Среда для консервации роговицы донора

 

Изобретение относится к области медицины, а именно - к офтальмологии, и может найти применение при создании банка роговиц. В используемой жидкой питательной среде подобраны оптимальные соотношения составляющих компонентов для переживания донорского корнеосклерального лоскута, что способствует сохранению адекватной плотности заднего эпителия роговицы в процессе ее консервирования и обеспечивает поддержание нормальной толщины и прозрачности роговицы у больных с пересаженными трансплантатами из среды с адгелоном. Технический результат - повышение качества консервированного трансплантата для сквозной кератопластики за счет стимулирования адгелоном регенерации поврежденного эндотелия роговицы донора. 2 ил.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может найти применение при создании банка роговиц.

Известен способ консервации донорских роговиц в жидких питательных средах, позволяющий создать запас высококачественной, жизнеспособной донорской ткани для осуществления успешной сквозной кератопластики (СКП) (Cornealsurgery. Theory, Technique and Tissue. Ed. F.S. Brightbill, M.D. The C.N. Mosby, Company. S.T. Louis-Washington, D.C.-Toronto, 1986, 775 p.).

Консервация донорских роговиц в жидких питательных средах была начата Mc Carey B.E. и Kaufman H.E. в 1974 году (Invest. Ophthalmol., - 1974, - 13, - 165 - 173). Созданная этими исследователями среда М-К представляла собой смесь среды Е-199, декстрана, бикарбонатного буфера, пенициллина и стрептомицина. Позднее ряд исследователей представили данные об использовании питательной среды для консервации роговиц в комплексе с хондроитин сульфатом (среда K-Sol) /Stein R.M., Bourne W.M., Campbell R.J./Arch. Ophthalmol., - 1986, - vol. 104, - p.p. 1358 - 1361/. Консервация роговиц в среде K-Sol дала наиболее хорошие результаты по сравнению со средой М-К (в ней значительно менее выражен отек роговицы). Недостатком этого способа являются неизбежные механические повреждения эндотелия роговицы в процессе оценки, стерилизации, выкраивания корнеосклерального лоскута из донорских глаз при создании глазного банка, а также ограничение сроков хранения в этих средах пригодных для СКП трансплантатов до 4 - 5 суток.

Сравнительный анализ переживания донорских роговиц в средах М-К, K-Sol и среде с адгелоном показал, что роговицы, хранившиеся в среде с адгелоном характеризовались более высоким уровнем поддержания структурной и функциональной целостности: при сроках хранения до 7 суток включительно целостность эндотелиального монослоя была сохранена. Послеоперационный подсчет эндотелиальных клеток (ЭК) и пахиметрия в зеркальном микроскопе у больных с пересаженными трансплантатами из среды с адгелоном также показали лучшую сохранность роговичной ткани и ее функции, по сравнению с трансплантатами, хранившимися в среде М-К и K-Sol.

Технический результат, достигаемый изобретением, - возможность стимулировать репаративную регенерацию поврежденных элементов роговицы, неизбежных при ручных и инструментальных манипуляциях с донорскими глазами при заготовке корнеосклеральных трансплантатов, благодаря чему восстанавливается структурная организация клеточных элементов, в частности заднего эпителия роговицы (ЗЭР). Сохранение адекватной плотности ЗЭР в процессе консервирования донорского материала обеспечивает поддержание нормальной толщины и прозрачности роговицы, т.е. значительно улучшает качество трансплантата для СКП.

Сущность изобретения заключается в достижении упомянутого технического результата благодаря использованию среды для среднепродолжительной консервации роговицы донора, содержащей питательную среду культуры тканей Т-199, HEPES-буфер для стабилизации pH среды до 7,3, декстран-40, смесь антибиотиков, витамины, электролиты, глюкозу и адгелон с возможным разбросом ингредиентов на 1 л среды 199 в пределах: HEPES-буфер (IM) - 15 мМ - 20 мМ - 25 мМ декстран (мол.вес 40000) - 25 г - 30 г - 50 г (2,5% - 3,5% - 5%) ампициллин - 100 мг - 150 мг глицин (2,0 мг/л) - 1 мл биотин - 0,05 мг - 0,1 мг - 0,5 мг фолиевая к-та - 0,5 мг - 1,0 мг хлорид кальция - 166,0 мг - 332 мг сульфат магния - 120,0 мг - 180 мг
фосфат калия - 80 мг - 160 мг - 170 мг
глюкоза - 100 г - 450 г
адгелон - 10^-13 М/мл р-ра - 5 мл
Оптимальное соотношение составляющих веществ в используемой среде указано в методике приготовления среды.

Методика приготовления среды и консервация в ней роговицы донора осуществляется следующим образом.

В стерильном боксе (ламинарном шкафу) берется флакон с готовой средой 199 (1,0 л) фирмы Sigma (США), куда с соблюдением всех правил асептики стерильной мерной пипеткой добавляется 20 мМ HEPES-буфера (1 М) фирмы Sigma (США), отдельной стерильной пипеткой из готового флакона со 100 мл смеси антибиотиков (пенициллин-стрептомицин-неомицин) той же фирмы вливается 10 мл вышеуказанных антибиотиков в концентрации 5000 ЕД/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл соответственно и высыпается 100 мг ампициллина для инъекций из отдельного флакона фирмы Pharmachim (Болгария). Из готового пузырька с 25 мл смеси витаминов фирмы Bio Whittaker (США) другой пипеткой добавляется 1 мл витаминного раствора, содержащего 2,0 мг/л глицина, 0,5 мг/л никотиновой к-ты, 0,5 мг/л витамина B₆, 0,5 мг/л витамина B₁. Раздельные навески биотина (0,05 мг) фирмы Sigma (США) и фолиевой к-ты (0,5 мг) этой же фирмы делались в боксе на торсионных весах со стерильными чашечками, после чего высыпались во флакон со средой. Таким же образом туда добавлялись стерильные навески электролитов (332 мг хлорида кальция, 180 мг сульфата магния и 170 мг фосфата калия) фирмы Sigma. Стерильный порошок глюкозы той же фирмы отвешивался на стерильных чашках аптекарских весов (450 г), после чего высыпался в флакон со средой. Далее в полученный состав добавляли 5 мл адгелона (мол. масса 6 килодальтон) в концентрации 10^-13 М/мл раствора, полученного в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН из супернатанта сыворотки крови животных и человека.

Трупные глаза забираются не позднее 12 часов с момента констатации смерти донора. Перед консервированием роговицы донорских глаз тщательно исследовались в щелевой лампе фирмы "Opton" для выявления эпителиальной и стромальной патологии. Контроль состояния ЗЭР осуществлялся с помощью зеркального энотелиального микроскопа фирмы "Keeler-Canon", который позволял провести пахиметрию и морфометрический анализ ЗЭР. Для консервации донорских роговиц отбирались лишь те, потери в плотности ЭК которых не превышали 15% и которые содержали не менее 2500 ЭК в 1 мм². После биомикроскопического осмотра роговицы, формы и размеров зрачка, делалась адреналиновая проба (0,1% р-р солянокислого адреналина). Глаза с положительной адреналиновой пробой перед иссечением из них корнеосклерального лоскута стерилизовались в течение 5-7 минут по разработанному в нашем отделе способу в смеси раствора хлоргексидина и гентамицина соответственно 0,02% и 0,125% концентрации (А.А. Каспаров с соавт., 1990). Затем кадаверные глаза дважды ополаскивались в стерильном физиологическом р-ре, после чего из них выкраивался корнеосклеральный лоскут, который помещался в стерильный контейнер с герметически закрывающейся крышкой, содержащим 20 мл питательной среды с адгелоном.

Законсервированные роговицы хранились при тем-ре 4^oC в холодильнике. Все манипуляции осуществлялись в стерильном боксе с соблюдением всех правил асептики и проведением посевов на стерильность в бактериологической лаборатории заготовленных роговиц. Полученные трансплантаты хранились в среде с адгелоном в течение 1 - 7 дней, после чего использовались для СКП больным с разнообразной патологией роговицы. За время переживания роговицы в жидкой питательной среде кровь этого донора тестировалась на гепатоциты B и C, СПИД и сифилис.

Перед СКП эндотелиальный монослой консервированной парной роговицы исследовался в световом микроскопе на плоскостных пленочных препаратах, импрегнированных азотнокислым серебром и окрашенных гематоксилином, что позволяло осуществлять качественную и количественную оценку состояния ЗЭР.

В послеоперационном периоде трансплантаты реципиентов изучались с помощью зеркального микроскопа в сроки 1 неделя и 3 месяца после СКП.

Примеры характеристик донорских роговиц, консервированных в жидкой питательной среде с адгелоном, использованных для СКП.

Пример 1. Донор - муж. 30 лет, скончался в результате механической асфиксии (повешение). Срок после смерти до аутопсии (выделения глазных яблок) - 10 часов; срок после смерти до консервации роговиц в питательной среде с адгелоном - 12 часов.

Количество ЭК в 1 мм² при зеркальной микроскопии глаз донора перед консервацией: OD - 2900; OS - 3000. Срок консервации роговиц в питательной среде - 4 суток. Состояние ЭК на плоскостном пленочном препарате правой роговицы спустя 4 суток хранения оставалось без изменений по сравнению нормой (фиг. 1-а). На фиг. 1-б - эндотелий роговицы, хранившейся в среде М-К в течение 4-х дней: видны участки с усиленной аргирофилией ЭК (некробиотические изменения клеток).

Произведена субтотальная кератопластика реципиенту 47 лет с герпетическим кератитом, микроперфорацией роговицы, десцементоцеле. Для операции была использована роговица левого глаза донора, хранившаяся в среде с адгелоном в течение 4 суток. Операционный и послеоперационный периоды - без осложнений. Сквозной трансплантат роговицы с 1-х суток до 3-х месяцев оставался прозрачным; количество ЭК к 3-му месяцу послеоперационного периода - 2500.

Пример 2. Донор - муж. 28 лет, скончался от отравления этиловым спиртом. Срок после смерти до вскрытия - 11 часов; срок после смерти до консервации роговиц в питательной среде с адгелоном - 12 часов.

Количество ЭК в 1 мм² при зеркальной микроскопии глаз донора перед консервацией роговицы: OD - 3100; OS - 3100. Срок консервации роговиц в питательной среде - 7 суток. В правой роговице спустя 7 суток ее хранения целостность эндотелиального монослоя была сохранена; в отдельных полях зрения можно было видеть единичные крупные моноядерные ЭК, которые свидетельствовали о регенерационных процессах и новообразовании монослоя (фиг. 2-а). На фиг. 2-б - эндотелий роговицы, хранившейся в среде K-Sol в течение 7 дней: видна деструкция ЭК (до 20%).

Произведена ургентная СКП больной 56 лет с гнойным кератоиридоциклитом, начинающимся эндофтальмитом. Для СКП была использована роговица левого глаза донора, хранившаяся в среде с адгелоном в течение 7 суток. Операционный и послеоперационный периоды без осложнений. Сквозной трансплантат роговицы в первые сутки был полупрозрачным, а через 3 месяца - прозрачный; количество ЭК к 3-му месяцу послеоперационного периода - 2210.

Изобретение поясняется микрофотографиями.

Формула изобретения

Среда для консервирования роговицы донора, содержащая питательную среду культуры ткани Т-199, HEPES-буфер для стабилизации рН среды до 7,3; декстран -40, антибиотик, отличающаяся тем, что он дополнительно содержит витамины: глицин, никотиновая кислота, пиридоксин-хлорид, тиамин-хлорид, биотин, фолиевая кислота; электролиты: хлорид кальция (безводный), сульфат магния (безводный), фосфат калия, а также смесь антибиотиков: ампициллин, пенициллин, стрептомицин, неомицин; глюкозу и адгелон при следующем соотношении компонентов на 1 л Т-199:
Глицин - 2,0 мг
Витамины:
Никотиновая кислота (0,5 мг/л), пиридоксин-хлорид (0,5 мг/л) и тиамин-хлорид (0,5 мг/л) - 1 мл
Биотин - 0,05 мг
Фолиевая кислота - 0,5 мг
Электролиты:
Хлорид кальция (безводный) (Са⁺⁺) - 332 мг
Сульфат магния (безводный) (Мg⁺⁺) - 180 мг
Фосфат калия (К⁺) - 170 мг
Смесь антибиотиков:
Ампициллин - 100 мг
Пенициллин (5000 ЕД/мл), стрептомицин (5 мг/мл) и неомицин (10 мг/мл) - 10 мл
Глюкоза (450 г, 45%) и адгелон (10^-13М/мл раствора) - 5 мл

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2