Способ получения гликозаминогликанов

 

Изобретение относится к медицине. Сущность изобретения: ткань измельчают, обрабатывают ультразвуком, гидролизуют смесью ферментов, кипятят в течение 5 - 30 мин, центрифугируют от 3 до 45 тыс.об/мин, диализируют в течение 5 - 6 дней, затем повторно центрифугируют и осаждают гликозаминогликаны растворами этилацетатов щелочных и/или щелочноземельных металлов. Техническим результатом изобретения является получение конечной субстанции с высоким содержанием гликозаминогликанов, лишенной белка и других примесей.

Изобретение относится к медицине, более конкретно к офтальмологии и может быть использовано для получения основных компонентов соединительной ткани - гликозаминогликанов для применения их в качестве лекарственной формы при лечении заболеваний и повреждений роговицы глаза.

Известен способ получения сульфатированных гликозаминогликанов (патент РФ N 2056851. Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из роговиц, авт. Багров С.Н., Ларионов Е.В., Панаск А.Ф.), путем обработки роговиц ферментом папаином, трихлоруксусной кислотой с последующим диализом.

Недостатком указанного способа является то, что при обработке тканей одним ферментом, часть гликозаминогликанов остается в неразрушенной ткани, особенно если ткань плотная, что приводит к снижению выхода конечного продукта.

Задачей изобретения является разработка универсального способа получения полного набора гликозаминогликанов, содержащихся в биологических тканях.

Техническим результатом изобретения является получение конечной субстанции с высоким содержанием гликозаминогликанов, лишенной белка и других примесей.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гликозаминогликанов биологическую ткань измельчают, обрабатывают ультразвуком, гидролируют смесью ферментов, кипятят от 5 до 30 мин., центрифугируют от 3 до 45 тыс. об/мин, диализируют в течение 5-6 дней и осаждают гликозаминогликаны растворами этилацетатов щелочных и/или щелочноземельных металлов.

Измельчение биологической ткани (роговицы быков, свиней, стекловидное тело, трахея крупного рогатого скота, плавники акул), проводят механическим способом на ультраизмельчителе (Ai Ko, Japan) до получения однородной массы, лишенной крупных частиц ткани.

После измельчения гомогенат ткани дополнительно дезинтегрируют в ультразвуковой ванне в кавитационном режиме, время обработки зависит от плотности частиц ткани и степени начального измельчения.

Гидролиз ткани ведут с помощью ферментов, поскольку основными компонентами любой животной биологической ткани являются белки, а гликозаминогликаны, как правило, тесно связаны с ними. Гидролитическое (расщепляющее) действие ферментов всегда осуществляется при определенной температуре и для большинства ферментов лежит в диапазоне от 37 до 66^oC. Время гидролиза для большинства ферментов также вполне определенно, оно определяется скоростью ферментсубстратного взаимодействия.

После гидролиза полученный гомогенат центрифугируют от 3 до 6 тыс. об/мин. При центрифугировании со скоростью менее 3 тыс. об/мин осаждается менее 50% гомогената, а при скорости выше 45 тыс.об/мин, часть основного продукта уходит в осадок.

Диализ надосадка гидролизата проводят в течение 5-6 дней. При диалезе менее 5 дней в растворе обнаруживаются белки и другие примеси, а при диализе более 6 дней качественный и количественный состав гликозаминогликанов в растворе остается постоянным, что делает продолжение диализа нецелесообразным.

Повторное центрифугирование диализата позволяет окончательно удалить примеси из раствора.

Осаждение гликозаминогликанов из раствора производят с помощью насыщенных растворов этилацетатов щелочных и/или щелочноземельных металлов.

Способ осуществляется следующим образом. Полученную свежую биологическую ткань отмывают от примесей крови, жировой ткани, взвешивают, измельчают на ультраизмельчителе (фирма Ai Ko, Japan), помещают в ультразвуковую "ванну" в режим кавитации, затем гомогенат обрабатывают смесью протеологических ферментов, которые подбирают конкретно для каждой ткани, именно для роговиц свиней и быков - смесь ферментов 0,01% p-p трипсина (химотрипсина) и 0,0125% p-p папаина; для трахей крупного рогатого скота 0,005% p-p коллагеназы и 0,125% p-p папаина; для стекловидного тела 0,0050 p-p коллагеназы и 0,125% p-p папаина. Гидролиз ткани ведут на водяной бане при 37-66^oC, по окончании гидролиза гомогенат кипятят в течение 5-30 мин, помещают гомогенат в центрифужные стаканы и центрифугируют от 3 до 45 тыс.об/мин, надосадок в диализных мешках погружают в дистиллированную воду с непрерывным потоколом. Через 5-6 дней диализ прекращают. Раствор центрифугируют и добавляют в него равный объем насыщенного раствора ацетата (натрия) и после осаждения гликозаминогликанов промывают их 96% этанолом, высушивают. Количественный и качественный состав гликозаминогликанов делают по Временной Фармакопейной статье N 42-2678-96 на препарат "Сульфатированные гликозаминогликаны".

Для лучшего понимания способ поясняется примером конкретного исполнения.

Пример. 1. Из глаз свиней бритвой вырезают роговицы и помещают их в стеклянный сосуд, при достижении общей массы 1 кг их механически измельчают на ультраизмельчителе и после обработки ультразвуком в кавитационном режиме в течение 1 ч гомогенат проверяют на наличие в нем неразрушенных частиц.

Гидролиз роговиц приводят смесью ферментов 50 мл 0,01% раствора трипсина и 50 мл 0,125% раствора папаина, которую добавляют в гомогенат. Гидролиз ведут на водяной бане при 65^oC в течение 4-5 ч. Через 5-6 ч после остывания гидролизат помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют при 30 тыс. об/мин в течение 30 мин.

Нaдосадок сливают в диализные мешки и помещают их в сосуды с дистиллированной водой, которая подается непрерывно. Через 5-6 дней диализ прекращают. Раствор сливают в центрифужные стаканы и центрифугируют его при 30 тыс. об/мин в течение 30 мин.

К 1 л раствора добавляют 3 л насыщенного раствора этилацетата калия. Через 3-4 дня недосадок сливают, а осадок промывают 96% этанолом, высушивают, герметично упаковывают и стерилизуют.

Качественный и количественный анализ полученных гликозаминогликанов проводят по Временной Фармакопейной cтатье 42-2677-96.

С помощью данного способа экстрагируется от 95 до 99,5% всех гликозаминогликанов, содержащихся в конкретной ткани.

Формула изобретения

Способ получения гликозаминогликанов, включающий обработку биологической ткани ферментом с последующим диализом, отличающийся тем, что ткань измельчают, обрабатывают ультразвуком, гидролизуют смесью ферментов, кипятят в течение 5 - 30 мин, центрифугируют от 3 до 45 тыс. об/мин диализируют в течение 5 - 6 дней, затем повторно центрифугируют и осаждают гликозаминогликаны растворами этилацетатов щелочных и/или щелочноземельных металлов.