Способ получения компонента cз комплемента человека

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к области получения высокоочищенных и высокоактивных препаратов белков иммунной системы организма, которые могут быть использованы в медицине и биохимии для создания тест-систем, а также для исследовательских целей. Способ осуществляется следующим образом: проводят осаждение эуглобулинов из сыворотки крови диализом против дистиллированной воды, затем растворенный осадок эуглобулиновой фракции диализуют против раствора с рН 8,6-9,0, содержащего 1 мМ ε-аминокапроновую кислоту и 0,01 М ЭДТА, после отделения осаждающихся примесей надосадочную жидкость насыщают Na₂SO₄, образующий осадок растворяют в растворе с рН 6, содержащем 11% Na₂SO₄, 0,005 М Na₂НРО₄ и 0,01 М ЭДТА, и из образующегося раствора осаждают компонент С3 комплемента диализом против дистиллированной воды. Способ приводит к получению препарата компонента С3 комплемента с выходом 60%, который по данным иммуноэлектрофореза дает одну полосу преципитации с антисывороткой ко всем сывороточным белкам человека, и не содержит примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле. Технический результат: способ позволяет простыми средствами получить препарат компонента С3 комплемента человека, не содержащий примесей.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к области получения высокоочищенных и высокоактивных препаратов белков иммунной системы организма, которые могут быть использованы в медицине и биохимии для создания тест-систем, а также для исследовательских целей.

Препараты компонента C3 комплемента человека используются для создания тест-систем для его определения в крови больных, C3 и его продукты расщепления могут быть также использованы для получения лекарственных средств нового типа, благодаря их способности воздействовать через соответствующие клеточные рецепторы на различные защитные системы организма.

В большинстве методов получения C3 используются хроматографические, что является часто сложным и дорогим. Наиболее близким к предлагаемому способу выделения и очистки является метод Л.В.Козлова, Е.Д.Шибановой и А.А.Зинченко [1], состоящий из осаждения диализом сыворотки крови эуглобулиновой фракции, а затем выделении из этой фракции компонента C3 комплемента последовательными хроматографическим разделением и гель-фильтрацией. К недостаткам метода следует отнести использование сложных и дорогих стадий хроматографического и гель-фильтрации.

Нами разработан способ, позволяющий простыми средствами получить препарат компонента C3 комплемента человека, не содержащий примесей.

Способ осуществляется следующим образом: проводят осаждение эуглобулинов из сыворотки крови диализом против дистиллированной воды, затем растворенный осадок диализуют в присутствии ЭДТА против растворов с низкой ионной силой, содержащих ε-аминокапроновую кислоту, после отделения примесей из супернатанта проводят осаждение сульфатом натрия и полученный осадок C3 растворяют в 11% Na₂SO₄, содержащем 0,005 M Na₂HPO₄, 0,01 M ЭДТА, pH 6, и окончательно осаждают диализом против дистиллированной воды. Способ приводят к получению препарата C3 с выходом 60%, который по данным иммуноэлектрофореза не содержит примесей, а по данным определения функциональной активности C3 является высокоактивным.

Пример. 100 мл нормальной донорской сыворотки крови человека подкисляют 0,15 М HCl до pH 5,0 и диализуют против 10 л дистиллированной воды при +4^oC в течение 18 ч. Осадок растворяют в 30 мл 0,01 M мединалового буфера, содержащего 1 мМ ε--аминокапроновую кислоту, 1 мМ ЭДТА и 0,75 М NaCl, pH 8,6 - 9,0. Нерастворившиеся примеси отделяют центрифугированием и отбрасывают. Раствор диализуют против 3 л 0,01 M мединалового буфера, содержащего 1 мМ ε-аминокапроновую кислоту, 1 мМ ЭДТА, pH 8,6 - 9,0, при +4^oC в течение 18 ч. Осадок отделяют центрифугированием, а к супернатанту добавляют при перемешивании безводный сульфат натрия (из расчета 20 г на 100 мл раствора), поддерживая температуру 37^oC, пока весь сульфат не растворится. Выпавший C3, через 2 ч стояния при комнатной температуре, отделяют центрифугированием, осадок промывают дважды раствором сульфата натрия (20 г на 100 мл) с центрифугированием и растворяют в 30 мл буферного раствора состава 11% Na₂SO₄, 0,005 M Na₂HPO₄, 0,01 M ЭДТА, 0,005 M азид натрия, pH 6,0. Через 2 ч перемешивания при комнатной температуре раствор центрифугируют для отделения от нерастворившихся примесей, подкисляют 0,15 M HCl до pH 5,0 и диализуют при +4^oC против дистиллированной воды. Выпавший осадок представляет собой функционально активный по данным гемолитического определения компонент C3, который по данным иммуноэлектрофореза дает одну полосу преципитации с антисывороткой ко всем сывороточным белкам человека и не содержит примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле. Выход по белку - 46 мг (60%).

Литература 1. Козлов Л. В. , Шибанова Е.Д, Зинченко А.А. Образование классической C3-конвертазы в ходе активации альтернативного пути комплемента человека// Биохимия. 1987. Т. 52. N 4. C. 660-665.

Формула изобретения

Способ получения компонента С3 комплемента человека, включающий осаждение эуглобулиновой фракции из сыворотки крови диализом против дистиллированной воды, отличающийся тем, что из растворенного осадка эуглобулиновой фракции осаждают примеси диализом против раствора с рН 8,6 - 9,0, содержащего 1 мМ ε-аминокапроновую кислоту и 1 мМ ЭДТА, надосадочную жидкость насыщают Nа₂SO₄, образующийся осадок растворяют в растворе с рН 6, содержащем 11% Nа₂SO₄, 0,005 М Nа₂НРО₄ и 0,01 М ЭДТА, и из образующегося раствора осаждают компонент С3 комплемента диализом против дистиллированной воды.