Способ агглютинации частиц для одновременного исследования нескольких аналитов в одном образце

 

Изобретение относится к стабильному кинетическому способу одновременного определения присутствия нескольких аналитов в одном образце среды на основе агглютинаци частиц. Способ предусматривает добавление отдельного реагента. Также описаны примеры качественного определения нескольких аналитов в образце пробы. 11 з.п. ф-лы, 18 ил.,1 табл.

Изобретение относится к методам количественного анализа нескольких аналитов в одном образце жидкой среды и биологического источника. Более конкретно изобретение связано с оптическими аналитическими способами, основанными на интенсивности агглотинирования частиц.

Точные, чувствительные и автоматизированные пробники необходимы для контроля наличия и количества биологических материалов, присутствующих в комплексных жидких средствах организма пациента при микромолярных или пикомолярных концентрациях для облегчения диагноза и лечения болезни.

Различные способы, используемые в прошлом, включают жидкостную и газовую хроматографию, масс-спектрометрию и многочисленные технологии биопроб и требуют значительных затрат времени, расходов и ручного труда.

Конкурирующие связующие протеиновые пробы, такие как пробы радиорецепторов и радиоиммунопробы, были созданы с существенно улучшенной аналитической чувствительностью и производительностью, однако они имеют недостатки, связанные с опасностью радиоактивных материалов, и не способствуют автоматизации. Хотя ферментно-связанные и хемилюминесцентно-связанные иммунопробы и ДНК-пробы исключают использование радиоактивных материалов, они не решают проблемы недостаточной автоматизации.

В последнее время разработано несколько иммунопроб на основе частиц для использования специфичности антительных реакций, тем самым избегая проблемы с радиохимическим мечением. Реакции агглютинации, включающие бивалентные антитела и антигены или вещества, представляющие клинический интерес, использовались в качестве визуальных или количественных проб с большим разнообразием бактерий, ячеек красной крови или полимерных частиц. Агглютинация происходит за счет роста комплексов антитело (АТ)-антиген (АГ) в виде связанных частиц для получения обширной структуры, которая может быть обнаружена, агглютинация может быть обусловлена добавлением соответствующего связующего партнера, либо АТ, либо АГ, к суспензии частиц с иммобилизованными АТ или АГ. При низких концентрациях специфического связующего партнера формируются малые комплексы, содержащие только несколько частиц. Диагностические исследования на базе этих частиц обычно основаны на достаточно специфических взаимодействиях АТ или АГ. АТ или АГ могли быть поглощены частицами полистирола субмикронных размеров, часто называемыми "однородными латексными частицами" (см. Бандс Л.В. Однородные латексные частицы, Индианаполис, Сереген, 1984). Эти чувствительные частицы затем воздействуют для усиления видимости реакции АТ или АГ, которые имеют место, когда образец содержит смесь АТ или АГ с соответствующими покрытыми частицами.

Коммерчески приемлемыми являются взвеси полимерных микрочастиц в коллоидном диапазоне размером 0,02-100 мкм по диаметру. Свойства этих частиц определены в основном физико-химическими свойствами этих поверхностей. Одиночная полистирольная латексная частица состоит из большого количества отдельных молекул полистирола (> 1000 даже для частицы такого малого размера, как частица диаметра 0,1 мкм), удерживаемых совместно силами притяжения Ван-дер-Вааля. Каждая полимерная молекула в частице имеет конечные функциональные группы, которые обычно являются гидрофильными и возникают из фрагмента композиции, использованной в качестве инициатора полимеризации (см. обзор Симана, G.V.F. Физико-химические свойства латексов при проведении латексных испытаний. Технология прикладных латексов в диагностике, Health & Science Commun, Вашингтон, D.C., 1990, с. 1-19).

Обычная форма полистирольных латексных частиц подвержена действию групп серной кислоты для стабилизации, однако различные другие функциональные группы могут быть введены на поверхность частицы, такие как гидроксильные, карбоксильные, аминовые и полимерные карбоксильные группы. Подобные группы частично имеют преимущества для связывания латексных шаровых поверхностей в широком диапазоне лигандов и рецепторов.

Хотя, как было замечено выше, размеры полистирольных микросфер, которые коммерчески приемлемы, охватывают диапазон от 0,02 мкм до примерно 100 мкм, размеры, используемые для серодиагностики, предпочтительно имеют величину в диапазоне от 0,1 до 1,0 мкм в диаметре. Все технические параметры зависят от размера частицы и монодисперсности. Осаждение только под действием гравитации может возникать при большем диаметре микросфер, хотя это не является основной проблемой в диапазоне размеров, использованных для проб агглютинации.

Непокрытые латексные частицы образуют относительно стабильные гидрофобные смеси из-за аналогичного заряда на всех микросферах. При использовании покрытия с лигандом, таким как АТ или ИГ, частицы образуют стабильную гидрофильную смесь, остающуюся дисперсной в процессе хранения, однако агрегатирующую при реагировании с дополнительным антилигандом, имеющим поперечные связи. Лиганды, использованные для покрытия латексных частиц, закреплены одним из трех способов: (I) физическим (пассивным) абсорбированием; (II) принудительным абсорбированием и (III) ковалентными связями.

Латексная агглютинация может быть использована либо для агглютинации, либо для агглютинации частиц. Обычно исследования на агглютинацию используются для детектирования АГ или относительно высокомолекулярных АГ, тогда как исследования на задержку агглютинации используются в основном для детектирования низкомолекулярных по весу АГ и также несколько больших АГ.

С помощью оптических инструментов, измеряющих переданный поглощенный, или рассеянный свет, можно количественно оценить степень агглютинации покрытых латексных частиц и разработать иммунопробы с чувствительными частицами. Интенсивность света, рассеянного частицами, диспергированными в воде, изменяется в зависимости от количества частиц, их диаметра, длины волны падающего света, угла детектора по отношению к падающему свету, и некоторых других переменных.

В начале процесса агглютинации одиночные частицы, во-первых, становятся дуплетами; количество мономерных рассеивающих свет частиц существенно падает, и быстро возрастает видимый диаметр агглютинатов. После этого изменения в количествах и диаметрах менее быстро. Важный аспект агглютинации частиц, описанный в изобретении, заключается в том, что интенсивность рассеянного света, измеренная как функция времени, может являться основой для очень чувствительных кинетических иммунопроб.

Несколько способов для количественного определения иммуномассивов частиц были уже описаны ранее. Такие инструменты, как счетчики Коултера® (Coulter Electronics, Hialeah, Fl), которые подсчитывают количество частиц или групп частиц в дискретных каналах, используют для последующей агглютинации. Поскольку агглютинируют частицы малых размеров, сигналы пропадают в одном канале и возникают в дальнейших каналах. Таким образом можно подсчитать одиночные частицы, когда уменьшается их количество, или подсчитать группы вновь агрегатированных частиц, когда возрастает их размер.

Можно использовать нефелометр для исследования рассеянного света непосредственно или спектрофотометр для измерения степени "поглощенности" света (измерение рассеянного света косвенно). Угловая анизотропия или динамическое рассеивание света либо спектроскопия фотонной корреляции являются более новыми способами, даже более мощными технологиями для количественного измерения агглютинации частиц.

Как было отмечено выше, традиционные оптические инструменты, такие как измерители замутненности или нефелометры, которые реагируют на разность рассеяния света между агглютинированными и неагглютинированными частицами, использовались ранее для количественных испытаний агглютинации латексных частиц. Хотя эти способы сохраняют преимущество манипулирования гомогенной реагирующей смесью без необходимости отдельного этапа разделения, они удовлетворительны только для одиночных испытаний и не удовлетворительны для нескольких одновременных количественных исследований агглютинации латексных частиц, что является объектом изобретения.

Рассеиватель света от объемного раствора агрегатирующих или диссоциирующих иммуномассивов может быть использован для обеспечения количественных измерений концентраций анализируемого вещества. Измерители замутненности производят измерение прохождения света через суспензию агрегатов частиц, а нефелометры непосредственно измеряют рассеянный свет в заданных направлениях. В обоих примерах рассеиватель света от смешанной популяции как агрегатированных, так и не агрегатированных частиц подвергался измерению (см. например, нефелометр марки LPIA® фирмы "Мицубиси кемикал инд.", Токио, который способен, однако, анализировать только один аналит в данный момент времени; Канмейер и др. , патент США N 4305925, который описывает нефелометрический способ, где использованы частицы двух различных размеров для увеличения полезного диапазона латексной агглютинации иммунопробы одиночного аналита; а также Зайг и др. патент РСТ 90/08961, который описывает нефелометрический количественный иммуномассив, использующий координированные частицы носителя, составляющие сополимерные материалы для детектирования одиночного аналита. Отсутствует очевидный путь расширения этих патентов для использования с частицами множества размеров при одновременном измерении различных аналитов.

Хорошо известно, что частицы различных размеров, форм и композиций относительно длины волны света будут рассеивать свет различно в различных направлениях (М. Керкер, Рассеяние света и других электромагнитных излучений, Академик пресс, Нью-Йорк, 1969). Теоретически могла быть предпринята попытка использования различных угловых рассеивающих образцов различных частиц в объемном растворе для обработки одновременных проб. На практике, однако, существует такое большое перекрытие в угловых рассеиваниях образцов различных частиц, что становится невозможным разделить результаты одной реакции агглютинации от другой.

Как будет более подробно описано ниже, изобретение использует инструмент для одновременного количественного многократного способа проб, который не является ни измерителем замутненности, не нефелометром, но вместо этого управляет светом, рассеянным от одиночных частиц или агрегатов частиц, но не от многих частиц в объемном растворе, и принадлежит к классу инструментов, известных как анализаторы потока частиц (FPA).

Два типа FPA использовались для детектирования агрегации частиц при манипулировании размерами индивидуальных частиц или их агрегатов, когда они протекают индивидуально через либо электронную, либо оптическую зону. В первом типе частицы и агрегаты частиц протекают через физически малую, электронных размеров, диафрагму, а во втором типе частицы и агрегаты протекают через сфокусированный оптический поток. Хотя эти подходы уже использовались для количественной агглютинации латексных частиц, ни одно из них не могло быть успешно применено к решению проблемы нескольких одновременных количественных латексных исследований агглютинации, они все ограничены одиночными испытаниями и требуют комплексных сигналов для измерения нескольких аналитов в одиночном образце.

Хотя электронные проточные диафрагмы могут детектировать различия в размерах среди популяции электрически изолирующих частиц, существуют определенные практические ограничения для использования таких устройств в исследованиях агглютинации латексных частиц благодаря, в частности, засорению чувствительных диафрагм агрегатами более высокого порядка, нежелательно произведенными в ходе исследований агглютинации, и примесями конкретного образца (П.Л.Массон и др. Способы в ферментологии, 74:106 (1981); Р.Кохэн Патент США N 4851329). Это ограничение препятствует любой процедуре, практическому использованию электронных диафрагм при попытках количественных испытаний агглютинации латексных частиц.

Поскольку оптические FPA могут использовать капиллярные чувствительные камеры с большими сквозными отверстиями, они, следовательно, не подвержены засорению в такой степени, как электронные устройства, и представляются предпочтительными для анализа одиночных частиц при количественных исследованиях агглютинации проб латексных частиц, включая иммунопробы.

Оптические FPA, которые реагируют на агрегатированную формацию путем измерения прямого рассеяния света, описаны Массоном и др. (там же), Массоном и др. (Патент США N 4279617), Камбиазо и др. (Патент США N 4184849) и Кохэнем и др. (там же). Хотя эти известные системы являются количественными и чувствительными, они описывают только пробы отдельных аналитов, не представляют способов определения скорости агрегации и не раскрывают одновременную агглютинацию частиц проб многократных аналитов в одиночном образце.

Системы Массона и Камбиазо, которые реагируют на импульсы прямого рассеянного света от неагрегатированных частиц, проходящих через сфокусированный оптический поток, и которые устанавливают электронные окна для игнорирования световых импульсов от агрегатированных частиц, предпочтительно используют латексные частицы двух различных размеров для агглютинации, возможно, для снижения эффекта, обусловленного первоначальным распределением мультиплетов (не специально сформированных без возникновения реакций АТ - АГ), которые могут иметь реакцию пробы (Узгирис и др. Патент N 4191739).

Если использовались частицы только одного размера, то исходное распределение двумеров, тримеров и мультимеров должно учитываться при измерении дополнительных димеров, тримеров и т.п., которые созданы иммунохимическим процессом. С другой стороны, если две частицы различных размеров покрыты одними и теми же иммунохимикалиями, необходимыми для измерения данного аналита, и мешаны совместно в момент протекания иммунохимической реакции, они не будут представлять исходные агрегаты двух размеров частиц. Это может снизить эффект, заключающийся в том, что исходное распределение мультиплетов может иметь иммунохимическую реакцию.

Хотя использование частиц различных размеров было ранее описано (Узгирис и др., Мессон и др., Кохэн и др., и Камбиазо и др.) для исследования одиночного аналита с помощью агглютинации латексных частиц, ни одна из этих ссылок не раскрывает решения проблемы одновременного исследования нескольких аналитов при помощи агглютинации латексных частиц. Рекомендации по размерам частиц, данные в этих ссылках, недостаточно полные, так что эти изобретения не работоспособны даже для одиночных аналитов. Настоящее изобретение касается специфических средств, при помощи которых частицы различных размеров или коэффициенты рефракции должны быть выбраны и использованы для того, чтобы количественно контролировать одновременные множественные реакции агглютинации латексных частиц.

Камбиазо и др. описывают способ использования поперечного реактивного антитела, помещенного на один из размеров частицы, и антигена, который реагирует только с одним положением антитела на частице другого размера в запрещенной иммунопробе. Хотя утверждалось, что иммобилизационный антиген придает специфику пробе и что путем выбора правильного иммобилизационного антигена может быть выполнена проба для данного антигена в образце пациента, этот способ имеет специфический недостаток, если один или несколько аналитов с поперечной реакцией присутствуют одновременно с другими антигенами с поперечными реакциями. Следовательно, Камбиазо и др. при их системе не могут ее использовать для одновременного многократного испытания.

Аббот и др., патент США N 4521521, описывает способ количественного измерения одиночного аналита в жидком образце путем измерения скорости агрегации связанных в аналите частиц. Предпочтителен измерительный перпендикулярный световой рассеиватель, Аббот и др. не исследовали способ оценки нескольких аналитов одновременно в одном и том же образце, не исследовали использование различного размера частицы с рефракционным коэффициентом для каждого из нескольких аналитов в отдельном образце и не исследовали частицы, связанные с аналитом, отличным от лиганда, как это сделано в настоящем изобретении.

Аббот и др. описывают также аналитический инструмент для осуществления их способа иммунопроб. Этот инструмент, однако, полностью отличен по концепции, принципу, конструкции, электронике и работе от оптических анализаторов потока частиц согласно настоящему изобретению, Аббот ссылается на измерительный инструмент распределения размеров частиц, в котором получены подсчитанные значения для каждого размера частиц, связанного с одним и тем же аналитом. Аббот осуществляет это, не используя анализаторы одиночного канала для разделения импульсных сигналов от светового детектора в отдельные выходные сигналы либо путем использования пикового детектора для выборки пиковых значений импульсных сигналов от детектора и вывода соответствующих пиковых значений, как это выполнено в инструменте предпочтительных примеров осуществления настоящего изобретения, однако, вместо этого путем использования схемы счетчика, содержащей пороговый компаратор, моностабильный мультивибратор, который формирует логический сигнал для каждого электрического импульса, проходящего через компаратор, и счетчика, в котором возникают приращения логических сигналов. Выходной сигнал порогового компаратора равен разности между импульсным сигналом светового детектора и предварительно установленным пороговым уровнем и не представляет выходной сигнал детектора, как он использован в настоящем изобретении. Более того, сигналы представляют только один аналит.

Схема Аббота не обеспечивает разделения импульсных сигналов от детектора, но иногда переключает компаратор при превышении порогового уровня. Поскольку большинство мультимеров формируют импульсы большей амплитуды, чем меньшие мультимеры или мономеры, в системе Аббота импульсы от n-персных частиц будут превышать пороговые уровни всех каналов и будут вызывать превращения значений всех счетчиков. Эти пороговые схемы не являются одноканальными анализаторами. Более того, пороговые схемы Аббота не могут обеспечить пиковых значений выборок, как это сделано пиковым детектором, раскрытым ниже, но иногда переключаются, когда сигнал превышает пороговое значение. Сигнал может превышать имеющееся пороговое значение и переключать схему перед достижением пикового значения. Кроме того, выходной сигнал порогового компаратора редко представляет собой импульс, показывающий, что импульс превышает пороговое значение; он не обеспечивает информации относительно пикового значения сигнала, когда выборка пикового значения представляет интеграл в существующих РРА.

Каннон КК, патент JP 1207663, ссылается на способ агглютинации пробы латексных частиц потока и устройство для одновременного измерения многократных аналитов в жидком образце. Патент использует частицы, покрытые АГ или АТ, специфические для детектирования АГ или АТ. Различные частицы могут быть одинаковыми или различными по размерам, способ определяет аналиты путем детектирования рассеяния света в двух направлениях, одно из которых является боковым, и используется измерение конечной точки агрегации в отличие от преимущественного измерения проб, как описано в настоящем изобретении.

Из WO 89/11101 известен способ одновременного анализа нескольких аналитов, который использует флуорометрический анализ, при котором происходит сортировка и оценка флуорометрических сигналов. Для некоторых применений этот способ достаточно удобен, однако он не позволяет проводить раздельный подсчет каждого типа частиц и агрегатов, что снижает его практическую ценность.

Таким образом, хотя известны многие способы анализа проб на основе агглютинации частиц, сохраняется потребность в способе, позволяющем обрабатывать панели с иммунопробами с высокой скоростью и точностью, с одновременным анализом нескольких проб. Это позволило бы значительно ускорить исследования, связанные с анализом множественного образца многими реагентами и сопоставлением полученных результатов.

Предложенный количественный кинетический способ агглютинации частиц для одновременной оценки концентрации нескольких аналитов в исходном жидком образце, дает возможность использования новой оптической оболочечной проточной ячейки, имеющей высокое разрешение, одиночного детектора для измерения импульсных сигналов от направленного под малым углом света, рассеянного от различных по размерам различно покрытых мономерных частиц и их агрегатированных мультимеров, и нового анализатора потока частиц (FPA).

Таким образом, целью изобретения является создание способа анализа нескольких аналитов в одиночном жидком образце, при этом измерение направленного под малым углом света, рассеянного от мономерных и агрегатированных, мультимерных полимерных частиц в виде функции времени коррелируется с концентрациями аналита в жидком образце, а каждый аналит измеряется при использовании частиц специфического размера или коэффициента рефракции и специфического покрытия.

Другая цель изобретения состоит в раскрытии основанных на интенсивности способов определения агрегации многочисленных по размерам полимерных частиц, причем для оценки концентрации различного аналита в жидком образце используются частицы различного размера.

Еще одной целью изобретения является создание способа определения оптимального диапазона диаметров частиц или коэффициентов рефракции для использования при осуществлении способа согласно изобретению.

Другая цель изобретения заключается в описании одновременных иммунопроб нескольких аналитов в жидком образце методом подсчета интенсивности агрегатирования частиц согласно изобретению.

Еще одной целью изобретения является создание оболочечной проточкой ячейки и предпочтительных примеров анализатора потока частиц, специально разработанных для способа одновременного исследования агглютинации нескольких видов частиц по изобретению.

На фиг. 1 показано разделение детектированных анализатором потока частиц мономеров от димеров, тримеров и более высокого порядка мультиплетов; на фиг. 2 схематически изображена ячейка анализатора потока частиц согласно изобретению; на фиг. 3 - поток частиц через ячейку; на фиг. 4 - общая схема оптической системы согласно настоящему изобретению; на фиг. 5 - электронная блок-схема анализатора потока частиц согласно предпочтительному примеру осуществления изобретения. Также показаны установленные пиковые значения импульсов (A) и подсчет (B) одноканального анализатора (AOK) для трех популяций частиц; на фиг. 6 показана электронная блок-схема анализатора потока частиц второго предпочтительного примера осуществления изобретения. Также показаны на вставке зависимости общего количества событий от величины импульсов для двух популяций частиц; на фиг. 7 показано распределение величины импульсов рассеянного света, полученное от двух популяций полистирольных сферических частиц, при наличии или отсутствии потока оболочки.

На фиг. 8 - теоретическая зависимость значений интенсивности рассеянного света как функции диаметра частиц. Данные взяты из мономерных пиковых каналов; на фиг. 9 показаны спектры величин импульсов, полученные для непокрытых полистирольных латексных частиц 3,22 мкм; на фиг. 10. - зависимость средних величин импульсов от размера частиц, используя данные мономероного пикового канала от эксперимента, показанного на фиг. 9; на фиг. 11 показаны результаты кинетического способа проб согласно изобретению применимо к иммуноклобулину 1 A в присутствии 1 G сравнительно с 1A, анализатором отдельно ; на фиг. 12 показаны результаты кинетической пробы согласно изобретению применимо к иммуноглобулину 1 G в присутствии 1 A сравнительно с 1 C, анализируемым отдельно ; на фиг. 13 показано относительное образование димера в виде функции времени в процессе применения способа кинетического массива и оптическая система FPA с оболочкой согласно изобретению для иммунопробы тероидного стимулирующего гормона человека (ТСГ) при концентрациях ТСГ в мк 1 U (мл); 0,0 (0), 1,0 (▪) , 25 (·) и 100 (□) .

На фиг. 14 - гистограмм, сформированные FPA, показывающие мономер, димер и тример по их популяциям после реакции аналита 1A с полистирольными сферами различных мономерных размеров, покрытых антителом анти-1gA. Относительные мономерные диаметры составляли 1,00 (A), 1,08 (B), 1,23 (C) и 1,46 (D).

На фиг. 15 - гистограмма величины импульсов, показывающая оптическое разрешение мономеров и димеров трех размеров полистирольных микросфер. На этом чертеже M₁ и D₁ представляют мономеры и димеры со сферами 1,05 мкм, M₂ и D₂ для сфер 1,62 мкм, а M₃ и D₃ для сфер 1,78 мкм; на фиг. 16 показали кинетические кривые, полученные путем одновременного многократного анализа IgA, IgE и ТСГ, применяя FPA согласно изобретению. Отношения димера к мономеру представлено как функция времени. Действительные концентрации аналита для каждой кривой приведены в таблице 1 примера 4. В этом эксперименте существует контроль "нуля" IgA.

На фиг. 17 - то же, за исключением того, что присутствует контроль "нуля" ТСГ; на фиг. 18 то же, за исключением того, что существует контроль "нуля" IgE.

Изобретение представляет количественный кинетический способ агглютинации частиц для одновременного измерения концентрации нескольких аналитов в одиночном жидком образце. Данный способ позволяет использовать новый оптический анализатор потока частиц с высоким разрешением, где детектирование путем одного светового детектора, направленного под малыми углами света, рассеянного от различных по размерам и/или коэффициенту рефракции покрытых мономерных частиц и их мультимерных агрегатов, является основой стабильного кинетического способа, спроектированного для одновременного исследования нескольких аналитов в одиночном образце. Выражения "частицы", "сферы", "микросферы" и "бисер" здесь использованы взаимозаменяемо и связаны с полимерными (например, латексными, полистереновыми) сферическими частицами общего однородного диаметра и коэффициента преломления относительно окружающей среды.

Рассеивание света одиночными сферическими частицами направляет свет в соответствии со следующими параметрами: (а) интенсивность падающего света; (b) диаметра частицы; (c) коэффициента рефракции частицы; (d) коэффициент рефракции окружающей среды; (e) длина волны падающего света; (f) угол наблюдения (рассеяния). Теоретические анализы рассеивания света от одиночных сферических частиц допустимы с использованием этих параметров. (М.Керкер, 1969).

Рассеяние света от агрегатов сферических частиц различных размеров (т.е. 2-мерные, 3-мерные. .. n-мерные) зависит не только от упомянутых выше параметров, но также от ориентации агрегата в оптическом пучке и специфической конфигурации агрегата. Например, тримеры могут существовать в линейной цепи или в треугольной конфигурации. Излишнее количество комбинаций конфигураций агрегатов более высокого порядка делает вычислительный анализ невозможным на практике. Описание изобретения, следовательно, относится к комбинации теоретических и экспериментальных наблюдений.

Величины импульсов рассеивателя света или интегрированные площади импульсов не линейно связаны с объемом или любой другой простой мерой размера сгустка.

Частиц одиночного размера и формы могут быть выделены с высокой точностью в FPA. Для "точных" сферических частиц в диапазоне диаметров 1-10 мкм является принятым иметь FPA с распределениями длительностей 1,5% величин импульсов рассеивателя света. Другими словами, можно отличить частицы 1,00 мкм от частиц 1,01 мкм (предполагая, что цифровая электроника имеет соответствующие разрешающие способности). Таким образом, распределение дублетов (2-мерные), приплетов (3-мерные) и более высокого порядка мультиплетов (n-мерные) может быть визуализировано электронным способом согласно изобретению при помощи FPA (фиг. 1). Хотя расширение мультиплетов может возникать из-за эффектов ориентации, поскольку асимметричные сгустки имеют тенденцию быть ориентированными при помощи потока оболочки согласно настоящему способу, это является минимальным. Разделение ме5жду мультиплетами становится более узким при возрастании размера из-за нелинейной корреляции по размеру с величиной импульса.

Изобретение использует сферические частицы различного диаметра или различного коэффициента рефракции для каждого аналита, подлежащего исследованию, и связано с возможностями анализатора потока частиц для различения частиц и агрегатов частиц различного размера или коэффициента преломления. Только факторы, которые влияют на разрешение по размерам частиц в оптическом анализаторе потока частиц, ограничивают количество одновременных анализов, которые могут быть проведены при данном исследовании. Два таких фактора, эффекты позиционирования частиц и немонотонные соотношения между амплитудой импульса рассеивателя и размером частицы, и средства, имеющие отношения к этим эффектам и соотношениям, обсуждаются ниже.

Эффекты позиционирования частиц - разрешения.

Оптический анализатор потока частиц обеспечивает импульс рассеянного света, когда каждая отдельная частица или агрегат частиц проходят через падающий световой пучок. Оптические пучки не могут быть полностью однородными по интенсивности света; следовательно, для достижения высокого разрешения по размерам является существенным, чтобы частицы и агрегаты проходили очень близко через одну и ту же область оптического пучка. Эта проблема не рассматривалась в анализаторах потока агглютинации латексных частиц, описанных Мессоном Р. Л. и др. Способы в ферментологии 74:106-139 (1981) и в патенте США N 4279617: Камбиазо и др. (патент США N 4184849) или Кохеном и др. (патент США N 4851329). Однако изобретение решает эту проблему путем использования "потока оболочки".

В этом способе потока оболочки ячейки центрированы в потоке путем использования второго концентрического пучка, который ограничивает пучок ячеек до узкой поперечной секции и центрирует пучок ячейки в области наивысшей интенсивности и наиболее однородной для сфокусированного светового пучка. В. Гонде и др. Измерения при помощи FPA ячеек спермы и крови генетически нормальных и ненормальных людей. Цитометрия потока IV. Университетсфорлаген, Берген, Норвегия, 1980, с.273-276, и Г.Шапиро. Практическая цитометрия потока. Вторая реакция, Алан Р. Лисс, инк. Нью-Йорк, p.74.

Изобретение использует поток оболочки как первый этап для получения максимального разрешения в сигнатуре частиц и агрегатов частиц рассеивателя света. Фиг. 2 представляет план, показывающий основные компоненты ячейки потока оболочки оптического анализатора потока частиц согласно изобретению.

Образец сформирован в потоке частиц, окруженных жидкой средой оболочки в потоке ячейки. Падающий свет (например, узкополосный лазерный пучок) попадает на частицы под прямыми углами и возникает рассеяние света. Фиг. 3 иллюстрирует поток оболочки в нижнем направлении.

Фиг. 4 представляет схему общего расположения оперативно связанных компонентов оптической системы FPA, использованной в настоящем изобретении. Мономерная частица и частица, агрегатировано рассеивающая свет, существующей от ячейки потока оболочки, проходят через собирающую линзу с блокиратором центрального пучка и попадают на световой детектор. Подходящие световые детекторы в соответствии с изобретением включают фотодиоды, фотомультиплекаторы, фототранзисторы и фоторезисторы. Каждая мономерная частица или агрегат частиц, которые проходят через фокальную область оптического пучка, обеспечивают импульс при малом угле прямого рассеяния света, который принимался световым детектором.

Сигналы от светового детектора могут быть проанализированы несколькими путями; однако два преимущественных примера осуществления изобретения являются предпочтительными. Первый предпочтительный пример представляет способ, основанный на аппаратурном обеспечении, а второй предпочтительный пример представляет способ, первоначально основанный на программном обеспечении.

В первом предпочтительном примере выполнения настоящего изобретения (фиг. 5А) импульсы от светового детектора предварительно усиливались и контролировались на осциллографе. Различимые популяции импульсов со средней величиной V_н импульса могут быть видны в соответствии с каждым размером частицы или размером агрегата частиц (фиг. 5В). Анализаторы одиночного канала (SCA) (Канберра индастриз. инк., Мериден, СТ), по одному для каждого анатила, связаны с предусилителем и использованы для установки электронных окон, которые охватывают узкий диапазон величин ± ΔV импульсов вокруг каждой средней величины V_н импульса различимой популяции. Импульсы, которые проходят через каждый SCA, поступают на отдельные входы аналого-цифрового преобразователя ADC и затем регистрируются в компьютере (СРИ). Компьютер контролирует скорость поступления импульсов от каждого SCA и представляет эту скорость как функцию времени. Скорость счета как функция времени для каждой из трех популяций, использованных в данном примере, показана на фиг. 5С. Различные характеристики нескольких скоростей счета в зависимости от времени на графиках могут быть коррелированы с концентрацией аналита. Эти характеристики включают первоначальную скорость изменения, максимальные скорости изменения, максимальные скорости счета, относительную формацию димера во времени, разницы в скоростях счета димер-мономер во времени и временные интервалы (см. примеры 2 и 4). Предпочтительные примеры осуществления, в которых отдельные предусилитель и монитор осциллографа не использованы, подпадают под объем настоящего примера.

Следует подчеркнуть, что использование трех SCA на фиг. 5 и в сопровождающем описании редко является одним применением данного предпочтительного примера осуществления изобретения. В других аналитических применениях могло быть использовано большее или меньшее количество блоков SCA в зависимости от числа аналитов, которые должны быть одновременно измерены, а также различные SCA могли быть предназначены для каждой мономерной частицы с уникальным покрытием, соответствующей каждому аналиту.

Во втором предпочтительном примере осуществления изобретения (фиг. 6А) компоненты SCA не задействованы и все импульсы поступали от предусилителя непосредственно к ADC, который производил выборки пиковых величин каждого импульса. Пиковые значения амплитуд импульсов затем поступали в компьютер. Компьютер сортирует пиковые значения импульсов по величине и представляет затем их на гистограмме.

Гистограмма может быть сглажена, если это необходимо. Это было выполнено предпочтительно путем использования способа биномиального взвешивания среднего. Специалистами в данной области техники известны другие способы сглаживания гистограмм. В этом предпочтительном способе был выбран интервал значений амплитуд импульсов вдоль оси X гистограммы и использовались биномиальные коэффициенты для взвешивания соответствующих величин по оси Y (число импульсов, наблюдаемое для величины каждого импульса). Например, если выбран интервал семь величин импульсов, использовались треугольники Паскаля по седьмой строке ввода (или таблица биномиальных коэффициентов) и число импульсов, наблюдаемых при каждой величине импульса, умножалось на соответствующий ввод в треугольнике Паскаля. Эти полученные величины суммировались и делились на сумму семи вводов треугольника Паскаля. Полученное значение вводилось в качестве нового "количества величины импульсов" при средней величине импульса. Это присуще треугольнику Паскаля, причем данный способ обеспечивает средний ввод наиболее возможного веса. Алгоритм развивается при взятии нового интервала величин импульсов, сдвинутого путем суммирования одного интервала по оси X. Биноминальное взвешивание затем применялось к последующей точке "усредненных" данных. Для получения высоких скоростей анализа данных эта сглаживающая процедура была применена к полной гистограмме в общем не более чем два раза. Существует относительно небольшая возможность применения этой конкретной процедуры более двух раз, поскольку гистограмма при этом не становится хуже при излишнем применении способа.

Пики сглаженной гистограммы теперь легко локализировать при помощи нескольких способов максимальных значений. Интервал величины импульса был выбран охватывающим каждый пик, и общее количество событий подсчитывалось в том же интервале (эквивалентно площади под кривой на фиг. 6В). Этот этап имеет место при использовании определенных SCA окон, как и в первом предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения (см. фиг. 5). Это "общее количество событий" разделено на регулируемый период времени, описанный выше, для получения "подсчета". Вычисления подсчетов повторяют в различные моменты времени в течение реакции агглютинации частиц, причем подсчеты выстраивают в зависимости от времени, и характеристики этих кривых использованы для определения концентрации аналита, соответствующего каждому пику. характеристики могут включать первоначальный наклон, максимальный наклон, максимальный подсчет, относительное образование димера во времени, изменения соотношения димер:мономер и временные интервалы.

На фиг. 7 показано распределение величины импульсов рассеянного света, полученное от двух популяций полистирольных сферических частиц со средними диаметрами 1,6 мкм и 2,03 мкм соответственно. С потоком в оболочке оптический анализатор потока частиц ясно различает две популяции, которые имеют разницу в диаметре только 0,43 мкм. Однако без оболочки распределения перекрываются и не так легко различимы.

Поток в оболочке полезен при получении высокого разрешения для флуоресцентных импульсов при цитометрии потока безотносительно к массе флуоресцентного материала в частице. Однако аналогичное утверждение не действительно для рассеивателя света. Было определено, что даже при потоке в оболочке определенный диапазон размеров частиц не мог быть определен. Этот результат не отрицается известным уровнем техники и в пределах объема настоящего изобретения созданы средства для этих диапазонов размеров частиц, которые могли быть использованы совместно с потоком оболочки для выполнения анализа многократных проб.

Высокое разрешение - немонотонное соотношение между амплитудой импульса рассеивателя света и размером частицы.

Полный оптический волновой анализ, основанный на теории Майя (М.Кернер, 1969), показывает, что амплитуда импульса рассеянного света от сферических частиц с однородным коэффициентом преломления, не является простой монотонной функцией от диаметра частицы, Этот анализ показывает, что настоящие волны могли быть сформированы в сферических частицах и могли обеспечивать возрастание конструктивной интерференции для определенных размеров частиц (пики на фиг. 8) и деструктивной интерференции для других размеров частиц (пологие места на фиг. 8). Конструктивная интерференция обеспечивает увеличение рассеивания света, а диструктивная интерференция приводит к уменьшению этого рассеяния света от рассеивателя. Теоретические кривые на фиг. 8 получены на основании оптического волнового анализа. Теоретические анализы рассеивания света всегда приблизительные, однако данный экспериментальный анализ (фиг. 10) ясно показывает эти конструктивные и деструктивные эффекты интерференции.

Экспериментальные данные были получены от FPA и сравнены с теоретической кривой на фиг. 8. FPA имеет следующие характеристики. В качестве светового источника использовался гелийнеоновый лазер, действующий при длине волны 632,8 нм, и он был сфокусирован на астигматическую горизонтальную полосу соответствующих размеров 250 мкм в горизонтальном направлении и 10 мкм в вертикальном направлении. Система потока оболочки была использована для выравнивания частиц, расположенных в основном по центру очи 10 мкм фокуса пучка. Линза была использована для сбора рассеянного света во всенаправленном прямом направлении под малым углом (между приблизительно 2^o и 7^o по отношению к оптической оси системы). Рассеиватель в прямом направлении под малыми углами имеет большие преимущества. Присутствующие данные показывают получение примерно в 100 паз лучшего отношения сигнала к шуму, чем при прямом угле, т.е. перпендикулярно рассеивателю. Импульсы рассеянного света детектировались фотодиодом, расположенным в электронном предусилительном каскаде, и затем регистрировались по величине импульса в системе анализа данных, описанной выше.

Непокрытые полистереновые латексные частицы (Полисайнсиз инк. Варрингтон, РА) были взвешены в дистиллированной воде и проходили через ячейку потока FPA. Взвесь в дистиллированной воде обеспечивала то, что не возникали индуцированные ионами агрегации непокрытых частиц. Спекты величин импульсов были получены для каждого размера частиц и они отображались для анализа, как показано на фиг. 9. Зависимость средней амплитуды импульса от диаметра частиц была получена (фиг. 10) и она может быть сопоставлена с теоретической кривой (фиг. 8). Достаточно хорошее согласование было получено между теорией и экспериментом, однако была установлена систематическая тенденция к худшим экспериментальным данным по амплитуде импульсов, чем это было предсказано теорией, для частиц больших размеров (правый край кривой по фиг. 10).

Из этой кривой можно видеть, что существует определенный диапазон диаметров частиц, который обеспечивает импульсы рассеивателя света, которые не разрешимы даже при использовании потока оболочки. Например, при конкретных экспериментальных условиях, описанных на фиг. 10, частицы с диаметрами в диапазоне 2 - 3 мкм (плоская часть кривой) неразрушимы одна от другой. Это также распространялось на случай частиц с диаметрами в диапазоне 4,0 - 5,5 мкм.

В общем случае частицы с диаметрами в диапазонах плавных наклонов на фиг. 10 более предпочтительны для одновременных проб, поскольку они могли быть более легко выделены (см. например, фиг. 7). Предпочтительно использование диаметров частиц в диапазоне 0,02 - 12 мкм. Наиболее предпочтительно использование диаметров частиц в диапазоне 0,5 - 7,0 мкм.

В пределах объема изобретения не требуется уникальная экспериментальная база для использования способа и АПЧ согласно изобретению при выборе оптически разрешимых частиц для использования в одновременной пробе конкретных многократных аналитов. Вообще процедура включает взвешивание в растворе реагента проб, соответствующего конкретным оцениваемым аналитам, монометрических сфер, покрытых антителами, различного диаметра и коэффициента рефракции, процедура массива согласно изобретению затем проводилась с каждой уникальной сферой с использованием оптического FPA согласно изобретению. После соответствующего периода реакции, который обычно начинается через примерно три минуты после смешивания реагентов и продолжается примерно до 30 мин, получают гистограммы, показывающие мономер, димер и тример в виде их популяций как функция напряжения. Путем наложения гистограмм (см. например, фиг. 14) возникают оптические разрешимые размеры сфер путем простой проверки.

Альтернативно к описанному выше способу выбора размеров частиц, при котором использовались покрытые частицы с реагентом иммунопробы, не покрытые частицы могли быть взвешены в солевом растворе, который вызывает формации медленных димера, тримера, n-мера (Рейнольдс П.А. и др. Коллоиды и поверхности, 23:273-299, 1987). Например, полистирольные сферы могут быть взвешены в 0,35 M NaCl и взболтаны в течение десяти минут; образцы, выводимые периодически, затем анализировались оптической системой FPA согласно настоящему изобретению и формировались гистограммы.

Кривая амплитуда импульсов рассеиваемого света в зависимости от диаметра частиц изменялась, когда изменения производились к коэффициентам преломления частиц, коэффициенте преломления взвешивающей жидкости, длине волны падающего света или угле наблюдения для рассеянного света. Оптимальные диаметры частиц для одновременных проб должны быть определены для любой данной комбинации указанных параметров. Изобретение использует частицы, выбранные от этих оптимальных областей, для того, чтобы максимизировать количество одновременных анализов, которые могут быть представлены.

Любая химическая реакция, которая связывает два шарика, может контролироваться при помощи способа согласно изобретению. Например, множественные реакции антиген-антитело, где антитела являются аналитами в выборке образца, подлежащей сбору в качестве пробы, могут быть апробированы одновременно на одном и том же жидком образце пациента путем использования шариков различных диаметров, причем с каждым различным антигеном, покрытие которого содержит эпитоп к антителу. Аналогично шарики могут быть покрыты антителом, направленным против эпитопа аналита антигена.

Способ согласно настоящему изобретению является гибким. Он может быть использован любо для измерения агглютинации, любо для запрета агглютинации покрытой частицы. Компоненты реактивной смеси могут быть добавлены одновременно или последовательно. Способ также применим для разъяснений или системы из наборов, где различно покрытые частицы применимы для связи с лигандом аналита в конкурирующей пробе.

В объеме предложенного способа входит детектирование агрегации шариков в крови или плазме, которые подвержены реакции свертывания крови. Такие реакции полезны при измерениях гемостазов.

Возможность выполнения анализа многократных проб аналита, проб свернувшейся крови и одновременный подсчет ячеек на одном и том же инструменте являются основным преимуществом в текущей практике, когда можно было использовать три различных инструмента для этой цели. Способ и FPA согласно настоящему изобретению идеальны для эксплуатации этого типа комбинационного испытания.

Пример 1. Одновременные независимые иммунопробы двух аналитов.

Одновременная иммунопроба для человеческого IgG и человеческого IgA представлена с использованием системы оптического SCA потока оболочки, описанной выше.

Два размера полистирольных микросфер® (фирма Полисайнс, инк., Варрингтон, PA 18976-2590) были каждый взвешены до 0,5% (мас.об.) в 20 мМ буфера HEPES, pH 8.0. Шарики 1,23 мкм (коэффициент вариации диаметра частиц в диапазоне от 0,1 до 4,0%) были повергнуты инкубационному периоду с 22,5 мг/мл антитела IgA кролика и 2,05 мкм шарики были подвергнуты инкубационному периоду с 17,5 мг/мл антитела IgG кролика (Джексоновская иммуноисследовательская лаборатория, инк., Вест гроув, PA) в течение 30 мин. Покрытые антителами шарики затем были покрыты с 0,2% твердыми частицами нежирного сухого молока (Карнашин компани, Лос-Анджелес, Калифорния, США) в течение 15 мин для блокирования неспецифических связующих мест. Покрытые шарики были промыты суспензией в буфере хранения (1,5 M NaCl, содержащей 0,5% бычьей сыворотки альбумина и 0,1% NaCl₃, pH 7,4) и подвергнуты центрифугированию. Контрольные шарики были покрыты твердыми частицами нежирного сухого молока в течение 15 мин и промыты, как описано выше.

Электронные окна были установлены для управления скоростью счета мономеров этих двух размеров частиц, когда они проходили через чувствительную зону анализатора. Первоначальный интервал времени изменения (отрицательный наклон) одномоментного подсчета мономеров был измерен и количественно связан с концентрацией аналита. При анализе данных игнорировали первоначальную задержку фазы реакции, которая составляет диапазон между 3 и 3,5 мин после смешения. В процессе этой задержки фазы агглютинации аналит быстро диффундирует в частицы, но очень малые коллизии все еще возникали между шариками и детектированная агглютинация все еще не возникала. После этой фазовой задержки менее подвижные шарики коллидируют и агглютинируют при скорости, которая зависит от концентрации аналита.

Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 11 (IgG одиночный и одновременно с IgA) и 12 (IgG одиночный и одновременно с IgA). Эти кривые показывают исходную скорость уменьшения мономера в зависимости от концентрации анатила для двух аналитов отдельно и затем совместно. Не существует значительной разницы между данными взятыми, когда аналиты были измерены отдельно или одновременно. Можно заключить, что реакции сохраняются независимыми одна от другой, даже когда возникали две иммунохимические реакции в одной и той же смеси реакции.

Эта независимость может быть прослежена непосредственно для использования потока оболочки и использования шариков различных размеров, взятых их соответствующих областей рассеивателя света в зависимости от кривой диаметра шарика (фиг. 10) или от наложенных гистограмм фиг. 14.

Пример 2. Кинетика образования диаметра в пробе гормона стимуляции тироидов в человеческой сыворотке.

Иммунопроба для гормона стимуляции человеческих стироидов (TSH) в человеческой сыворотке была выполнена с использованием оптической системы FPA потока оболочки, описанной выше.

Полистереновые сферы (ИНтерфашиал дайнемикс корп., Сиэтл, Вашингтон, США) диаметром 1,62 мкм были покрыты моноклональными антителами анти-TSH путем инкубации сфер всю ночь в растворе 100 мг/мл антитела в 10 мМ HEPES-буфера, pH 7,5. Покрытые частицы были восстановлены путем грубого центрифугирования и промыты три раза в 4-кратном объеме буфера 10 мМ HEPES, pH 7,5, содержащем 0,1% (мас/об.) бычьей сыворотки альбумина (BAS), 0,01 NaCl₃ и 300 мМ NaCl. Этот реагент был добавлен к равному объему стандартной человеческой сыворотки (OEM Concept, инк., Том ривер, Нью/Джери), содержащей известные концентрации человеческого TSH, и непрерывно взбалтывался. Первоначальная концентрация мономерных сфер составляла около 5 · 10⁷ мономеров/мл. Димерные сферы, присутствующие в результате процессов изготовления и покрытия, составляли около 2% первоначальной мономерной концентрации. Концентрации TSH в смеси реакции составляли 0,0 мкU/мл (контроль, на фиг.13), 1,0 мкIU/мл ( ▪ на фиг.13), 25 мкI/мл ( ° на фиг.13) или 100 мкI (мл/ □ на фиг.13).

Смеси реакций были подвергнуты выборкам на интервалах в процессе 15 мин после инициализации реакции и анализировались оптической системой FPA согласно настоящему изобретению. Скорости счета димеров были измерены либо как редкие скорости счета от окон димеров, либо как относительные скорости счета, полученные как отношение скоростей счета димера к мономеру либо димера к скорости счета контрольного шарика (не аналита). Относительные скорости счета димеров ("относительные димеры") для четырех различных концентраций TSH показаны на фиг.13.

Кривая реакции каждого аналита (относительные димеры в зависимости от времени) показывает первоначальную фазовую задержку с малым наклоном. Каждая кривая также показывает фазу, при которой он максимален, следую за фазовой задержкой. Время, требуемое для достижения максимального наклона, уменьшается с увеличением концентрации аналита. Максимальные наклоны ясно возрастают с увеличением концентрации TSH. Максимальное процентное содержание димеров (или относительные димеры) по сравнению с мономерами больше с возрастающей концентрацией аналита и время, требуемое для достижения этого максимума, возрастает с уменьшением концентрации аналита. Кроме того, площадь под каждой кривой возрастает с увеличением концентрации TSH при интегрировании по одним и тем же временным пределам. Важно заметить, что, хотя все упомянутые выше характеристики кривых реакции представлены относительно концентрации TSH, то одна из них не является линейно связанной.

Графики скорости счета в зависимости от времени иллюстрируют характеристики, которые не могут быть точно предсказаны при помощи математических моделей. Немонотонное поведение кривых, в особенности при высоких концентрациях аналита, является удивительным и должно быть рассмотрено на базисе аналит-аналит. Например, время, в течение которого реакция TSC достигает максимальной скорости счета димеров, различно по сравнению со временем, необходимым для реакции пробы IgE (см. пример 1), для достижения ее максимальной скорости димера, даже если молярные концентрации аналитов являются теми же самыми. Эти различия должны быть приняты во внимание при вычислении наиболее полезного графика характеристик, который связан с концентрацией аналита.

Графики характеристик, показанные на фиг.13, существенно не изменялись, когда были получены абсолютные или относительные скорости счета димеров, вследствие: 1) направления импульсов от установки SCA для принятия амплитуд импульсов димера на ADC и затем на CPU; 2) передачи импульсов от установки SCA для принятия скорости счета мономеров, когда скорость счета димеров возникала от отдельного SCA, и комбинирования их при помощи CPU для формирования отношения скорости счета димеров к мономерам; или 3) передачи импульсов от SCA для получения величин импульсов мономера от контрольных частиц 1,05 мкм аппаратурного обеспечения к ADC и формирования отношения скоростей счета димера к контрольным частицам аппаратурного обеспечения, где снова скорость счета димеров возникает от отдельного SCA.

Аналогичные кривые реакции были получены, когда средства анализатора пикового детектора были использованы с ADC для формирования гистограмм величин импульсов через CPU (предпочтительный пример осуществления с программным обеспечением). В этом предпочтительном примере осуществления изобретения CPU, был использован в отличие от SCA с окнами для мономерных и димерных популяций, при этом были использованы сглаженные или не сглаженные гистограммы. Повторяющиеся выборки реакции смешиваются в течение свыше 15 мин, обеспечивая графики реакции, которые не отличаются от этих графиков, показанных на фиг. 13.

Точность данных экспериментов была связ0ан с несколькими частицами подсчитанного каждого мономера и с стабильностью скорости потока жидкой среды FRA, когда отношения реагирующих димеров к реагирующим мономерам или отношения реагирующих димеров к контрольным шарикам аппаратурного обеспечения не были использованы.

Пример 3. Определение оптической разрешимости покрытых полистереновых сфер.

Четыре размера полистереновых сфер A, B, C и D (фирма "Полисайнсис, инк. ) были покрыты антителом анти-IgA, как в примере 1. Покрытые сферы были промыты и использовали неспецифические связи, блокированные, как описано в примере 1.

Взвеси каждого размера покрытых сфер затем реагировали в отдельности с фиксированной концентрацией IgA (1 мг/мл) в течение15 мин при использовании кинетического способа и FPA согласно настоящему изобретению. Относительные мономерные диаметры сферы перед реакцией с аналитом составляли в соотношениях 1,00 (A), 1,08 (B), 1,23 (C) и 1,46 (D). Гистограммы, показывающие мономерные, димерные и тримерные популяции, были сформированы при помощи оптического FRA.

Как видно из фиг. 14, суперпозиция четырех наборов кривых показывает, что сферы A и B, сферы A и D, сферы C и D оптически разрешимы, тогда как гистограмма более ранней реакции обеспечивает пики, которые четко не различимы одна от другой. В противоположность этому сферы B и C и сферы A и C не являются оптически разрешимыми из-за перекрытия мономерных и димерных пиков. В соответствии с данным анализом затем комбинации сфер A и B, сфер A и D и сфер C и D могли быть использованы в одновременной пробе двух аналитов.

Пример 4. Одновременная проба для TSC, IE и IA в одиночном образце.

Одновременная многократная иммунопроба была выполнена на основе трех аналитов - человеческого TSH, IgE и IgA с использование оптической системы FPA потока оболочки, описанной выше.

Полистереновые сферы (фирма "Интерфейсиал дайнемикс) диаметром 1,05, 1,62 и 1,78 мкм были выбраны в качестве оптически разрешимых при использовании критерия примера 3. В этом процессе выбора непокрытые микросферы были индуцированы для медленного агрегатирования путем взбалтывания частиц в присутствии 0,35 M NaCl в течение 10 мин. Затем взвесь анализировалась при помощи оптической системы FRA с потоком оболочки и были представлены гистограммы. Гистограммы величин импульсов показана на фиг.15. M₁, M₂ и M₃ на этом чертеже представляют три мономерных образца, а D₁, D₂ и D₃ представляют три димерных образца со сферами 1,05, 1,62 и 1,78 мкм соответственно.

Сферы были покрыты антителами, как это описано в примерах 1 и 2. Сферы 1,05 мкм были покрыты антителами анти-TSC, сферы диаметром 1,62 мкм - антителами анти-IgE, а сферы диаметром 1,78 мкм - антителами анти-IgA.

Человеческая сыворотка, присутствующая в TSH, IgE и IgA ( OEM Concept, инк. ), была использована в качестве транспортного средства для налитов TSH, IgE и IgA, которые были добавлены к этой сыворотке при известных концентрациях (см. таблицу).

Раствор реакции аналогичен описанному в примере 2. Упомянутые выше стандартные растворы сыворотки представляли 10% (об./об.) общей реагирующей смеси.

Первоначальная мономерная концентрация составляла 5·10⁷/мл для каждого размера сферы. Первоначальные концентрации димеров составляли приблизительно 1,5% в каждом случае.

Все смеси реакции были подвергнуты выборке при помощи системы FPA в течение периода свыше 20 мин. Взбалтывание смесей реакции необходимо для возникновения агрегатирования частиц. Следовательно, реакции не продолжаются в кратностях, удаленных из смеси реакции для анализа FPA.

На фиг.16 (в отношении IgA), 17 (в отношении TSH) и 18 (в отношении IgE) TSH выражено как мкU/мл, IgE в IU/мл, а IgA в мг, мкг или нг/мл. Действительные концентрации в каждом эксперименте показаны в таблице.

Стандартные кинетические кривые фиг. 16-18 были получены путем графиков изменения в отношении димер: полимер "DELTA R" от времени для каждого набора концентраций аналита.

Каждая кинетическая кривая реакции ясно различима и показывает отсутствие обнаруживаемых "взаимных помех". Это было установлено следующим образом. Каждая "нулевая" концентрация аналита была считана в присутствии высокой концентрации других двух аналитов. На фиг.16 IgA показана как представляющая "нуль", на фиг. 17 TSC был представлен как "нулевой" и на фиг.18 IgE был "нулевым" (см.таблицу). Поскольку "нулевые" кривые, не показывающие различимого наклона, были приведены, можно заключить, что ни один из двух других аналитов даже при высокой концентрации не обеспечивал взаимодействие между пробами. В экстремальном случае, когда IgA присутствовал при концентрации свыше 10^-5 W (5 мг/мл), возникающее нулевое значение TSC на фиг.17 было не более чем около 10^-12M, т.е. на семь порядков по амплитуде меньше, чем действительная концентрация аналита. Такой коэффициент подавления достаточен даже для большинства экстремальных требований в клинических установках.

Как описано более подробно выше, различные характеристики графиков на фиг. 16-18 могли быть коррелированы с концентрациями аналитов для выполнения этого эксперимента на основе одновременной качественной оценки TSH, IgA и IgA в одиночном образце жидкой среды.

Формула изобретения

1. Способ агглютинации частиц для одновременного исследования нескольких аналитов в одном образце жидкой среды, предусматривающий стадии: а) смешивания образца жидкой среды с реагентом, содержащим для каждого из указанных нескольких аналитов мономерные частицы, имеющие диаметр или индекс рефракции, уникальный для каждого аналита, причем каждая уникальная мономерная частица покрыта различной композицией, которая специфически связывается с соответствующим аналитом с образованием связанной пары покрытая частица - аналит, при условии, что указанные уникальные частицы или агрегаты являются оптически разрешимыми, по диаметру или по индексу рефракции, друг от друга, b) пропускания указанной смеси через луч падающего света так, чтобы частицы и агрегаты частиц проходили через луч последовательно и обеспечивали последовательные импульсные сигналы света, рассеянного под малым углом, которые являются специфичными для каждой конкретной покрытой частицы или агрегата, с) анализирования полученных импульсных сигналов рассеянного под малым углом света для одновременного измерения текущего подсчета всех мономерных покрытых частиц и их агрегатов и для обеспечения при этом измерении раздельных подсчетов каждого типа мономерных покрытых частиц и их агрегатов и d) соотнесения каждого раздельного подсчета с концентрацией одного соответствующего аналита, при этом по указанным подсчетам одновременно определяют концентрацию всех аналитов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что размер частиц находится в диапазоне 0,02 - 12,0 мкм.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что размер частиц находится в диапазоне 0,5 - 7,0 мкм.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая частица содержит полимерные частицы с функциональными поверхностными химическими группами.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что упомянутый полимер содержит полистирол.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что упомянутые поверхностные функциональные группы выбраны из группы, содержащей гидроксил, карбоксил, полимер карбоксилата, амин, соль аминовой кислоты, сульфатные и фосфатные группы.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая частица для данной реакции пробы покрыта антителом к упомянутому аналиту, который является антигеном.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая частица данной реакции пробы покрыта антигеном к упомянутому аналиту, который является антителом.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутое смешение специфичных частиц осуществляют последовательно или одновременно.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из реакций связывания аналита с покрытыми частицами представляет собой конкурентную связующую реакцию.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из реакций связывания аналита с покрытыми частицами представляет собой "сэндвич"-анализ.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутые частицы покрыты одним или несколькими компонентами системы свертывания крови.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19