Способ диагностики инфекционных заболеваний животных

 

Изобретение может быть использовано в ветеринарной иммунологии при экспресс-диагностике заболеваний вирусной и бактериальной этиологии. Сущность изобретения состоит в следующем. Осуществляют отбор крови от испытуемого животного. Готовят 2,5%-ную взвесь цитратной крови и 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов. Смешивают одновременно с набором эталонных растворимых бактериальных и/или вирусных антигенов цитратную кровь и отдельно с этим же набором антигенов отмытые эритроциты одного и того же животного. Производят учет результатов реакций, при этом по положительной агглютинации эритроцитов с каким-либо антигеном и отрицательной реакции цитратной крови с этим же антигеном судят о наличии носительства данного антигена в организме испытуемого животного, по положительной агглютинации эритроцитов или отсутствии ее с каким-либо антигеном и положительной реакции цитратной крови с этим же антигеном судят о наличии иммунного статуса в отношении данного антигена в организме испытуемого животного. Изобретение позволяет ускорить идентификацию возбудителей вирусной и бактериальной природы и повысить эффективность оценки имунного статуса организма животных. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано при экспресс-диагностике заболеваний как вирусной, так и бактериальной этиологии, а также для оценки эпизоотического состояния хозяйств по различным инфекциям.

Известен ряд способов диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных путем постановки серологических реакций и анализа иммунного статуса животных.

Известен способ диагностики вирусных инфекций путем постановки реакции непрямой гемагглютинации - РНГА (см. авт. св. СССР N 1780008, кл. G 01 N 33/556, опубл. 07.12.92), предусматривающий разведение исследуемого материала стабилизирующим раствором, добавление сенсибилизированных антителами эритроцитов, инкубацию и учет результатов. При этом в качестве стабилизирующего раствора используют раствор крахмала. Способ позволяет осуществлять выявление вирусного антигена в инфицированном материале.

Однако постановка РНГА трудоемка, требует длительного времени, обусловленного необходимостью многократного введения вируса в организм лабораторного животного для получения специфической гипериммунной сыворотки. Кроме этого, применение специальных антительных эритроцитарных диагностикумов снижает эффективность способа из-за возможной их спонтанной самоагглютинации.

Известен также способ диагностики инфекционных заболеваний вирусной этиологии путем постановки реакции нейтрализации (см. В.Н. Сюрин и соавт. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. М.: Агропромиздат, 1986, с. 207), заключающийся в отборе крови, приготовлении сыворотки, смешивании ее в различных разведениях с вирусом, инкубировании смеси, внесении смеси в многослойную культуру клеток с последующим инкубированием. Учет результатов реакции проводит по количеству редуцированных бляшек. При этом тип вируса соответствует типу иммунной сыворотки.

Существенными недостатками способа являются длительность идентификации возбудителя и увеличение сроков постановки диагноза.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики инфекционных заболеваний животных путем постановки реакции нейтрализации (см. авт. св. СССР N 1797709, кл. G 01 N 33/53, опубл. 23.02.93), включающий отбор антителосодержащего материала от испытуемых животных, смешивание его с эталонным вирусом, инкубирование смеси, внесение ее в многослойную культуру клеток, инкубирование инфицированной культуры и учет результатов реакции, при этом в качестве антителосодержащего материала используют лимфоциты. Способ позволяет сократить время определения возбудителя в реакции нейтрализации на 4-11 дней и тем самым выявить возбудителя на 3-й день после заражения.

Однако недостатком способа, как и предыдущих, является длительность идентификации возбудителя (на 3-й день), что на практике приводит к значительным потерям молодняка особенно в первые дни жизни.

Кроме этого, эффективность способа незначительна ввиду ограниченного спектра используемых эталонных антигенов. Способ позволяет идентифицировать только вирус ящура крупного рогатого скота.

Изобретение направлено на решение задачи повышения эффективности способа диагностики инфекционных заболеваний животных за счет ускорения идентификации возбудителя как вирусной, так и бактериальной этиологии, а также за счет возможности оценки иммунного статуса организма животных при упрощении технологии диагностики.

Задача решается путем отбора крови от испытуемого животного, приготовления исследуемого материала, смешивания его с эталонными антигенами и учета результатов. При этом в качестве исследуемого материала используют одновременно цитратную кровь и эритроциты одного и того же испытуемого животного, смешивание эритроцитов и цитратной крови осуществляют с каждым из эталонных антигенов, в качестве которых используют как растворимые бактериальные, так и вирусные. Определяют характер реакции цитратной крови и отдельно характер агглютинации эритроцитов с одними и теми же эталонными антигенами и по соотношению показателей судят о наличии инфекционного заболевания. По отрицательной реакции цитратной крови с каким-либо антигеном и положительной агглютинации эритроцитов с этим же антигеном судят о наличии носительства данного антигена в организме испытуемого животного. По положительной реакции цитратной крови с каким-либо антигеном и положительной агглютинации эритроцитов или отсутствии ее с этим же антигеном судят о наличии иммунного статуса в отношении данного антигена в организме испытуемого животного.

В известных источниках патентной и научно-технической информации не описано способа ускоренной диагностики инфекционных заболеваний животных, основанного на одновременном учете характера реакции цитратной крови испытуемого животного с каким-либо эталонным антигеном и характера агглютинации эритроцитов этого же животного с этим же эталонным антигеном. При этом при определении характера агглютинации эритроцитов последние выступают в роли исследуемого материала. Обычно при постановке реакции гемагглютинации используются эритроцитарные диагностикумы, в которых на эритроцитах адсорбированы либо антигены, либо антитела. В изобретении эритроциты выступают не в роли диагностикума, а являются антител- или антител-антигеносодержащим материалом. Кроме этого, обычно в стандартных серологических реакциях, в том числе и при постановке реакции гемагглютинации, используют сыворотку крови, а в заявляемом способе - непосредственно кровь животных (цитратную), что значительно ускоряет процесс идентификации возбудителя заболевания.

Таким образом, неизвестность ускоренного способа диагностики с одновременной оценкой иммунного статуса организма животного и идентификацией возбудителя при вирусных или бактериальных инфекциях за счет учета характера реакции цитратной крови и характера агглютинации эритроцитов с одними и теми же антигенами позволяет сделать вывод о наличии в изобретении критерия "изобретательский уровень".

Известно, что иммунная система организма - это специализированная самостоятельная система клеток, тканей и органов, выполняющая защитную функцию. Как и всякая самостоятельная система, иммунная обладает способностью к саморегуляции. К регуляторам иммунного ответа относятся T- и B-лимфоциты, осуществляющие стимулирующее ("хелперное") или тормозящее ("супрессорное") действие, а также клетки нелимфоидной природы - элементы моноцито-макрофагального происхождения и тучные клетки, которые влияют на системный и клеточный иммунитет.

В то же время в 1985 г группой авторов Института клинической иммунологии Сибирского отделения АМН СССР - В.А. Козловым, И.Г. Цырловой, В.В. Чегляковой было установлено неизвестное ранее явление регуляции иммунного ответа. Явление зарегистрировано в качестве открытия (N 385 по заявке N ОТ-111137 от 28.06.85 г) и заключается в том, что в системе саморегуляции иммунитета организма, кроме вышеназванных регуляторов, участвуют и красные клетки крови. В частности показано, что иммунокомпетентные клетки, развиваясь как часть кроветворной системы, способны взаимодействовать с другими звеньями кроветворения (в частности, эритроидными) и испытывать регуляторные воздействия со стороны последних.

Заявляемый способ диагностики инфекционных заболеваний животных основан на использовании вышеописанного явления регуляции иммунного ответа.

Механизм реакции как цитратной крови, так и эритроцитов с эталонными антигенами основан в заявляемом способе на естественном взаимодействии эритроцитов, содержащих на своей поверхности иммуноглобулины или комплексы иммуноглобулинов, с бактериальными или вирусными антигенами.

Общеизвестно, что на поверхности эритроцитов могут адсорбироваться различные классы иммуноглобулинов. Установлено, что один из иммуноглобулинов (Ig M и Ig G) прочно связаны с поверхностью эритроцитов и их наличие определяет уровень системного иммунитета. При механическом воздействии эти связи сохраняются, что и свидетельствует о наличии определенного уровня системного иммунитета.

Другие иммуноглобулины, такие как Ig A и Ig A_c, определяющие уровень клеточного иммунитета, слабо связаны с поверхностью эритроцитов. При механическом воздействии эти связи нарушаются, что свидетельствует о наличии клеточного иммунитета.

Положительный характер реакции цитратной крови с антигеном и положительная агглютинация эритроцитов свидетельствует о наличии на эритроцитах иммуноглобулина, которые прочно связаны с поверхностью эритроцитов (Ig G и Ig M), и при механическом воздействии эти связи сохраняются. Это свидетельствует о наличии системного фактора иммунитета.

Положительный характер реакции цитратной крови с антигеном и отсутствие агглютинации эритроцитов с этим же антигеном свидетельствуют о наличии на поверхности эритроцитов цитратной крови тяжелых иммуноглобулинов. Поскольку они слабо связаны с поверхностью эритроцитов, то при механическом воздействии прочность этих связей нарушается и агглютинации с эталонным антигеном не происходит. Поэтому данное соотношение показателей свидетельствует о наличии клеточного фактора иммунитета.

Отрицательный характер реакции цитратной крови с антигеном и положительная агглютинация эритроцитов с этим же антигеном свидетельствуют о том, что на поверхности эритроцитов исследуемого животного присутствуют как иммуноглобулины, так и специфические антигены, которые образуют на поверхности эритроцитов цитратной крови комплексы антиген-антитело. В результате этого реакция цитратной крови с эталонным антигеном отрицательна, но при отмывании эритроцитов прочность комплекса нарушается, специфический антиген отмывается, связи с иммуноглобулинами освобождаются и происходит агглютинация с эталонным антигеном. Это свидетельствует о наличии специфических антигенов в организме животного.

Случай одновременной положительной реакции цитратной крови и агглютинации отмытых эритроцитов с исходными антигенами, когда отмытые эритроциты дают положительную реакцию с антигеном в меньшем разведении, а цитратная кровь дает положительную реакцию с этим же антигеном в большем разведении, рассматривается как наличие клеточного-гуморального иммунитета.

Отсутствие реакции цитратной крови и отсутствие агглютинации эритроцитов свидетельствуют либо об отсутствии заболевания, бактерио- или вирусоносительства, либо об отсутствии клеточного иммунитета к данному возбудителю.

Способ осуществляется следующим образом. Готовят исследуемый материал, приготавливают растворимые антигены бактериального или/и вирусного происхождения либо используют вакцинные вирусные препараты. Осуществляют раститровку полученных эталонных растворимых антигенов, смешивают антигены с исследуемым материалом, и производят учет и сравнение результатов реакции цитратной крови с агглютинацией отмытых эритроцитов к одним и тем же эталонным антигенам.

В пробирки с лимонно-кислым натрием отбирают по 0,501 мл крови от исследуемых животных путем прокола иглой ушной вены.

Готовят исследуемый материал. Для этого из части объема полученной цитратной крови готовят 2,5%-ную взвесь на физиологическом растворе. Из оставшегося объема цитратной крови готовят 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов следующим образом. Добавляют к цитратной крови в соотношении 1:10 физраствор, полученную смесь центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают пастеровской пипеткой, после чего к оставшемуся осадку снова добавляют физраствор в соотношении 1:10 и повторно центрифугируют при описанных выше условиях.

После трехкратного отмывания смеси получают осадок в виде отмытых эритроцитов, из которого путем добавления физиологического раствора готовят 2,5%-ную взвесь.

В зависимости от целей исследования приготавливают различные растворимые антигены бактериального и/или вирусного происхождения. Бактериальные растворимые антигены готовят с использованием штаммов различных микроорганизмов: стрептококков, пастерелл, сальмонелл, эшерихий и других. Для этого соответствующие культуры засевают на твердые питательные среды. Суточную культуру смывают физиологическим раствором и доводят до стандарта мутности 10 млрд. м. т. /мл. Культуру различают по флаконам и подвергают многократному замораживанию-оттаиванию (10-20 раз в зависимости от штаммов). Содержимое флаконов проверяют на стерильность путем посева на питательные среды. По отсутствию роста культур на средах судят о стерильности культуры. После этого культуру центрифугируют в течение 15 мин со скоростью 3000 об/мин. Полученная надосадочная жидкость будет растворимым бактериальным антигеном.

Вирусные растворимые антигены получают путем посева соответствующего вируса на культуру ткани СПЭВ. При наличии цитопатического эффекта культуру подвергают замораживанию-оттаиванию (не менее 3 раз), центрифугируют в течение 30 мин со скоростью 3000 об/мин. Полученная надосадочная жидкость будет растворимым вирусным антигеном. При этом концентрацию вируса определяют путем титрования на культуре ткани СПЭВ по ЦПД.

Поскольку реакция антиген-антитело идет при определенном соотношении, проводят раститровку полученных эталонных бактериальных и вирусных растворимых антигенов, что, в конечном итоге, повышает эффективность данного способа.

Раститровку осуществляют на специальных планшетках с лунками. Вначале все лунки заполняют физиологическим раствором в количестве 0,05 мл в каждой. Затем первый ряд лунок заполняют различными эталонными антигенами как бактериальными, так и вирусными (в зависимости от целей исследования) также в количестве по 0,05 мл в каждой лунке. Проводят титрование антигенов, получая кратные разведения 1: 2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128, путем последовательного перенесения взвеси в объеме 0,05 мл в каждую последующую лунку, оставляя последний ряд лунок с физраствором в качестве контроля. Заполнение лунок одними и теми же антигенами и раститровку антигенов проводят дважды для осуществления одновременного учета реакции как с цитратной кровью, так и с отмытыми эритроцитами.

Осуществляют смешивание антигенов с исследуемым материалом. Для этого в первый набор раститрованных эталонных антигенов добавляют в каждую лунку по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси цитратной крови исследуемого животного, а во второй набор тех же эталонных антигенов добавляют по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси отмытых эритроцитов этого же животного. При этом контролем будет являться смесь исследуемого материала (2,5%-ная взвесь отмытых эритроцитов и 2,5%-ная взвесь цитратной крови) с физраствором в последних рядах лунок.

За положительный результат реакции принимают наличие осадка в виде зонтика с неровными краями по всей поверхности лунки.

За отрицательный результат реакции принимают наличие осадка в виде пуговки или точки на две лунки.

При этом реакция в контроле должна быть всегда отрицательна.

Пример 1. Осуществляют отбор крови в количестве по 0,5 мл в пробирки с лимонно-кислым натрием от 10 безмолозивных поросят сразу после рождения.

Для приготовления 2,5%-ной взвеси цитратной крови к 0,1 мл крови каждого животного добавляют по 4 мл физраствора. К оставшемуся объему цитратной крови каждого животного добавляют физраствор в объеме 1:10 и осуществляют отмывание эритроцитов путем трехкратного центрифугирования каждой пробы в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Затем из полученного осадка готовят 2,5 %-ную взвесь путем добавления к 0,1 мл осадка каждой пробы 4 мл физраствора.

Используют заранее приготовленный растворимые бактериальные антигены: стрептококковый, пастереллезный, сальмонеллезный, колибактериозный, а также вирусные антигены - вакцинный штамм чумы ("ЛК - ВНИИВВ и М") и вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГЭС) из штамма ВГНКИ, инактивированную при 37^oC в течение 7 дней.

Проводят дважды для одного животного раститровку указанных шести антигенов в разведении 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128 на планшетках с лунками путем добавления к 0,05 мл физраствора по 0,05 мл каждого из антигенов. В первый набор раститрованных антигенов добавляют по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси цитратной крови исследуемого поросенка, а во второй набор раститрованных антигенов добавляют по 0,05 мл 2,5%-ной взвеси отмытых эритроцитов этого же поросенка. Через 1-1,5 ч производят учет результатов реакции.

Результаты реакции у всех 10 поросят как с бактериальными, так и с вирусными антигенами в обоих случаях был отрицателен. Это свидетельствует об отсутствии иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов в организме безмолозивных поросят.

Пример 2. Осуществляют отбор крови по 0,5-1 мл от 10 поросят 10-дневного возраста в пробирки с лимонно-кислым натрием. Подготовку исследуемого материала и его смешивание с растворимыми антигенами осуществляют в соответствии с описанным в примере 1. При этом в качестве антигенов используют те же, что и в примере 1.

Результат исследования поросят 10-дневного возраста, приведенный в табл. 1, свидетельствует о происходящей передаче от организма матери к поросенку колострального иммунитета к бактериальным и вирусным антигенам, а также о носительстве возбудителей инфекционных заболеваний в организме животного. В таблице в числителе указан результат реакции с отмытыми эритроцитами, а в знаменателе - с цитратной кровью. При этом положительные результаты реакции, указанные в табл. 1, представлены вне зависимости от разведения антигенов.

Например, результат реакции цитратной крови со стафилококкозным антигеном у двух поросят положителен (см. пробы 1 и 8 табл. 1), а результат реакции отмытых эритроцитов с этим же антигеном отрицателен, что может свидетельствовать о наличии клеточного иммунитета к данному возбудителю. У этих же поросят результат реакции отмытых эритроцитов с вакцинным штаммом чумы положителен, а цитратной крови с этим же штаммом отрицателен, что может свидетельствовать о носительстве вируса чумы в организме животных.

Пример 3. Осуществляют отбор крови по 0,5-1 мл от поросят 10-, 20-, 45- и 65-дневного возраста по 10 проб в каждой группе. Подготовку исследуемого материала, его смешивание с антигенами и учет результатов реакции ведут в соответствии с описанным в примерах 1 и 2.

Результат исследований представлен в табл. 2, где произведены систематизация иммунного статуса животных и динамика его измельчения в зависимости от возрастных групп и инфицирования животных. При этом в числах указан процент положительно реагирующих животных либо не соответствующий фактор иммунитета, либо на носительство того или иного вида возбудителя.

Исследования показали, что реакции у животных к бактериальным и вирусным антигенам в одних и тех же хозяйствах могут отличаться от этих же реакций в других хозяйствах, поскольку они являются отражением конкретной эпизоотической ситуации отдельных свиноводческих хозяйств.

Пример 4. Исследовались индивидуально 254 собаки. Так, в группе из 10 собак с различными клиническими признаками диареи проведено обследование на наличие вируса энтерита, чумы и гепатита. В опыте использованы собаки, невакцинированные в отношении данных возбудителей заболеваний.

Подготовку исследуемого материала, его смешивание с вирусными антигенами и учет результатов реакции осуществляли в соответствии с примером 1. При этом в качестве вирусных антигенов использовали три: вакцину против чумы плотоядных, парвовирусный энтеритный антиген, гепатитный антиген. Результат исследований представлен в табл. 3.

В таблице так же, как в примере 2, в числителе указан результат реакции с отмытыми эритроцитами, а в знаменателе - с цитратной кровью.

Из табл. 3 следует, что диагноз чумы подтвержден у четырех собак (см. пробы 1, 2, 3, 10 таблицы), поскольку выявлена активизация клеточного и системного иммунитета к возбудителю чумы. Диагноз энтерита подтвержден в одном случае (см. пробу 6 табл. 3), а диагноз гепатита подтвержден у пяти собак (см. пробы 4, 5, 7, 8, 9 таблицы).

Таким образом, в зависимости от физиологического состояния организма соотношение реакции цитратной крови с агглютинацией эритроцитов может характеризовать индивидуальное течение заболевания у отдельных видов животных.

Таким образом, заявляемый способ позволяет быстро и точно определять эпизоотическое состояние хозяйств по различным бактериальным и вирусным инфекциям. Кроме этого, с помощью данного метода возможно определение периода инфицирования животных, который позволяет своевременно осуществлять вакцинацию животных против соответствующего возбудителя.

Заявляемый способ позволяет определять фон бактерио-и вирусоносительства, связь вирусоносительства с секундарной микрофлорой, а также напряженность и длительность пассивного и активного системного и клеточного иммунитета.

Формула изобретения

Способ диагностики инфекционных заболеваний животных, включающий отбор крови от испытуемого животного, приготовление исследуемого материала, смешивание его с эталонными антигенами и учет результатов реакции, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют одновременно цитратную кровь и эритроциты одного и того же испытуемого животного, смешивание цитратной крови и эритроцитов осуществляют с каждым из эталонных антигенов, в качестве которых используют растворимые как бактериальные, так и вирусные, определяют характер реакции цитратной крови и отдельно характер агглютинации эритроцитов с одними и теми же эталонными антигенами и по соотношению показателей судят о наличии инфекционного заболевания, при этом при положительной агглютинации эритроцитов с каким-либо антигеном и отрицательной реакции цитратной крови с этим же антигеном судят о наличии носительства данного антигена в организме испытуемого животного, при положительной агглютинации эритроцитов или отсутствии ее с каким-либо антигеном и положительной реакции цитратной крови с этим же антигеном судят о наличии иммунного статуса в отношении данного антигена в организме испытуемого животного.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 24.08.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 12-2004

Извещение опубликовано: 27.04.2004        

---