Средство для лечения онкологических заболеваний в виде водного экстракта растительного сырья и способ его получения

 

Изобретение относится к средствам для лечения онкологических заболеваний в виде водных экстрактов растительного сырья и способам его получения. Средство содержит водные экстракты растений родов Geranium, Plantago и растения вида Calendula officinalis, полученные при следующем соотношении растений и воды, г: Geranium - 10 - 60 (сух.) или 300 - 360 (свеж.), Plantago -10 - 60 (сух.), Calendula officinalis - 10 - 60 (сух.), вода - 3000. Средство может дополнительно содержать экстракт растения вида Pentaphilloides fruticosa, полученный из 10 - 60 г (сух.), а также экстракт растения рода Angelica, полученный из 10 - 60 г (сух.). Предложен способ получения их водных экстрактов путем вымачивания в воде с последующим процеживанием и центрифугированием. Средство и способ позволяют упростить средства для лечения онкологических больных и способы их получения. 2 с.п. и 4 з.п.ф-лы. 1 ил., 5 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности, к фитотерапии и касается средства для лечения онкологических заболеваний, представляющего собой водный экстракт растительного сырья, и способа его получения.

Известен противораковый препарат, включающий в качестве одного из компонентов экстракт растения рода Geranium. В состав этого препарата входят также серная и борная кислота, спирт и глицерин.

Недостатком этого средства является то, что оно может быть рекомендовано только для наружного применения.

Известен состав, рекомендованный в качестве вспомогательного средства, повышающего противоопухолевую активность, в состав которого входят в числе прочих водных или водно-органических экстрактов растений экстракты Astragalis, Pasonia, Angelica.

Известен многокомпонентный состав противоопухолевого назначения, включающий в качестве компонентов растения рода Plantago и Angelica.

Недостатком этих композиций является их многокомпонентность.

Задачей изобретения являлось изыскание средства для лечения онкологических заболеваний в виде водных экстрактов растительного сырья, представляющего собой достаточно простую композицию, и способа его получения.

Для решения этой задачи предложено средство, содержащее в виде водных экстрактов растения родов Geranium, Plantago, растение вида Calendula officinalis в следующем соотношении, г: Geranium - 300 - 360 (свеж.) или 10 - 60 (сух.) Plantago - 100 - 60 (сух.) Calendula officinalis - 10 - 60 (cyx.) Вода - 3000 Возможно добавление к названной смеси растения Pentaphilloides fruticosa в количестве 10 - 60 г (сух.), а также добавление, кроме Pentaphilloides fruticosa, растения рода Angelica в количестве 10 - 60 г (сух.). Применение отдельных компонентов предлагаемого средства в количествах меньших, чем нижние пределы указанных диапазонов значений, снижает терапевтический эффект, а верхние пределы указанных диапазонов ограничены объемом воды, необходимым для получения водных экстрактов.

В предлагаемой композиции растение рода Geranium может быть представлено видами sibiricum, pratense и robertianum; Plantago - видами lanceolata и media, a Angelica - видами sylvestris и decurrens.

Наиболее близким аналогом предложенного изобретения является описание способа, получения средства растительного происхождения для лечения онкологических заболеваний.

Известен также способ получения средства растительного происхождения, включающий экстракцию измельченной травы водой путем вымачивания (мацерации) с последующей фильтрацией и повторной мацерацией растительного сырья. Этот метод представляется технологически сложным, т.к. предусматривает двухстадийную мацерацию.

Задачей предлагаемого изобретения являлась разработка простого способа получения водного экстракта растений. Для решения этой задачи предложено вымачивание растений (в виде травы, листьев или корней) в воде с последующим процеживанием и центрифугированием.

Биологическая активность растительных экстрактов проверялась путем определения антиоксидантной и цитотоксической активности in vitro, токсичности и противоопухолевой активности in vivo.

Антиоксидантную активность экстрактов определяли по способности образца ингибировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенате печени мышей.

Цитотоксическую активность экстрактов in vitro определяли с использованием биотеста, основанного на ингибировании пролиферации перевивной культуры клеток аденокарциномы легкого человека А-549.

Оценку противоопухолевой активности экстрактов проводили на мышах BDF₁ с лейкемией, используя различные дозы экстрактов. Критерием оценки служили торможение роста опухоли и увеличение продолжительности жизни животных.

Кроме того, оценивали влияние экстрактов на терапевтическую активность цитостатика-цисдихлордиамино платины (ДДП).

Нижеследующие примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.

Пример 1. Берут измельченные: свежую траву Geranium sibiricum в количестве 360 г, листья (сух.) Plantago lanceolata - 25 г, листья (сух.) Calendula officinalis - 25 г и замачивают в 3000 г воды при температуре 25^oC в течение 8 дней. После окончания процедуры вымачивания (мацерации) экстракт процеживают и центрифугируют в стандартных условиях (20^oC, 3000 об/мин, 40 мин). Осадок отбрасывают, а экстракт используют.

Примеры 1a-1e. Экстракты растений получают по методике примера 1, но меняют количество компонентов смеси и условия мацерации. Составы приведены в таблице 1.

Примеры 2-2h. Экстракты растений получают по методике примера 1, но в состав вымачиваемой смеси добавляют измельченные сухие побеги растения Pentaphilloides fruticosa. Составы растительного сырья и условия мацерации приведены в табл. 1.

Примеры 3-3f. Экстракты растений получают по методике примера 1, но в состав вымачиваемой смеси, кроме Pentaphilloides fruticosa, вводят измельченные подземные органы растения Angelica (виды sylvestris и decurrens). Составы растительного сырья и условия мацерации приведены в табл. 1. (на 3-х листах).

Определение антиоксидантной активности растительных экстрактов.

Антиоксидантную активность изучали с использованием метода, основанного на способности исследуемого образца ингибировать процессы ПОЛ в гомогенате печени мышей. Печень мышей BDF-1 (беспородных) гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с последующим центрифугированием. Гомогенат печени вносили из расчета 5-6 мг белка на пробу. Объем пробы доводили до 0,5 мл раствором исследуемого на антиоксидантную активность образца. Пробы инкубировали в течение 3 ч при 37^oC.

Концентрацию продуктов ПОЛ определяли по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой. За условную единицу активности исследуемого образца принимали количество антиоксиданта, необходимое для 50% ингибирования ПОЛ.

Результаты представлены в табл. 2 и 2a.

Как видно из таблицы 2, экстракты 1, 2 и 3 обладают высокой антиоксидантной активностью в тесте in vitro, которая значительно превышает таковую известных антиокислительных витаминов: A, C и β -каротина (в 4,28 и 55 раз соответственно). При хранении растительных экстрактов (табл. 2а) в течении 16-30 дней антиоксидантная активность их снижается в 1,5-2 раза за счет образования осадка, в который вовлекаются и активные компоненты, однако она все равно остается значительно выше активности витаминных препаратов.

Определение цитотоксической активности образцов экстрактов in vitro.

При постановке цитотоксического биотеста in vitro в лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета (Sarstedt, США) вносили по 100 мкл суспензии клеток линии А-549 в концентрации 1х10⁵ клеток/мл с добавлением через 24 ч серийных разведений растительных препаратов в диапазоне 1:4 - 1:64, что соответствует 3,0 - 0,1 мг/мл в объеме 100 мкл/лунку. В качестве внутреннего лабораторного контроля использовали ДДП в диапазоне концентраций 40 - 1,25 мкг/мл в конечном разведении. Цитотоксическую активность экстрактов и ДДП оценивали колориметрическим методом. Результаты выражали в процентах ингибирования пролиферации тест-культуры А-549. За цитотоксическую активность образца принимали максимальный титр образца, при котором наблюдался биологически значимый (>50%) уровень ингибирования пролиферации культуры клеток А-549.

Результаты приведены в табл. 3.

Как видно из таблицы 3, исследованные образцы растительных экстрактов обладают цитотоксической активностью в опытах in vitro. Наибольшая способность к ингибированию пролиферации культуры клеток А-549 наблюдалась у образца 2 (при концентрации 0,1 мг/мл - 66-80%), однако она была в 10 раз меньше, чем ингибирующая способность ДДП (0,01 мг/мл-68%) - препарата, который традиционно используется как контроль индуцированной цитотоксичности.

Изучение переносимости образцов растительных экстрактов Изучение переносимости и безвредности образцов проводили на животных с L-1210, привитой подкожно. Образцы экстрактов вводили внутрь через зонд многократно в течение всей жизни животных, начиная с первого дня роста опухоли, в разовых дозах 5,4 и 10,8 мл/кг в объеме 0,2 мл или однократно внутрибрюшинно в объеме 1 мл. Контрольные мыши получали 0,9% раствор NaCI вместо растительных экстрактов.

Токсический эффект оценивали по изменению массы тела мышей, а также их внешнему виду (поведению, виду шерстного покрова, их двигательной активности). Для количественной оценки изменений двигательной активности вводили интегральный показатель: (а/b)·100%, где а - общее количество мышей с пониженной двигательной активностью с 1-го по 6-й дни роста опухоли, b - общее количество наблюдений с 1-го по 6-й дни роста опухоли (1 наблюдение - 1 живая мышь за 1 день).

Результаты проведенных экспериментов показали, что растительные экстракты в разовой дозе 5,4 мл/кг не влияют на массу тела, поведение, вид шерстного покрова и подвижность мышей. В то время как применение в разовой дозе 10,8 мл/кг препаратов растительного происхождения некоторых серий оказывало слабый токсический эффект, выражающийся в снижении двигательной активности подопытных животных в 5-10% наблюдений (см. фигуру).

Увеличение разовой дозы растительных экстрактов до 1 мл (максимально допустимый объем) при однократном внутрибрюшинном введении препаратов серий b, с, d, e не приводило к развитию видимых нарушений в поведении и внешнем виде животных и не вызывало их гибели, что указывает на отсутствие возможности определения величин ЛД₁₀, ЛД₅₀, ЛД₁₀₀ для данных растительных экстрактов.

Определение противоопухолевой активности образцов растительных экстрактов Лимфоидную лейкемию L1210 прививали самцам BDF₁ в стерильном физиологическом растворе по 3·10⁶ клеток в объеме 0,2 мл. День перевивки считали нулевым днем роста опухоли. Образцы экстрактов и ДДП вводили в дозах и режимах, указанных в таблице 4, 5.

Лечение животных начинали через 24 часа после перевивки опухоли, контрольные животные получали физиологический раствор вместо образцов растительных экстрактов. Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли (ТРО), вычисленному по формуле ТРО=[(V_контр-V_опыт)/V_контр]·100, средней продолжительности жизни (СПЖ), увеличению продолжительности жизни (УПЖ), вычисленному по формуле
УПЖ=[(СПЖ_опыт-СПЖ_контр)/СПЖ_контр]·100%.

Биологически значимым эффектом считали ТРО>50%, УПЖ>25%.

Полученные данные обрабатывали по методу Фишера-Стьюдента с применением статистических программ. Различия считали достоверными при p<0,05.

В табл. 5 представлены результаты влияния растительных экстрактов на лечебный эффект ДДП. Как видно из таблицы 5, препараты 2 и 3 увеличивают терапевтический эффект цитостатика, приводя к возрастанию величины ТРО на 6,8 дни роста опухоли.

Как видно из табл. 4 и 5, препараты 2 и 3 не снижают терапевтического эффекта ДДП, а при определенных режимах введения даже усиливают его. Препарат 3 обладает самостоятельным слабовыраженным противоопухолевым действием, вызывая биологически значимое торможение роста опухоли в ранние сроки ее развития.

Таким образом, растительные экстракты могут быть перспективными для применения в онкологической практике при включении их в схемы противоопухолевой терапии.

Формула изобретения

\ \ \1 1. Средство для лечения онкологических заболеваний в виде водного экстракта растительного сырья, отличающееся тем, что оно включает экстракты растений родов Geranium, Plantago и растение вида Calendula officinalis, полученные при следующем соотношении растений и воды, г: \\\3 Geranium \\\7 10 - 60 сухое или 300 - 360 свежее \\\3 Plantago \\\7 10 - 60 сухое \\\3 Calendula officinalis \\\7 10 - 60 сухое \\\3 Вода \\\7 3000 \\\2 2. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит экстракт растения вида Pentaphilloides fruticosa, полученный из 10 - 60 г сухого растения. \\\2 3. Средство по п.2, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит экстракт растения рода Angelica, полученный из 10 - 60 г сухого растения. \\\2 4. Способ получения водного экстракта из растительного сырья для лечения онкологических заболеваний, отличающийся тем, что в воде вымачивают растения родов Geranium, Plantago и растение вида Calendula officinalis с последующим процеживанием и центрифугированием. \\\2 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в состав растительного сырья для вымачивания дополнительно вводят растение Pentaphilloides fruticosa. \\\2 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в состав растительного сырья для вымачивания дополнительно вводят растение рода Angelica.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8