Способ криоконсервации богатой тромбоцитами плазмы

 

Изобретение относится к области медицины. Способ характеризуется тем, что плазму помещают в пластиковый контейнер и располагают его между двумя металлическими пластинами. Затем плазму, содержащуюся в контейнере, последовательно подвергают процессам замораживания, хранения и размораживания. Новым в способе является то, что процесс замораживания плазмы ведут при скорости 2 - 3^oC/c, процесс размораживания ведут при скорости 1,5 - 2^oC/c до начала таяния, а затем нагревают плазму при температуре 37^oC. Способ позволяет сохранить до 98% функционально активных тромбоцитов. 2 табл.

Заявляемое изобретение относится к области медицины, в частности к способам хранения тромбоцитов путем криоконсервирования, т.е. замораживания в жидком азоте, и может применяться в отделениях реанимации, гематологии, в онкологических клиниках и т.д.

Известны способы криоконсервирования богатой тромбоцитами плазмы, заключающиеся в том, что плазму помещают в пластиковый контейнер, располагают этот контейнер между двумя металлическими пластинами и замораживают в жидком азоте или его парах. Перед замораживанием в плазму вводят криоконсервант, который предупреждает разрушение клеток и утрату их функциональной активности в процессах замораживания, хранения и размораживания. В качестве криоконсерванта обычно используют диметил сульфоксид (ДМСО). Однако после размораживания лишь 40-60% тромбоцитов сохраняют функциональную активность. Это является причиной низкой клинической эффективности плазмы, что естественно не отвечает запросам практической медицины. Кроме того, присутствие криоконсерванта вызывает тяжелые осложнения у больных.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ криоконсервирования богатой тромбоцитами плазмы, заключающийся в том, что плазму, в которую добавляют криоконсервант ДМСО, помещают в пластиковый контейнер. Контейнер располагают между двумя металлическими пластинами и заливают жидким азотом. При этом температура охлаждения составляет -120^oC, а скорость охлаждения 8-10^oC/мин. Время замораживания составляет от 45 мин до 1 часа. Плазму хранят при -120^oC до трех лет. Плазму размораживают, используя водяную баню при температуре 37^oC. Время размораживания занимает от 30 до 45 минут.

В результате способа удается сохранить лишь 40-60% функционально активных тромбоцитов, что делает способ недостаточно эффективным. Другим серьезным недостатком способа является использование криоконсерванта ДМСО. По сведениям ряда авторов использование ДМСО вызывает такие осложнения, как флебиты, поражения печени, помутнение хрусталика глаза.

Указанные недостатки известного способа существенно снижают его клинический эффект.

Таким образом, основная задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - это повышение эффективности способа.

Технический результат выражается в том, что предлагаемые режимы ведения процессов замораживания и размораживания плазмы позволяют сохранить 74-98%, т. е. в среднем 92% функционально активных тромбоцитов. Другим техническим результатом является устранение токсичности плазмы, т.к. предлагаемые режимы способа позволяют сохранить вышеуказанное количество полноценных тромбоцитов без использования токсичных криоконсервантов.

Указанный технический результат обеспечивается всей совокупностью заявляемых признаков. Поставленная задача достигается тем, что в известном способе криоконсервирования богатой тромбоцитами плазмы, заключающемся в том, что плазму помещают в контейнер, располагают его между двумя металлическими пластинами, после чего последовательно подвергают процессам замораживания, хранения и размораживания, новым является то, что процесс замораживания плазмы ведут при скорости 2-3^oC/сек.

Новым также является то, что процесс размораживания плазмы ведут при скорости 1,5-2^oC/сек до начала таяния, а затем нагревают при температуре 37^oC.

Сравнение заявленной совокупности признаков с известными техническими решениями на момент подачи заявки на изобретение позволило установить, что данная совокупность признаков не известна из уровня техники и, следовательно, является новой.

Сравнение отличительных признаков заявляемого изобретения с прототипом, а также с другими техническими решениями не выявила из уровня техники решений, совпадающих с заявленными отличительными признаками, что позволяет считать предлагаемое изобретение имеющим изобретательский уровень.

Заявляемые режимы замораживания и размораживания были получены опытным путем. При этом скорость замораживания примерно равнялась скорости размораживания. После этих процедур проводили исследования сохранения количества тромбоцитов в плазме. Было выявлено, что наибольшее число клеток сохраняется при скорости замораживания 2-3^oC/сек и при скорости размораживания 1,5-2^oC/сек (см. таблицу 1).

При этом при замораживании в заявляемом интервале свыше 90% клеток от исходного уровня сохранялось в 22 случаях (61%), свыше 80% - в 12 случаях (33%), а свыше 70% - в 2 случаях (6%). Ниже 70% от исходного уровня не обнаруживали ни в одном из случаев.

Было установлено, что при замедлении скорости замораживания сохранялось менее 90% тромбоцитов от исходного уровня; при этом в 6 случаях зафиксировали уменьшение числа тромбоцитов ниже 70% от исходного уровня.

Таким образом, с замедлением скорости замораживания количество тромбоцитов в плазме значительно и достоверно уменьшается.

Для изучения влияния найденных опытным путем режимов замораживания и размораживания на функциональную активность тромбоцитов были проведены следующие исследования. Брали две пробы крови от одного донора. Путем центрифугирования крови получали богатую тромбоцитами плазму. Плазму 1-ой пробы помещали на хранение в водяной термостат при температуре 37^oC (контрольная проба). Плазму 2-ой пробы (исследуемая проба) замораживали и размораживали по предлагаемому способу. После размораживания плазму вновь смешивали с эритроцитами (то же самое делали с контрольной пробой) и проводили сравнительные исследования 1-ой и 2-ой проб на функциональную активность тромбоцитов. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, снижение количества тромбоцитов в исследуемой пробе по сравнению с контрольной было незначительным. Функция же тромбоцитов в исследуемой пробе после замораживания и размораживания, наоборот, активировалась почти по всем исследуемым параметрам (кроме чувствительности к адреналину).

Таким образом, связь между заявленными режимами процессов замораживания и размораживания и увеличением эффективности, выражающейся в увеличении количества функционально активных тромбоцитов в плазме, очевидна.

Пример. Выполняли замораживание богатой тромбоцитами плазмы. Для этого пластикатный контейнер "Blood Bag CPD 450", содержащий донорскую богатую тромбоцитами плазму (число тромбоцитов в ней 432 · 10⁹/л) поместили между двумя металлическими пластинами. Таким образом обеспечивали ровность слоя плазмы при замораживании. После этого контейнер помещали в емкость и заливали жидким азотом. Температура жидкого азота составляла -196^oC, скорость замораживания ≈2,2^oC/сек. Контейнер с плазмой находился в среде жидкого азота в течение 20 суток. На 20-е сутки произвели размораживание плазмы. Для этого контейнер поместили в водяной термостат, в котором температура была на уровне 90-100^oC. При этой температуре плазма находилась в течение 62 сек до начала ее таяния. Скорость размораживания составляла ≈2^oC/сек. Затем контейнер погружали в другой водяной термостат, температура которого была 37^oC, и выдерживали в нем плазму до полного размораживания. Количество тромбоцитов в плазме после размораживания составило 417 · 10⁹/л, т.е. 97% от исходного. Функциональная активность тромбоцитов, т.е. их прокоагулянтная функция, активировалась по сравнению с исходной (после предварительной инкубации с каолином время свертывания плазмы укоротилось на 19% исходного).

Представленный материал показывает, что заявляемый способ обладает по сравнению с прототипом следующими преимуществами.

1. Разработанный способ позволяет сохранить в среднем ≈90% исходного количества тромбоцитов (по прототипу ≈55%).

2. Показатели функциональной активности тромбоцитов почти полностью сохраняются.

3. Вышеуказанные высокие результаты получены без применения криопротекторов, вызывающих серьезные осложнения у реципиентов.

Формула изобретения

Способ криоконсервирования богатой тромбоцитами плазмы, заключающийся в том, что плазму помещают в контейнер с жидким азотом, располагают контейнер между двумя металлическими пластинами, после чего последовательно подвергают процессам замораживания, хранения и размораживания, отличающийся тем, что процесс замораживания плазмы ведут при скорости 2-3^oC/с, процесс размораживания - при скорости 1,5-2^oC/с, до начала таяния, а затем нагревают плазму при температуре 37^oC.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2