при экспериментальном ВЭЛ, особенно при профилактическом назначении в этом случае они значительно превосходят препараты сравнения камедон и циклоферон.

Влияние заявляемых препаратов на течение экспериментальной оспенной инфекции.

Опыты проведены на экспериментальной ортопоксвирусной инфекции. В опытах использовали крыс-самцов массой 50-70 г, вирус вводили интраназально. Заражение животных проводили постоянной дозой вируса, равной 10LD50.

Препараты вводили крысам внутримышечно и подкожно в дозе 50 мг/кг за 4 ч до и на вторые сутки после заражения лабораторных животных.

Препараты (1) и (2) использовали в виде 10%-ных стерильных растворов. В каждом опыте в качестве референс-препарата использовали рибамидил (виразол), который давали крысам перорально в дозе 100 мг/кг по стандартной лечебно-профилактической схеме. Полученные данные представлены в табл. 2.

Из представленных данных можно сделать вывод, что заявляемые препараты проявляют более высокую, чем препараты сравнения, противовирусную активность, защищая до 80% зараженных хлопковых крыс.

Изучение защитных свойств заявляемых препаратов и прототипа при экспериментальной пневмонии.

В работе использовали мышей-самцов массой 18-20г. Животных заражали интраназально пневмококком серотипа 1 (штамм 395,) в дозе -5·10⁶ микробных клеток на мышь.

1. Препараты (1), (2) и препарат сравнения циклоферон вводили в дозе 50 мг/кг подкожно. Курс лечения по лечебно-профилактической схеме: (-4; +48; +120).

2. Препараты использовали в тех же дозах, но в сочетании с гентамицином. Антибиотикотерапию начинали через 1 сут. после инфицирования мышей пневмококком, препарат вводили внутримышечно в течение 8 суток в дозе 5 мг/кг.

Установлено (табл. 3), что заявляемые препараты, взятые в отдельности, практически не оказывают влияния на течение пневмококковой инфекции у мышей, однако в комбинации с гентамицином достоверно повышают защитное действие этого антибиотика. Препарат циклоферон (прототип) не оказывал влияния как в отдельности, так и в сочетании с антибиотиком.

Оценка активности заявляемых соединений и прототипа на модели острого колисепсиса белых мышей.

Белых мышей весом 16-18 г заражали внутрибрюшинно кишечной палочкой штамм 60 в дозе 1 LD 100.

1. Препараты (1), (2) и препарат сравнения циклоферон вводили внутримышечно в дозе 100 мг/кг. Курс лечения по лечебно-профилактической схеме: (-48; -24; +2).

2. Препараты использовали в тех же дозах, но в сочетании с внутримышечным введением антибиотика ампициллина в дозе 5 мг/мышь.

Установлено (табл. 4), что заявляемые препараты, взятые в отдельности, оказывают влияние на течение инфекции у мышей, снижая летальность до 60-70% Микробиологическое изучение обсемененности внутренних органов опытных и контрольной групп показывают, что профилактическое и лечебное действие заявляемых препаратов способствуют санации селезенки и почек от кишечной палочки.

В комбинации с ампициллином препараты (1) и (2) достоверно повышают защитное действие этого антибиотика, снижая летальность до 20% Препарат циклоферон (прототип) не оказывал влияния как в отдельности, так и в сочетании с антибиотиком.

Таким образом, из представленных примеров и результатов биологических испытаний следует, что достоинствами заявляемых лекарственных средств: соли 2-дезокси-2-амино-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой и соли 2-дезокси-2-метиламино-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой, являются:
появление ярковыраженных новых свойств, отсутствующих у обоих компонентов, взятых в отдельности, таких как способность устранять резистентность грамположительных и грамотрицательных бактерий к действию антибиотиков различных классов;
широкий спектр фармакологической активности и отсутствие каких-либо побочных эффектов при длительном использовании;
растворы предлагаемых лекарственных средств исключительно стабильны при длительном хранении (срок наблюдения 2 года) и имеют значения pH, близкие к физиологическим (7,1-7,5);
получение данных лекарственных средств легко осуществимо в промышленных условиях, так как 2-дезокси-2-амино-D-глюкоза, и 2-дезокси-2-метиламино-D-глюкоза и N-акридонуксусная кислота производятся на ряде существующих фармацевтических производств;
пути метаболизма 2-дезокси-2-амино-D-гексоальдоз детально изучены и выяснено, что ни один из продуктов метаболизма этих соединений не является токсичным, а N-акридонуксусная кислота выводится из организма в неизмененном виде.

Таким образом, заявляемые соединения являются новыми неочевидными и промышленно применимыми, т.е. соответствуют всем требованиям, предъявляемым к изобретению.

Формула изобретения

Соли 2-дезокси-2-амино(или 2-метиламино)-D-глюкозы с N-акридонуксусной кислотой общей формулы


где R -H или -CH₃,
обладающие противомикробной активностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4