Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных и птиц

 

Способ может быть использован в промышленном производстве сухой живой вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных. Периодическое управляемое культивирование сальмонелл проводят в питательной среде на основе белкового концентрата(СБК), содержащей экстракт кормовых дрожжей, натрий фосфорнокислый двузамещенный и натрий хлористый, в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Полученную культуру концентрируют, разводят защитной средой, расфасовывают во флаконы и лиофильно высушивают. Применение среды на основе СБК одновременно с управляемым способом культивирования позволяет повысить накопление жизнеспособных бактерий, выход сальмонеллезной культуры и готового препарата Вакцина, полученная этим способом, более стабильна по биологическим свойствам, в том числе и по иммуногенности. 1 з.п. ф-лы. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве сухой живой вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных. Известен способ получения сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней ("Индустрия по изготовлению и контролю сухой живой вакцины против сальмонеллеза (паратифа) свиней из штамма ТС-177", утвержденная 4 февраля 1980 г., "Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против сальмонеллеза свиней из супрессорного ревертанта Salmonella cholerae-suis N 9", утвержденная 7 апреля 1994 г.).

Существующий способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных обладает серьезными недостатками: культивирование микроорганизмов проводят в среде на основе нестандартного, зачастую недостаточно качественного, дорогостоящего и дефицитного пищевого белка - мясного гидролиза по Хоттингеру; препараты, изготовленные с применением этого гидролизата нестабильны, нестандартны и недостаточно высокого качества.

Целью изобретения является снижение себестоимости вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных, а также повышение качества, стабильности и стандартности биологических свойств препарата.

Цель достигается за счет того, что периодическое управляемое выращивание сальмонелл проводят в более дешевой питательной среде на основе сухого белкового концентрата см. патент РФ 2073517 (СБК), содержащего 27 аминокислот по сравнению с 18 аминокислотами в мясном гидролизате. Культивирование проводят с регулированием pH, парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода (pO₂), окислительно-восстановительного потенциала (eH) и дробной подачей глюкозы, концентрируют полученную культуру, бактериальную массу ресуспендируют в защитной среде и высушивают. (Гидролизат СБК-гидролизат белковой основы для бактериологических питательных сред по п. 2073517).

Способ осуществляют следующим образом. В стерильный ферментер загружают питательную среду на основе СБК, мас.%: Гидролизат сухого белкового концентрата - 4,6 - 6,5 Экстракт кормовых дрожжей - 0,1 - 0,6 Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,2 - 1,0 Натрий хлористый - 0,15 - 0,45 Вода дистиллированная - Остальное Готовая стерильная питательная среда должна содержать 150,0 - 210,0 мг% аминного азота и иметь pH 7,6 - 7,8. Питательную среду в ферментере засевают культурной сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и выращивают при температуре (37±1)^oC в течение 6 - 8 ч.

После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -110 - -130 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и при минимальной скорости вращения мешалки, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 15 - 25% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости регулируют раствором гидроокиси натрия, поддерживая pH на уровне 7,6 - 7,8, дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05 - 0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующимся резким повышением pO₂ при постоянных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения pH культуральной жидкости. Полученную культуру концентрируют, разводят средой, расфасовывают во флаконы и лиофильно высушивают.

Пример 1.

Способ изготовления вакцины с минимальными значениями параметров. Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, мас.%: Гидролизат СБКК - 4,6 Экстракт кормовых дрожжей - 0,1 Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,2
Натрий хлористый - 0,15
Вода дистиллированная - До 100
Питательная среда содержит 150 мг% аминного азота и имеет pH 7,6. Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава и выращивают при температуре (37 ± 1)^oC в течение 6 - 8 ч. После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культурной жидкости снижают до -110 - -130 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и при минимальной скорости вращения мешалки, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 15 - 25% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости регулируют 10%-ным раствором гидроокиси натрия, поддерживая pH на уровне 7,6 - 7,8 дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05 - 0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO₂ при постоянных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения pH культуральной жидкости. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 23,0 млрд живых микробных клеток (м. к.). Полученную культуру концентрируют, разводят защитной средой, расфасовывают во флаконы и лиофильно высушивают.

Пример 2.

Способ изготовления вакцины с оптимальными значениями параметров. Способ осуществляют аналогично примеру 1, только для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата - 5,5
Экстракт кормовых дрожжей - 0,4
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,6
Натрий хлористый - 0,3
Вода - Остальное
Питательная среда содержит 180 мг% аминного азота и имеет pH 7,7. Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и выращивают в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 45 млрд м.к. Полученную культуру концентрируют, разводят защитной средой, расфасовывают во флаконы и лиофильно высушивают.

Пример 3
Способ изготовления вакцины с максимальными значениями параметров. Способ осуществляется аналогично примеру 1, только для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата - 6,5
Экстракт кормовых дрожжей - 0,6
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,0
Натрий хлористый - 0,45
Вода - До 100
Питательная среда содержит 210 мг% аминного азота и имеет pH 7,8. Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и выращивают в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 28,0 млрд м.к. Полученную культуру концентрируют, разводят защитной средой, расфасовывают во флаконы и лиофильно высушивают.

Пример 4
Способ изготовления вакцины со значениями параметров ниже минимальных. Способ осуществляется аналогично примеру 1, только для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи, мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата - 3,5
Экстракт кормовых дрожжей - 0,05
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,1
Натрий хлористый - 0,1
Вода - До 100
Питательная среда имеет pH 7,5 и содержит 90 мг% аминного азота. Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и выращивают в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 2,0 млрд м.к. В полученной культуре наблюдали полиморфизм микробных клеток.

Пример 5.

Способ изготовления вакцины со значениями параметров выше максимальных. Способ осуществляют аналогично примеру 1, только для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе гидролизата СБК, приготовленную по следующей прописи мас.%:
Гидролизат сухого белкового концентрата - 7,0
Экстракт кормовых дрожжей - 0,7
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,2
Натрий хлористый - 0,5
Вода - До 100
Питательная среда содержит 240 мг% аминного азота и имеет pH 7,9. Среду засевают культурой сальмонелл, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава, и выращивают в соответствии с известным алгоритмом управления процессом. Накопление биомассы в 1 см³ среды составляет 10,0 млрд м.к. В полученной культуре наблюдается полиморфизм микробных клеток.

Технологические параметры изготовления серий сухой живой вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных, указанные в примерах, приведены в таблице.

Преимущества заявленного способа перед известным:
1. Применение среды на основе СБК одновременно с управляемым способом культивирования позволяет повысить накопление жизнеспособных бактерий, выход сальмонеллезной культуры и готового препарата с одного и того же объема питательной среды по сравнению со средой, приготовленной на основе мясного гидролизата.

2. Вакцина, полученная этим способом, более стабильна по биологическим свойствам, в том числе и по иммуногенности.

3. Использование питательной среды на основе СБК снижает себестоимость вакцины.

Формула изобретения

1. Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных и птиц, включающий засев вакционного штамма сальмонелл в жидкую питательную среду, культивирование с последующей обработкой полученной культуры и лиофилизацию бактериальной суспензии в защитной среде, отличающийся тем, что при культивировании сальмонелл используют питательную среду на основе гидролизата белковой основы для бактериологических питательных сред, экстракта кормовых дрожжей, натрия фосфорнокислого двузамещенного, натрия хлористого и дистиллированной воды при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Гидролизат белковой основы для бактериологических питательных сред (по сухому остатку) - 4,6 - 6,5
Экстракт кормовых дрожжей - 0,1 - 0,6
Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,2 - 1,0
Натрий хлористый - 0,15 - 0,45
Вода дистиллированная - Остальное
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после засева окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости устанавливают равным (-110) - (-130)мВ, парциальное давление в ней кислорода поддерживают на уровне 15 - 25% давления насыщения ее кислородом воздуха при ее рН, равном 7,6 - 7,8, причем культивирование прекращают в логарифмической или стационарной фазе роста культуры.

РИСУНКИ

Рисунок 1