Моноклональное антитело, способное специфически распознавать рапамицин (варианты), набор для иммунотестирования

 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и может быть использовано для тестирования рапамицина. Моноклональное антитело к рапамицину, способное распозновать эпитоп на FKBP-связывающем домене или на эффекторном домене рапамицина, или моноклональное антитело к 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицину получают с помощью иммуногенного конъюгата, содержащего 40-O-сукцинимидооксисукцинил-рапамицин или 28-O-сукцинимидооксисукцинил-рапамицин, или 28-O-(сукцинимидооксисукцинил)-40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин и иммуногенный белок. Изобретение позволяет создать тест-систему для иммуносупрессивных производных рапамицина. 4 с. и 8 з.п.ф-лы, 8 ил.

Предметом изобретения являются моноклональные антитела к рапамицину и производным рапамицина, которые применяют, например, в тест-наборах для контроля уровней лекарственных препаратов в крови.

Рапамицин является макролидным антибиотиком, продуцируемым Streрtomyces hygroscopicus, и было установлено, что в качестве фармацевтического средства он может иметь множество различных применений, в частности, как иммуносупрессант, например для лечения и профилактики аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантированных органов. Однако рапамицин оказывает ряд побочных эффектов при повышенных дозировках и имеет до некоторой степени переменную биологическую пригодность. Контроль уровней рапамицина в крови у пациентов, проходящих лечение рапамицином, является, таким образом, весьма желательным, чтобы иметь возможность регулировать дозы так, чтобы поддерживать минимальный уровень, достаточный для фармакологической активности и избежать любого чрезмерного риска побочных эффектов. Отсутствие чувствительного и достоверного теста, который может быть быстро и легко осуществлен в клинических условиях, представляло собой основное препятствие к применению рапамицина в качестве фармацевтического средства.

Предшествующие попытки создания тест- наборов для клинического контроля рапамицина не были особенно успешными. Описан [1] микробиологический тест, в котором концентрацию рапамицина измеряют как функцию антигрибной активности. Известна [2] тест-система, в которой уровни рапамицина измеряют косвенным образом путем измерения конкуренции за связывание с макрофилином. Оба этих теста являются громоздкими и не особенно чувствительными. И что даже более важно, оба этих теста могут иметь значительное отклонение при лишь немного отличающихся условиях тестирования, что затрудняет сравнения результатов тестов из различных клиник.

До настоящего времени в литературе отсутствовали сообщения о моноклональных антителах, которые распознают рапамицин. Имеются существенные трудности в получении моноклональных антител к рапамицину, поскольку рапамицин не иммуногенен и сам по себе чрезвычайно иммуносупрессивен.

Кроме того, поскольку метаболиты рапамицина не были в достаточной степени охарактеризованы в литературе, трудно идентифицировать моноклональное антитело, способное делать различие между рапамицином и его метаболитами.

Настоящее изобретение предлагает моноклональные антитела, которые являются высоко чувствительными к рапамицину. Антитела по изобретению продуцируются в ответ на инокуляцию новым иммуногенным конъюгатом, содержащим новое производное рапамицина, пришитое к иммуногенному белку. Тест-наборы, использующие эти антитела, удобны для применения в клинических условиях и дают намного более точные и воспроизводимые результаты, чем это было возможно ранее. Антитела применяют также при очистке и выделении рапамицина.

Создание тест-систем для иммуносупрессивных производных рапамицина представляет собой сходные задачи. Особенно интересны 40-O-производные рапамицина, например рапамицины, которые являются О-замещенными по гидроксилу на циклогексильном кольце (положение 40), например О-арил и О-алкил рапамицины [3, 4] (оба включены здесь по сноске); особенно 40-O-алкилированные рапамицины, в которых 40-O-заместителем является алкил или замещенный алкил; например гидроксиалкил, гидроксиалкоксиалкил, ациламиноалкил или аминоалкил, где "алк-" или "алкил" относится к C_1-6 алкилу, разветвленному или линейному, предпочтительно C_1-3 алкилу, в котором углеродная цепь может быть прервана эфирной (-O-) связью; в частности 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин, 40-O-(3-гидрокси пропил)-рапамицин, 40-O-[2-(2-гидрокси)этокси]этил-рапамицин и 40-O-(2-ацетаминоэтил)-рапамицин. Таким образом, еще одной задачей изобретения является получение моноклональных антител к таким 40-O-производным. Подобные антитела применяют в диагностических тестах, а также при очистке и получении производных.

Новыми активированными производными рапамицина, применяемыми для получения новых иммуногенных конъюгатов по изобретению, являются рапамицины, которые связаны посредством одной из гидроксильных групп рапамицина, предпочтительно гидроксильной группы, локализованной на циклогексильной части рапамицина (положение 40) или гидроксильной группы в положении 28, с активированной связывающей группой; то есть группой, способной к прямому взаимодействию с белком с образованием ковалентной связи, без необходимости использования связывающего агента (например, карбодиимидных реагентов) для облегчения воздействия или активации реакции с белком. Предпочтительно, чтобы активированная связывающая группа имела активированную эфирную или карбоксильную группу например формулы -CO-O-X, где X является карбоксил-активирующей группой, такой как о- или р-нитрофенил, 1-бензтриазол, пентафторфенил или (особенно) N-сукцинимидо-группой. Другими пригодными активированными связывающими группами являются например I) активированные дитио-группы, в частности формулы -S-S- Z, где Z является дитио-активирующей группой, такой как 2-пиридил, которая может быть присоединена к рапамицину; или II) эпокси- группы, например эпоксиметил. Активированная связывающая группа может быть присоединена к рапамицину посредством эфирной, простой эфирной, амидной, тио- или любой другой подходящей связи, но предпочтительна эфирная связь. Наиболее предпочтительно, чтобы активированная связывающая группа содержала бис-эфирную часть, например сукцинил, имеющую эфирную связь с рапамицином на одном конце и активированную эфирную или активированную карбоксигруппу на другом.

Предпочтительными производными рапамицина по изобретению являются соединения формулы III, получаемые согласно Реакции I (см. в конце описания), где формула I представляет собой рапамицин, который а) подвергают взаимодействию с ацилирующим агентом, например циклическим ангидридом или дикарбоновой кислотой (возможно в геми-О-защищенной форме), при соответствующих условиях и, если необходимо, при отщеплении защитных групп с образованием рапамицина формулы II, где Y - это спейсерная группа, предпочтительно низший алкен, например C_2-6 алкен, наиболее предпочтителен этилен. Этот рапамицин формулы II затем б) активируют посредством реакции с карбокси-активирующей группой, например формулы HO-X, где Х определено выше, с образованием активированного рапамицина формулы III.

Предпочтительным активированным производным рапамицина является сукцинимидное производное формулы III, получаемое например согласно Реакции II (см. в конце описания), где формула I представляет собой рапамицин, который подвергают а) О-ацилированию с помощью янтарного ангидрида в присутствии ДМАП и пиридина с образованием гемисукцината рапамицина формулы II' (40-O-(3-карбокси)пропаноил-рапамицин); который затем подвергают б) активированию N-гидроксисукцинимидом в присутствии ЭДК, Et₃N и CH₂Cl₂ с образованием 40-O-сукцинимидооксисукцинилрапамицина формулы III', например как описано более полно в приводимом ниже примере 1. Моноклональные антитела, получаемые с помощью такого как этот гаптена, пришитого в 40-положении, будут как правило перекрестно реактивными между рапамицином и 40-O-проиэводным рапамицина, подобного описанному выше. Такие моноклональные антитела могут быть отселектированы как описано ниже для соединений, которые распознают специфическую область рапамицина или 40-O-производного рапамицина например в связывающем домене или эффекторном домене, как описано ниже.

В отдельных случаях желательно иметь моноклональные антитела, являющиеся высоко чувствительными к модификациям в циклогексильной области, например для того, чтобы различать рапамицин и 40-O-производные рапамицина, либо для идентификации метаболитов в циклогексильной области. В таком случае предпочтительно, чтобы гаптен был пришит в 28-O положении, а не в 40-O положении. Например, производное рапамицина формулы А (см. в конце описания), где R является O-защитной группой или заместителем, как описано выше, например гидроксиалкилом, гидроксиалкилоксиалкилом, ациламиноалкилом, или аминоалкилом, возможно в защищенной форме, подвергают взаимодействию согласно Реакции I, если необходимо с отщеплением защитной группы, с образованием аналогичного 28-O активированного гаптена, например, соединения формулы Б (см. в конце описания), где R1 является H, или О-заместителем, как описано выше, например гидроксиалкилом, гидроксиалкоксиалкилом, ациламиноалкилом или аминоалкилом, Y является линкерной частью, как определено выше, а X является карбокси-активирующей группой, как описано выше.

При получении такого гаптена, где R является О-защитной группой или О-защищенным заместителем, ацилирующий агент может являться например дикарбоновой кислотой в геми-О-защищенной форме так, что после ацилирования обе О-защищающие группы могут быть удалены в ходе одноступенчатой реакции перед добавлением карбокси-активирующей группы. Например гаптены для генерации моноклональных антител, способных распознавать 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин, могут быть получены путем защиты первичной гидрокси-группы, ацилирования гидрокси-группы в положении 28 дикарбоновой кислотой в геми-О-защищенной форме, снятия защиты и активации карбокси-группы, например согласно Реакции III (см. в конце описания).

Аналогичным образом, сам рапамицин может быть активирован в 28-O вместо 40-O, путем О-защиты C40 гидрокси-группы, ацилирования гидрокси-группы в положении 28 с помощью геми-О-защищенной дикарбоновой кислоты, снятия защиты и активации карбокси-группы, например, согласно реакции IV (см. в конце описания).

Активированный рапамицин или производное рапамицина затем пришивают к соответствующему иммуногенному белку, например бычьему сывороточному альбумину (БСА), овальбумину (ОВД) или гемоцианину лимфы улитки (ГЛУ) с образованием иммуногенного конъюгата. Моноклональные антитела получают, используя традиционные методы, например путем введения нового иммуногенного конъюгата соответствующему виду животных для реализации контрольного иммуногенного заражения и получения продуцирующих антитело клеток, ставших чувствительными к указанному конъюгату; иммортализации указанных производящих антитело клеток путем слияния с соответствующей миеломой; и регенерации моноклонального антитела из отселектированной иммортализированной клеточной линии, таким образом полученной.

Антитела по изобретению могут затем применяться в соответствующем тесте. Отдельные возможности очевидны для специалиста. Одним из возможных подходов является конкурентный тест с применением антитела и рапамициновой метки, например в варианте, в котором микротитрационные планшеты сенсибилизируют антителом и подвергают действию конкурента, который представляет собой меченый (например, фторо- или радиомеченный, особенно биотинилированный) рапамицин, в присутствии и отсутствии тестируемой жидкости, которая предположительно содержит рапамицин, например плазмы цельной крови от пациента. Планшеты промывают и измеряют количество меченого конкурента, который связан с антителом, это количество изменяется обратно пропорционально количеству рапамицина в тестируемой жидкости. Другим подходом является ELISA с применением антитела, конъюгата рапамицин-белок и меченого (например, меченого ферментом) антитела-метки, распознающего муриновый IgG, например вариант, в котором микротитрационные планшеты сенсибилизируют конъюгатом рапамицин-белок (например, иммуногенный конъюгат, описанный выше, включающий белок, связанный с рапамицином или 40-O-алкилированным рапамицином), обрабатывают антителом в присутствии и отсутствии тестируемой жидкости, промывают и выявляют антитело, связывающееся с конъюгатом рапамицина, по связыванию антитела-метки с антителом, связанным с конъюгатом рапамицина. Опять же, количество связанного антитела будет изменяться обратно пропорционально количеству рапамицина в тестируемом образце. В любом случае тест стандартизируют с помощью тест-растворов, содержащих известные концентрации рапамицина. Поэтому предлагают набор для тестирования (тест-набор), включающий (I) моноклональное антитело по изобретению, предпочтительно в лиофилизированной форме либо сенсибилизированное на микротитрационном планшете, и (II) возможно также включающий либо конъюгат рапамицин-белок, возможно сенсибилизированный на планшете, и/или меченое производное рапамицина, и (III) возможно также включающий раствор рапамицина для стандартизации и инструкции по применению. Такой набор способен выявлять рапамицин в концентрациях менее 10 нг/мл, например менее 1 нг/мл, в частности порядка 0,25-0,5 нг/мл.

Антитела по изобретению могут быть дополнительно охарактеризованы по их относительному сродству связывания с иммуносупрессивным аскомицином, например FK-506. FK-506 является иммуносупрессивным макролидом, обладающим определенным структурным сходством с рапамицином в связывающем домене. Как рапамицин (например, рапамицин и его иммуносупрессивные производные), так и FK-506 связываются с макрофилинами (FKBPs) и считают, что для обоих соединений связывание с макрофилином является необходимым, но не достаточным критерием иммуносупрессивной активности. Эффекторная область рапамицина, однако, существенно отличается от FK-506, и фактически оба соединения имеют совершенно различные механизмы активности. По-видимому, FK-506 вызывает иммуносупрессию прежде всего путем подавления ИЛ-2 транскрипции, в то время как рапамицин не оказывает значительного влияния на ИЛ-2 транскрипцию). Таким образом, рапамицины могут быть охарактеризованы как обладающие FKBP-связывающим доменом и эффекторным доменом, и может быть сделано различие между метаболитами рапамицина, которые модифицированы в FKBP-связывающем домене, и метаболитами, модифицированными в эффекторном домене. Это различие может быть выявлено с помощью моноклональных антител по изобретению путем измерения относительной перекрестной реактивности моноклонального тела по изобретению к FK-506 (измеряют перекрестную реактивность, например, в конкурентном ELISA): моноклональные антитела, обладающие высокой степенью перекрестной реактивности (например, более 50%) распознают эпитопы в FKBP-связывающем домене рапамицина, который сходен с FK-506; моноклональные антитела с низкой степенью перекрестной реактивности (например, менее 20%, возможно менее 10%) распознают эпитопы в эффекторной области, уникальной для рапамицинов.

Антитела по изобретению также могут быть скриннированы и охарактеризованы по их способности отличать рапамицин от 40-O-производного рапамицина, например как описано выше. Если необходимо, чтобы антитела не отличали рапамицин от 40-O-производного рапамицина, то селектируют антитела, которые проявляют по меньшей мере 70%, предпочтительно свыше 90%, перекрестной реактивности между рапамицином и его 40-O-производным. В таком случае гаптен, применяемый для получения моноклонального антитела, предпочтительно является 40-O-активированным рапамицином, например формулы III в Реакции I. Если требуется отличить рапамицин и 40-O-производное или метаболит рапамицина, то селектируют антитела, обладающие менее чем 30%, предпочтительно менее чем 10%, перекрестной реактивности. В этом случае гаптен, применяемый для получения антитела, предпочтительно является 28-O-активированным рапамицином или производным рапамицина, например формулы Б.

ПРИМЕР 1 - Получение 40-O-активированного рапамицина а) Получение 40-O-гемисукцината рапамицина К перемешиваемому раствору 1,5 г (1,64 ммоль) рапамицина и 0,577 г (5,77 ммоль) янтарного ангидрида в 12 мл пиридина добавляют 195 мг (1,64 ммоль) ДМАП. Полученную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 19 часов и концентрируют при пониженном давлении. Остаток растворяют в этилацетате и трижды промывают водой. Органический раствор сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают посредством колоночной хроматографии на силикагеле с использованием 9: 1 CH₂Cl₂-MeOH. Фракции, содержащие ожидаемый продукт, объединяют и чистят еще раз посредством колоночной хроматографии на силикагеле с использованием 19: 1 CH₂Cl₂-MeOH для получения, после удаления растворителя под пониженным давлением, 40-O-(3-карбокси)пропаноил-рапамицина (рапамицин гемисукцинат формулы II, приведенной выше) в виде белой пены, имеющей следующие характерные спектроскопические свойства: ¹H ЯМР (CDCl₃) δ 2,68 (7H, т, H33, H25 и O₂CCH₂CH₂CO₂H), 3,14 (3H, s и m, OCH₃ и H39), 3,34 (3H, s, OCH₃), 3,38 (3H, s, OCH₃), 4,68 (1H, т, H40), 4,72 (1H, широкий s, 10-ОН); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]⁺), 982 ([M-СН₃О]⁺), 964 ([М-(CH₃О+H₂O)]⁺), 946([М-(CH₃О+2H20)]⁺).

б) Получение 40-O-сукцинимидооксисукцинил-рапамицина К перемешиваемому раствору 120 мг (0,118 ммоль) рапамицина гемисукцината по стадии а), 16,5 мкЛ (0,118 ммоль) Et₃N и 22,7 мг (0,118 ммоль) EDC в 8 мл CH₂Cl₂ добавляют 13,6 мг (0,118 ммоль) N-гидроксисукцинимида. Полученную смесь перемешивают в течение 18 часов при комнатной температуре, затем разбавляют этилацетатом и дважды промывают водой. Органический раствор сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают посредством колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат), получая 40-O-сукцининимидооксисукцинил-рапамицин (то есть соединения формулы III') в приведенной выше Реакции II) в виде белой пены, имеющего следующие характерные спектроскопические свойства: ¹H ЯМР (ДМСО) δ 2,67 (2H, t, O₂CCH₂CH₂CO₂), 2,81 (7H, s, CH₂О и сукцинимид CH₂), 2,92 (2H, t, O₂CCH₂CH₂CO₂), 4,55 (1H, m, H40), 5,26 (1H, d, 28-OH), 6,43 (1H, s, 10-OH); MC (FAB) m/z 1133 ([M+Na]⁺), 1111 ([M+H]⁺), 1092 ([M-H₂O] ⁺), 1079 ([М-CH₃О] ⁺), 1061 ([М-(CH₃О+H₂O)]⁺), 1043 ([М-(CH₃О+2H₂O]⁺).

ПРИМЕР 2 - Получение 28-O-активированного 40-O производного рапамицина а) 28-O-гемисукцинат 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин К перемешиваемому, охлажденному (0^oC) раствору 958 мг (1,00 ммоль) 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицина в 2,2 мл 10:1 метиленхлорид-пиридина добавляют 0,160 мл (1,50 ммоль) аллилхлорформиата. Перемешивание продолжают при 0^oC и через 3 и 4 часа соответственно добавляют две порции по 0,080 мл (1,00 ммоль) каждая пиридина и 0,053 мл (0,50 ммоль) аллилхлорформиата. После последнего добавления реагентов перемешивание продолжали в течение еще одного часа, затем реакцию останавливают добавлением 1М водного бикарбоната натрия. Полученную смесь трижды экстрагируют этилацетатом. Органический раствор последовательно промывают 1 N водной соляной кислотой, 1 N водным бикарбонатом натрия и насыщенным рассолом, затем сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают посредством колоночной хроматографии на силикагеле (50:50 гексан-этилацетат), получают в результате соединение, защищенное аллилоксикарбонилом (формула II в приведенной выше реакции III) в виде белой пены.

К перемешиваемому, охлажденному (0^oC) раствору 208 мг (0,200 ммоль) полученного продукта в 2 мл метиленхлорида добавляют 2,4 мг (0,020 ммоль) ДМАП и 82 мг (0,400 ммоль) ДКХ, затем раствор 63 мг (0,400 ммоль) моноаллилсукцината в 0,5 мл метиленхлорида. Реакционную смесь перемешивают при 0^oC в течение 14 часов, а полученную суспензию фильтруют через воронку с пористой стеклянной пластинкой. Органический раствор концентрируют при пониженном давлении, остаток очищают посредством колоночной хроматографии на силикагеле (30: 70 гексан-этилацетат), получая продукт (формула III из приведенной выше реакции III) в виде белой пены.

К перемешиваемому раствору 177 мг (0,150 ммоль) полученного продукта в 5 мл метиленхлорида добавляют 17,3 мг (0,015 ммоль) тетракис(трифенилфосфин)палладия и 0,080 мл (0,3 ммоль) трибутилтингидрида. Желтый раствор перемешивают в течение 2 часов при температуре окружающей среды и разбавляют этилацетатом, один раз промывают холодной 2 N водной лимонной кислотой и три раза насыщенным рассолом, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. После колоночной хроматографии на силикагеле (85:15 этилацетат-метанол) получают гемисукцинат (формула IV реакции III) в виде бледно-желтого масла.

б) 28-O-сукцинимидооксисукцинил-40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин Раствор 53 мг (0,050 ммоль) гемисукцината по стадии а) в 2,5 мл метиленхлорида обрабатывают 2 мг ДМАП, 24 мг (0,125 ммоль) ЭДК и 14 мг (0,125 ммоль) N-гидроксисукцинимида. После перемешивания в течение 2 часов при температуре окружающей среды реакцию останавливают добавлением 1 N водного бикарбоната натрия. Смесь экстрагируют тремя порциями этилацетата. Органический раствор промывают водным бикарбонатом натрия и рассолом, сушат над безводным бикарбонатом натрия, фильтруют и концентрируют, получая в результате указанный в заголовке активированный гаптен (соединение формулы V реакции III), используемый для получения конъюгата белок-гаптен без дальнейшей очистки, и который имеет следующие характерные спектроскопические свойства:
¹H ЯМР (CDCl₃), δ 2,43 (1H, dd, H33a), 2,50-2,98 (10H, m, H25, H33b, сукцинатные водороды, сукцинимидные водороды), 3,58 (2H, m, H6b, 1 гидроксиэтил Н), 3,68 (3H, m, H16, 2 гидроксиэтил Н), 3,81 (2H, m, H14, 1 гидроксиэтил Н), 3,93 (1H, d, H27), 5,28 (2H, m, H2, H30), 5,34 (1H, d, H28); MC (FAB) 1161 ([M+Li]⁺).

ПРИМЕР 3 - Получение 28-O-активированного рапамицина
а) 28-O-гемисукцинат рапамицина
К перемешиваемому, охлажденному (0^oC) раствору 914 мг (1,00 ммоль) рапамицина в 2,2 мл 10:1 метиленхлорид-пиридина добавляют 0,212 мл (2,00 ммоль) аллилхлорформиата. Спустя 3 часа добавляют 0,080 мл (1,000 ммоль) пиридина и 0,053 мл (0,50 ммоль) аллилхлорформиата. Перемешивание продолжают еще в течение часа, а затем реакцию останавливают добавлением 1 М водного бикарбоната натрия. Полученную смесь экстрагируют три раза метил-t-бутиловым эфиром. Органический раствор промывают последовательно холодной 1 N водной соляной кислотой, 1 N водным бикарбонатом натрия и насыщенным рассолом, затем сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают посредством колоночной хроматографии на силикагеле (70:30 гексан-этилацетат), получая в результате соединение, защищенное аллилоксикарбонилом (формула II в реакции IV) в виде белой пены.

К перемешиваемому, охлажденному (0^oC) раствору 400 мг (0,400 ммоль) полученного продукта в 5 мл метиленхлорида добавляют 4,8 мг (0,040 ммоль) ДМАП 164 мг (0,400 ммоль) ДКХ, затем раствор 127 мг (0,800 ммоль) моноаллилсукцината в 1 мл метиленхлорида. Реакционную смесь перемешивают при -15^oC в течение 14 часов, а полученную суспензию фильтруют через воронку с пористой стеклянной пластинкой. Органический раствор концентрируют при пониженном давлении, остаток очищают посредством колоночной хроматографии на силикагеле (40: 60 гексан-метил-t-бутиловый эфир), получая продукт (формула III из приведенной выше реакции IV) в виде белой пены.

К перемешиваемому раствору 285 мг (0,250 ммоль) этого продукта в 5 мл метиленхлорида добавляют 28,8 мг (0,025 ммоль) тетракис(трифенилфосфин) палладия и 0,133 мл (0,5 ммоль) трибутилингидрида. Желтый раствор перемешивают в течение 1 часа при температуре окружающей среды и разбавляют метил-t-бутиловым эфиром, дважды промывают холодной 2 N лимонной кислотой и трижды - насыщенным рассолом, сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. После колоночной хроматографии на силикагеле (90: 10-60:40 метил-t-бутиловый эфир-метанол) получают 28-O- гемисукцинат рапамицина (соединение формулы IV, реакция IV) в виде бледно-желтого масла.

б) 28-O-сукцинимидооксисукцинил-рапамицин
Раствор 51 мг (0,050 ммоль) продукта по стадии а) в 2 мл метиленхлорида обрабатывают 2 мг ДМАП, 24 мг (0,125 ммоль) ЭДК и 14 мг (0,125 ммоль) N-гидроксисукцинимида. После перемешивания в течение 4 часов при температуре окружающей среды реакцию останавливают добавлением 1 N водного бикарбоната натрия. Смесь экстрагируют тремя частями метил-t-бутилового эфира. Органический раствор промывают водным бикарбонатом натрия и рассолом, сушат над безводным бикарбонатом натрия, фильтруют и концентрируют, получая активированное соединение, указанное в заголовке, которое используют для получения конъюгата белок-гаптен без последующей очистки, которое обладает следующими характерными спектроскопическими свойствами:
¹H ЯМР (CDCl₃) δ 2,43 (1H, dd, H33a), 2,55-3,02 (11Н, m, H25, H33b, H39, сукцинатные водороды, сукцинимидные водороды), 3,56 (1H, m, H6b), 3,68 (1H, dd, H16), 3,83 (1H, m, H14), 3,93 (1H, d, H27), 5,28 (2H, m, H2, H30), 5,34 (1H, d, H28); MC (FAB) 1117 ([M+Li]⁺).

ПРИМЕР 4 - Получение иммуногенных конъюгатов
а) 40-O-связанные конъюгаты рапамицина
17,4 мг 40-O-активированного рапамицина из Примера 1 растворяют в 400 мкл ДМФ или ДМСО. 120 мкл (то есть содержащего 5,22 мг активированного рапамицина) этого раствора добавляют по каплям при интенсивном перемешивании к раствору, содержащему 8 мг гемоцианина лимфы улитки (ГЛУ) в 2 мл 0,1 М NaHCO₃ буфера (pH 7,7). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре, а полученный рапамицин-ГЛУ конъюгат очищают путем диализа при 4^oC против 5 л ЗФР, 3X в течение 48 часов. Конъюгат может быть далее сконцентрирован путем центрифугирования с использованием микроконцентраторных пробирок. Конъюгат рапамицин-БСА и рапамицин-ОВА получают аналогичным образом, заменяя КЛУ в описанной выше процедуре на БСА или ОБА.

б) 28-O-связанные (возможно 40-O-алкилированный) конъюгаты рапамицина
5 мг 28-O-активированного соединения из Примера 2 растворяют в 2 мл ДМСО и по каплям при интенсивном перемешивании добавляют к раствору, содержащему 5 мг КЛУ в 1 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,3). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре, а полученный конъюгат очищают посредством диализа при 4^oС против 2 л ЗФР, 3X свыше 48 часов. Конъюгаты с БСА и ОБА конъюгаты получают таким же образом. Рапамицин конъюгируют с КЛУ, БСА и ОБА через положение 28, используя 28-O активированное соединение из Примера 3, тем же способом.

ПРИМЕР 5 - Получение моноклонального антитела
а) Моноклональное антитело к рапамицину
Моноклональное антитело получают, применяя соответствующие способы, главным образом, как описано [5]. Самки Balb/C мышей (20-25 г) получают по 10 или 50 мкг 40-O-связанного рапамицин-КЛУ иммуногенного конъюгата из Примера 4a) в 0,2 мл полного адъюванта Фройнда, вводимых посредством подкожной инъекции в четырех местах. Спустя 2 недели делают вторичную инъекцию, содержащую то же количество иммуногенного конъюгата, эмульгированного в 0,2 мл неполного адъюванта Фройнда, опять же путем подкожного инъецирования. Присутствие антител к данному антигену в сыворотке крови животных определяют путем прямого ELISA, как описано в приводимом ниже Примере 6. Мыши могут проходить дальнейший отбор на антитело к эффекторной области (низкая перекрестная реактивность с FK-506) и к FKBP-связывающей области (высокая перекрестная реактивность к FK-506). На фиг. 1, например, представлены титрационные кривые для мыши (М1), имеющей высокий уровень антитела к связывающему домену рапамицина, и другой мыши (М7), имеющей соответственно высокие уровни антитела к эффекторному домену. Мыши, показавшие максимальные уровни антитела соответствующей специфичности в кровяной сыворотке, получают вторичные инъекции, содержащие 10 мкг антигена, половину внутрибрюшинно, половину внутривенно на сутки -3, и внутрибрюшинно на сутки -2 и -1. На сутки 0 мышей умерщвляют и их клетки селезенки выделяют и сливают с PAI-0 клетками или клетками другой подходящей миеломной линии. Полученные гибридомы культивируют и селектируют с помощью ELISA на экспрессию антитела, имеющего высокое средство с рапамицином.

б) Моноклональное антитело к 40-(гидроксиэтил)-рапамицину
Самки Balb/С мышей получают 10 или 50 мкг 40-(гидроксиэтил)-рапамицин КЛУ иммуногенного конъюгата из Примера 46) в 0,2 мл полного адъюванта Фройнда путем подкожных инъекций в 4 точках. Спустя 2 недели делают повторную инъекцию (вторичную иммунизацию), содержащую то же самое количество иммуногенного конъюгата, эмульгированного в 0,2 мл неполного адъюванта Фройнда, опять же путем подкожного инъецирования. Присутствие антител к данному антигену в сыворотке крови животных тестируют посредством прямого ELISA, как описано ниже. Кроме того, мышей селектируют далее на антитело к области молекулы рапамицина, модифицированной в 40-O области, путем связывания с конъюгатом БСА-рапамицина по сравнению с конъюгатом БСА-40-O(2-гидроксиэтил)-рапамицина. Получают как антитела, которые связываются с конъюгатом 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицина, но не связываются со сконъюгированным рапамицином, так и антитела, которые связываются с конъюгатами, как 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицина, так и рапамицина. Мыши, показывающие максимальные уровни антитела соответствующей специфичности в сыворотке крови, получают инъекции вторичной иммунизации, содержащие 10 мкг антигена, половину - внутрибрюшинно, половину - внутривенно, на сутки -3, и внутрибрюшинно - на сутки -2 и -1. На 0-е сутки мышей умервщляют, их клетки селезенки выделяют и сливают с PAI-0 клетками. Полученные гибридомы культивируют и селектируют, используя ELISA для экспрессии антитела, имеющие высокое сродство к 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицину.

ПРИМЕР 6 - Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)
a) ELISA для рапамицина
Микротитрационные планшеты сенсибилизируют 1-2 мкг/мл конъюгата рапамицин-БСА в ЗФР в течение 2 часов при 37^oC, затем насыщают 2%-ным БСА в ЗФР в течение 1 часа при 37^oC и промывают ЗХ 0,05%-ным Твин-ЗФР. Супернатанты гибридом, подлежащие скриннингу, разводят в 1%-ном растворе БСА в ЗФР и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре (либо 18 часов при 4^oC или 2 часа при 37^oC). Уровень связанного антитела измеряют с помощью антимышиного IgG козьего глобулина, пришитого к щелочной фосфатазе с пара-нитрофенилфосфатом в качестве субстрата. После инкубации в течение двух часов при 37^oC энзиматический субстрат гидролизуют (1 час при комнатной температуре) и измеряют поглощение при 405 нм. Гибридомы селектируют по продуцированию моноклонального антитела с высоким сродством.

Стандартные кривые для определения относительного сродства отселектированного антитела к рапамицину получают с помощью растворов, содержащих известные концентрации рапамицина (например от 1 до 140 нг/мл в кровяной сыворотке). На фиг. 2, например, представлена стандартная кривая для нашего моноклонального антитела М7-91, показывающая, что то моноклональное антитело, которое было отселектировано как высокоспецифичное в отношении рапамицина, способно выявлять рапамицин на уровнях порядка 0,25 нг/мл.

Кроме того, антитела могут быть охарактеризованы по связыванию с эффекторным или FKBP-связывающим доменами рапамицина путем измерения перекрестной реактивности с FK-506 в аналогичном прямом ELISA с использованием микротитрационных планшетов, сенсибилизированных FK 506-БСА конъюгатом, который может быть получен аналогично рапамицин-БСА конъюгату. Например, сравнение связывающих уровней 17 отселектированных моноклональных антител в тестах с рапамицин-БСА и FK-506 представлено на фиг. 3; перекрестная реактивность в процентном выражении представлена на фиг. 4. При таком сравнении связывания с рапамицин-БСА против FK 506-БСА выявляют моноклональные антитела с очень низким сродством.

Упоминаемый выше прямой ELISA может быть заменен на конкурентный ELISA, в котором в раствор моноклонального антитела добавляют конкурент и измеряют связывание моноклонального антитела с конъюгатом в присутствии и отсутствии конкурента. Если конкурентом является FK-506 или рапамицин, то конкурент в виде этанольного раствора, например 1 мг/мл, добавляют непосредственно к раствору моноклонального антитела (например 2 мкл/200 мкл/лунку), а затем разводят в микротитрационном планшете. На фиг. 5, например, представлена кривая ингибирования для связывания М7-91 антитела (М7.91.13) с БСА-рапамицином в присутствии различных концентраций свободного рапамицина. В таком конкурентном ELISA, в котором сравнивают связывание моноклональных антител со свободным FK-506 против свободного рапамицина, проявляется меньшая перекрестная реактивность между рапамицином и FK-506, чем в прямом ELISA. Такой конкурентный тест предпочтителен для селекции моноклональных антител, поскольку считается, что некоторые моноклональные антитела могут иметь слишком низкое сродство, для того, чтобы связывать их антиген в свободной форме в растворе, но могут, тем не менее, осуществлять бивалентное или поливалентное связывание с мультимерным антигеном, который содержит много гаптенов, связанных очень тесно друг с другом на большой белковой молекуле. Конкурентный тест исключает подобные антитела с низким сродством. Результаты такого конкурентного теста представлены на фиг. 6, который включает М7-91 антитело (М7.91.13), которое имеет относительно низкую перекрестную реактивность с М1-303 (М1.303.3) антителом, имеющим относительно высокую перекресную реактивность.

б) ELISA для 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицина
Этот ELISA проводят аналогично способу, описанному в а). Микротитрационные планшеты сенсибилизируют 40-O-(гидроксиэтил)-рапамицин-БСА, насыщают БСА и промывают. Гибридомные супернатанты, подлежащие скриннингу, инкубируют 18 часов при 4^oC или 2 часа при 37^oC. Уровень связанного антитела измеряют с помощью козьего глобулина против мышиного IgG, пришитого к щелочной фосфатазе с пара-нитрофенилфосфатом в качестве субстрата. Параллельный ELISA проводят с применением связанного рапамицин-БСА для селекции на моноклональные антитела, способные отличать 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин от рапамицина. На фиг. 7 представлены, например, супернатанты гибридомы B3-203, связывающиеся селективно с 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин-БСА (обозначен на рисунке как БCA-28-RAD) (фиг. 7, А), гибридомы B3-113, узнающей как 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин-БСА, так и рапамицин-БСА, сконъюгированные через положение 28 (фиг. 7, В), и гибридомы B3-164, которая узнает кроме того рапамицин, сшитый с БСА через положение 40 (фиг. 7, С).

Относительное сродство антител к 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицину против рапамицина измеряют далее путем конкуренции связывания антител к сенсибилизированному 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин-БСА конъюгату с 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицином или свободным рапамицином в растворе. На фиг. 8 например показано, что антитела, продуцируемые гибридомой B3-203, сильно реагируют с 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицином с низкой перекрестной реактивностью для рапамицина (фиг. 8, А) и что антитела, продуцируемые гибридомой B3-113 и B3-164, связываются одинаково хорошо с 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицином и рапамицином (фиг. 8, В и С). Другие гибридомы, продуцирующие антитела, связываются по меньшей мере в 10-100 раз лучше с 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицином, чем с рапамицином, включая B3-22, B3-127 и B3-156. Другие гибридомы, такие как B3-29, B3-265 и B3-539, продуцируют антитела, которые связывают рапамицин также хорошо, как и 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин.

После того как требуемое антитело отселектировано, такой же ELISA применяют для определения уровней рапамицина в крови у пациентов. Набор для тестирования согласно этому примеру должен содержать одно или более отобранных антител в лиофилизированной форме, микротитрационный планшет, сенсибилизированный конъюгатом рапамицина (например, рапамицин-БСА конъюгатом или 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицин-БСА конъюгатом), рапамициновым стандартом и инструкциями по применению. Возможно также, чтобы набор мог содержать кроме того меченное производное рапамицина для применения в конкурентном тесте. Дополнительно могут быть включены конъюгат анти-мышиный IgG-фермент и субстрат. С другой стороны, пользователь может применять моноклональное антитело по изобретению в его собственном разработанном ELISA или другой тест-системе.

ЛИТЕРАТУРА
1. EP 041795.

2. WO 92/02946.

3. US 5258389.

4. PCT/EP 93/02604.

5. Koehler and Milstein, Nature 256: 49.

Формула изобретения

1. Моноклональное антитело к рапамицину, характеризующееся тем, что оно способно распознавать эпитоп на FKBP-связывающем домене рапамицина и имеет перекрестную иммунореактивность к FK-506 более 50%.

2. Моноклональное антитело по п.1, отличающееся тем, что получено с использованием конъюгата активированного производного рапамицина с иммуногенным белком.

3. Моноклональное антитело по п.1 или 2, отличающееся тем, что получено посредством: а) взаимодействия рапамицина, имеющего активированную связывающую группу, с иммуногенным белком с образованием иммуногенного конъюгата, б) введения указанного иммуногенного конъюгата соответствующему виду животных для того, чтобы вызвать контрольное иммуногенное заражение и получить продуцирующие антитело клетки, сенсибилизированные к указанному конъюгату, в) иммортализации указанных продуцирующих антитело клеток, и г) выделения моноклонального антитела из отобранной иммортализированной клеточной линии, полученной таким образом.

4. Моноклональное антитело по п.2, отличающееся тем, что получено в результате взаимодействия 40-O-сукцинимидооксисукцинил-рапамицина или 28-O-сукцинимидооксисукцинил-рапамицина с иммуногенным белком с образованием иммуногенного конъюгата.

5. Моноклональное антитело к рапамицину, характеризующееся тем, что оно способно распознавать эпитоп на эффекторном домене рапамицина и имеет перекрестную иммунореактивность к FK-506 менее чем 20%.

6. Моноклональное антитело по п.5, отличающееся тем, что получено с использованием конъюгата активированного производного рапамицина с иммуногенным белком.

7. Моноклональное антитело по п.5 или 6, отличающееся тем, что получено посредством: а) взаимодействия рапамицина, имеющего активированную связывающую группу, с иммуногенным белком с образованием иммуногенного конъюгата, б) введения указанного иммуногенного конъюгата соответствующему виду животных для того, чтобы вызвать контрольное иммуногенное заражение и получить продуцирующие антитело клетки, сенсибилизированные к указанному конъюгату, в) иммортализации указанных продуцирующих антитело клеток, и г) выделения моноклонального антитела из отобранной иммортализированной клеточной линии, полученной таким образом.

8. Моноклональное антитело по п.6, отличающееся тем, что получено в результате взаимодействия 40-O-сукцинимидооксисукцинил-рапамицина или 28-O-сукцинимидооксисукцинил-рапамицина с иммуногенным белком с образованием иммуногенного конъюгата.

9. Моноклональное антитело к 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицину, характеризующееся тем, что получено с использованием конъюгата активированного 28-O-рапамицина с иммуногенным белком и имеет перекрестную иммунореактивность к рапамицину менее чем 10%.

10. Моноклональное антитело по п.9, отличающееся тем, что получено посредством: а) взаимодействия 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицина, имеющего активированную связывающую группу, с иммуногенным белком с образованием иммуногенного конъюгата, б) введения указанного иммуногенного конъюгата соответствующему виду животных для того, чтобы вызвать контрольное иммуногенное заражение и получить продуцирующие антитело клетки, сенсибилизированные к указанному конъюгату, в) иммортализации указанных продуцирующих антитело клеток, г) выделения моноклонального антитела из отобранной иммортализированной клеточной линии, полученной таким образом.

11. Моноклональное антитело по п.10, отличающееся тем, что получено в результате взаимодействия 28-O-(сукцинимидооксисукцинил)-40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицина с иммуногенным белком с образованием иммуногенного конъюгата.

12. Набор для иммунотестирования уровня рапамицина или 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицина в крови, отличающийся тем, что включает в себя моноклональное антитело, как определено в любом из пп.1 и 2, 5 и 6 или 9 и 10, соответственно.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14