Штамм streptomyces hygroscopicus 7 - продуцент протеолитического фермента гигролитина

 

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в кожевенной промышленности и ветеринарии. Штамм получен селекционным путем под воздействием митомицина С и хранится в Научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии под номером ВНИИСХМ-481 и в группе элифитных микроорганизмов. Уровень продуктивности штамма 7 повышен и варьирует от 120-170 ПЕ/мл.

Предлагаемое изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и может быть использовано для получения протеолитических ферментов.

Задачей данного технического решения являлось получение нового штамма с более высокой производительностью для получения гигролитина, который может быть использован в ветеринарной практике для лечения диспепсии животных в сочетании с антибиотиками, в качестве биостимулятора роста животных и птицы при добавке его в корма, в кожевенной промышленности для обезволашивания и мягчения кожевенного сырья, а также для гидролиза белка различного происхождения.

Гигролитин может быть использован в медицине при неспецифических заболеваниях органов дыхания (для разжижения мокроты и гнойно-некротических масс), для профилактики эмпием плевры, в ожоговой и гнойной хирургии для лизирования и отторжения струпа, лизиса гнойно-хирургических масс и фибринозных заболеваний.

В ходе решения был отобран штамм, обладающий высокой способностью синтезировать гигролитин.

Известен способ получения протеолитического фермента гигролитина с использованием в качестве продуцента культуры Actinomyces hygroscopicus (SU, авторское свидетельство N 663715, кл. C 12 D 9/14, C 12 D 13/10. Опубликовано 25.05.79. Бюллетень N 19). Однако протеолитическая активность Actinomyces hygroscopicus в указанном способе достигает всего 35 ПЕ/мл. Недостатком данного технического решения является невысокая протеолитическая активность культуральной жидкости.

Наиболее близким по технологической сущности к изобретению является штамм Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 - продуцент протеолитических ферментов с активностью культуральной жидкости по Кунитцу 40-97 ПЕ/мл, который выбран нами за прототип. (SU, авторское свидетельство N 1735364 кл. C 12 N 9/52, 1/20, Патент СССР N 1001862, кл. C 12 N 9/48, 1983 г.). Недостатком штамма является низкая протеолитическая активность.

Предлагаемый штамм Sreptomyces hygroscopicus 7 получен методом селекции при воздействии митомицина C в дозе 100 мкг/мл. Штамм продуцирует до 170 ПЕ/мл культуральной жидкости. Штамм по изобретению хранится в Научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии под номером "ВНИИСХМ-481" в группе эпифитных микроорганизмов.

Существенные признаки заявляемого штамма Streptomyces hygroscopicus 7, общие с прототипом.

Штамм пептонизирует молоко, желатин разжижает, сероводород не образует, нитраты не восстанавливает. В качестве источника углерода усваивает глюкозу, инозит; слабо растет на среде с арабинозой. На картофеле образует активный рост. Предлагаемый штамм так же, как и прототип, не образует растворимых меланоидных пигментов на всех агаризованных и жидких средах, применяемых для культивирования.

Отличительные признаки предлагаемого штамма от известного (прототипа) Предлагаемый штамм в отличие от прототипа Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 относится к виду Streptomyces hygroscopicus и по всем морфолого-культуральным признакам отличается от прототипа.

На среде с кукурузным экстрактом и крахмалом (N 21/12) на 21 сутки роста при 25±1^oC формирует колонии 8-9 мм плоские со складками в центре и широкорастущим изрезанным краем. Воздушный мицелий бархатистый, развит умеренно, по краю колонии частично редуцирован в виде каймы белоснежного цвета (д 3). Субстратный мицелий буланый (к 1). Среда не окрашена. На органической среде N 2 (Гаузе) колонии выпуклые, диаметром 8-11 мм с бугорком в центре и плоским изрезанным краем. Воздушный мицелий бархатистый, белоснежный (д 3). Субстратный мицелий желтовато-бурый (д 4). Среда не окрашена.

На овсяном агаре N 61 колонии крупные 13-16 мм, выпуклые с широкорастущим неровным краем. Воздушный мицелий бархатистый, обильно спорулирущий темно-пепельный (в 4), на краю колонии белоснежного цвета. Субстратный мицелий бледно-песочный (к 3). Среда не окрашена.

На агаре Чапека с крахмалом образует скудный рост, колонии мелкие, 2-3 мм, плоские, с изрезанным широкорастущим краем. Воздушный мицелий мучнистый, дымчатый (л 1), обильно спорулирующий, покрывает колонию полностью. Субстратный мицелий серого цвета (в 4). Среда не окрашена.

На агаризованной среде Треснера образует скудный рост, колонии 2-3 мм, выпуклые с бугорком в центре и изрезанным краем. Воздушный мицелий мучнистый, белоснежного цвета (д 3), неспорулирующий. Субстратный мицелий желтовато-бурый (д 4). Среда не окрашена.

В отличие от прототипа не растет на среде с фруктозой, хорошо усваивает ксилозу, умеренно растет на среде с сахарозой. Заявляемый штамм превосходит по уровню биосинтеза протеолитического комплекса ферментов на 75% прототип (заявляемый штамм 120-170 ПЕ/мл; прототип - 40-97 ПЕ/мл).

Морфолого-культуральные признаки На среде с кукурузным экстрактом и крахмалом (N 21/12) на 21 сутки роста при 25±1^oC формирует колонии 8-9 мм плоские со складками в центре и широкорастущим изрезанным краем. Воздушный мицелий бархатистый, развит умеренно, по краю колонии частично редуцирован в виде каймы белоснежного цвета (д 3). Субстратный мицелий буланый (к 1). Среда не окрашена. На органической среде N 2 (Гаузе) колонии выпуклые, диаметром 8-11 мм с бугорком в центре и плоским изрезанным краем. Воздушный мицелий бархатистый, белоснежный (д 3). Субстратный мицелий желтовато-бурый (д 4). Среда не окрашена.

На овсяном агаре N 61 колонии крупные 13-16 мм, выпуклые с широкорастущим неровным краем. Воздушный мицелий бархатистый, обильно спорулирующий, темно-пепельный (в 4), на краю колонии белоснежного цвета. Субстратный мицелий бледно-песочный (к 3). Среда не окрашена.

На агаре Чапека с крахмалом (N 84) образует скудный рост, колонии мелкие, 2-3 мм, плоские, с изрезанным широкорастущим краем. Воздушный мицелий мучнистый, дымчатый (л 1), обильно спорулирующий, покрывает колонию полностью. Субстратный мицелий серого цвета (в 4). Среда не окрашена.

На агаризованной среде Треснера (N 64) образует скудный рост, колонии 2-3 мм, выпуклые с бугорком в центре и изрезанным краем. Воздушный мицелий мучнистый, белоснежного цвета (д 3), неспорумерующий. Субстратный мицелий желтовато-бурый (д 4). Среда не окрашена.

Физиолого-биохимические признаки Штамм пентонизирует молоко, гидролизует крахмал, разжижает желатин полностью на 9-е сутки роста при 28^oC, H₂S не образует, на клетчатке растет умеренно, на картофеле образует обильный рост сероватого цвета, не восстанавливает нитраты в нитриты, меланоидных пигментов не образует. Реакция на инверсию сахарозы отрицательная.

На среде Придхема-Готтлиба хорошо растет в присутствии глюкозы, мальтозы, ксилозы, умеренно растет на среде с Na-лимоннокислым, инозитом, сахарозой, сорбитом, слабо растет с арабинозой, лактозой, рамнозой, галактозой, маннитом. Не растет на среде с фруктозой и уксуснокислым натрием.

Температурный оптимум для роста и развития 28^oC, минимальная температура роста 20-25^oC, выдерживает максимальную температуру 32^oC.

Условия хранения заявляемого штамма Штамм хранится на агаре 21/12 с крахмалом и кукурузным экстрактом при комнатной температуре 3 месяца.

Состав среды 21/12: 1. Кукурузный экстракт 5 г (по сухому весу) 2. (NH₄)₂HPO₄ 4 г 3. KH₂PO₄ 2 г 4. MgSO₄·7H₂O 0,25 г 5. CaCO³ 1 г
6. Крахмал растворимый 20 г
7. Агар-агар 25 г
8. Вода водопроводная до 1 л
pH Среды до стерилизации 7,3
Стерилизация 40 мин при 0,8 ати.

Антагонистические признаки
Антагонистических свойств в отношении других микроорганизмов не наблюдали.

Заявляемый штамм не токсичен и не относится к микроорганизмам, обладающим патогенными свойствами.

При глубинной ферментации заявляемый штамм накапливает в культуральной жидкости фермент протеолитического действия - гигролитин.

Условия образования гигролитина
Для получения гигролитина штамм культивируют в течение 72-96 ч на качалке (число оборотов 220-250 мин^-1) в колбах Эрленмейра вместимостью 750 мл, содержащих 50 мл среды следующего состава, %:
белково-витаминный концентрат (БВК) - 3,0
кукурузная мука - 2,0
гидрол или зеленая патока - 6,0-7,0
мел - 1,2
калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,02
подсолнечное масло - 1,0
вода водопроводная - остальное
Колбы инокулируют по 5 мл посевного материала, полученным культивированием в колбах Эрленмейра вместимостью 750 мл (28±1^oC, 220-250 об/мин), содержащих 100 мл среды следующего состава, %. соевая мука - 1,5, кукурузный экстракт - 0,2, (NH₄)₂SO₄ - 0,2, NaCl - 0,5, CaCO₃ - 0,3, глюкоза - 2%, БВК - 1,0. Срок выращивания посевного материала 48 ч.

Для приготовления посевного материала использовали культуру, выращенную в пробирках со средой 21/12. Культуру выращивали в течение 14 суток при 28^oC.

Протеолитическая активность штамма 120-170 ПЕ/мл (метод определения: Laskowsky М. , Preparation and assay of enzymes. 2. Chymotrypsinogenes and chymotrypsins. Methods Enzymol., 1955, v.2, p. 8-26).

Формула изобретения

Штамм Streptomyces hygroscopicus 7 - продуцент протеолитического фермента гигролитина.