Антибактериальная композиция с 1-n-этилгентамицином c1а

 

Изобретение относится к микробиологии и медико-биологической промышленности и может быть использовано в медицинской практике. В результате ферментации мутантного штамма Micromonospora echinospora CGMCC 0197 получают однокомпонентный гентамицин типа С_1а, который после очистки используют для синтеза антибиотика 1-N-этилгентамицина С_1а. Полученный указанным способом полусинтетический 1-N-этилгентамицин С_1а вводят в качестве активного начала в состав композиции, которая, помимо названного антибиотика, содержит фармацевтически приемлемые нейтральные носители и обладает выраженным антибактериальным действием. 11 ил., 7 табл.

Область применения изобретения Изобретение относится к микробиологии и антибиотикам. Изобретение, в частности, относится к новому мутантному штамму, к способу получения потомства мутанта, к однокомпонентному гентамицину С_1а, продуцируемому этим штаммом и применяемому в качестве исходного ядра полусинтетического антибиотика 1-N-этилгентамицина С_1а, (1-N-этилгентамицин С_1а назван этимицином), к препаратам, содержащим в качестве активных компонентов производные полусинтетического гентамицина в смеси с фармацевтически приемлемыми добавками, и к способам приготовления препаратов.

Предпосылки создания изобретения Хорошо известны три компонента гентамицина (ГМ), получаемых при ферментации существующих штаммов: гентамицин ₁ (ГМС₁), гентамицин С₂ (ГМС₂) и гентамицин С_1а (ГМС_1а). Качество, также как и действие гентамицина, непосредственно зависят от содержания трех компонентов. В работе Yang Yun-Liu и др. , Antibiotics, т. 7, 1, 12-15 (1982), Академия Наук Китая, приводятся значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) против выделенных клинически 74 штаммов Р. Aeurginosa и величины ЛД₅₀ для каждого компонента гентамицина С, причем качество компонента ГМС_1а улучшается при его выделении из многокомпонентного гентамицина, для чего требуется сложная технология и оборудование, что повышает стоимость продукта. Для преодоления указанных недостатков необходимы штаммы, продуцирующие однокомпонентный гентамицин. С другой стороны, гентамицин, являющийся антибиотиком типа аминогликозидов, впервые обнаружен M.J.Weisten и др. из Шеринг Корпорейшн оф Америка в 1963 г., появился на рынке только примерно 20 лет спустя. И в наши дни гентамицин все еще находит широкое клиническое применение. Однако вследствие побочных эффектов, проявляющихся в ототоксичности и нефротоксичности, применение гентамицина в медицине до определенной степени ограничено. В настоящее время большое внимание уделяется созданию новых производных гентамицина, отличающихся низкой токсичностью и высокой эффективностью, особенно производных с активностью против устойчивых к гентамицину штаммов.

В обнаруженном при патентном поиске патенте США 4063847 (все патенты указаны в качестве ссылок) раскрыто соединение, являющееся аминогликозидным антибиотиком и производным гентамицина, в котором некоторые группы гентамицина селективно защищены. В патентах США 4063015 и 4044123 раскрыт 1,3,2'-три-N-ацетилгентамицин, являющийся антибиотиком и применяемый в качестве промежуточного соединения в синтезе 6'-N-алкиламиногликозида. В патенте Канады 1034573 раскрыты 1-N-(замещение)-4,6-диаминогликозил-1,3-диаминоциклиты. Ни в одном из прототипов не обнаружен штамм, продуцирующий однокомпонентный гентамицин и не сообщается о производных полусинтетического 1-N-этилгентамицина и их препаратах, в которых однокомпонентный гентамицин, полученный ферментацией штамма, применяется в качестве промежуточного соединения (исходное ядро).

Раскрытие сущности изобретения Первой целью настоящего изобретения является получение штамма, с помощью которого может быть продуцирован однокомпонентный гентамицин. Указанный штамм депонирован в Центре Коллекционных общих микроорганизмов Китая (сокращенно СGМСС) 23 апреля 1993, штамм назван мутантом М.echinospora и зарегистрирован под CGMCC 0197.

Вторая цель изобретения состоит в способе мутагенной селекции, которым может быть получен указанный штамм. Суспензию моноспор Micromonospora echinospora после облучения УФ в течение 3 минут и обработки 30 мин. 0,5%-ным раствором LiС1 наносят на пластину, содержащую микрономицин (2000 мкг/мл) и культивируют 14 дней при 37^oС. Отбирают моноколонию и скринингом получают мутант СGМСС 0197 Micromonospora echinospora.

Третья цель изобретения заключается в создании способа получения производных 1-N-этилгентамицина С общей формулы (I): или их солей, образованных добавлением кислот.

Способ состоит в: (1) гентамицин С₁ или гентамицин С₂, гентамицин С_1a и гентамицин С_2b, применяемые в качестве исходных ядер, растворяют в апротонном растворителе с последующей защитой аминогрупп за исключением аминогруппы в положении 1 ацильной группой в присутствии соли двухвалентного переходного металла, (2) аминогруппу в положении 1 этилируют ацетальдегидом в присутствии восстановителя, (3) все защитные группы удаляют гидролизом, (4) производное гентамицина С выделяют в виде свободного основания или в виде соли, образованной добавлением кислоты.

Способ отличается тем, что гентамицин С_1a, применяемый в синтезе 1-N-этилгентамицина С_1a, получен из ферментационного бульона Micromonospora echinospora мутанта CGMCC 0197 с использованием методики ионнообменного выделения. Способ отличается также и тем, что получение гентамицина С_1а включает следующие стадии (см. схему I в конце текста).

Еще одной целью настоящего изобретения является получение полусинтетического антибиотика, представленного производным 1-N-этилгентамицина общей формулы (I) или его солями:

отличающейся тем, что R₅-этил, R₁ и R₂, независимо друг от друга, - метил или водород, отличающаяся дополнительно тем, что R₅=С₂Н₅, R₁=H и R₁=H или CH₃, отличающаяся тем, что R₁=R₂=H, R₅=C₂H₅.

Еще одной целью данного изобретения является получение препарата, отличающегося тем, что содержит 0,01-99,99% (по массе) производного 1-N-этилгентамицина или его соли (в качестве активного компонента) общей формулы (I):

и фармацевтически приемлемого носителя 99,99-0,01% (по массе).

Препарат дополнительно характеризуется тем, что в формуле активного компонента R₅= C₂H₅, R₁=H и R₂=Н или CH₃, отличающегося тем, что в формуле активного компонента R₅=С₂Н₅ и R₁=R₂=Н.

Прилагаемые диаграммы и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. ИК означает инфракрасное излучение. УФ означает ультрафиолетовое излучение. ЯМР - ядерный магнитный резонанс. ТСХ - тонкослойная хроматография.

Краткие пояснения к диаграммам
Фиг. 1 - ИК-спектр 1-N-этилгентамицина С_1a.

Фиг. 2 - УФ-спектр 1-N-этилгентамицина С_1a.

Фиг. 3 - спектр-¹Н-ЯМР 1-N-этилгентамицина С_1a.

Фиг. 4 - спектр ¹³С-ЯМР 1-N-этилгентамицина С_1a.

Фиг. 5 - масс-спектр 1-N-этилгентамицина С_1a.

Фиг. 6 - ТСХ на пластинках силикагеля продуктов ферментации мутанта M. echinospora СGМСС 0197.

Фиг. 7 - УФ-спектр продуктов ферментации мутанта М.echinospora СGМСС 0197.

Фиг. 8 - ИК-спектр продуктов ферментации мутанта СGMCС 0197 М.echinospora.

Фиг. 9 - ЯМР-спектр продуктов ферментации мутанта М.echinospora. CGMCC 0197.

Фиг. 10 - масс-спектр продуктов ферментации мутанта М.echinospora CGMСС 0197.

Оптимальный способ осуществления данного изобретения
Приготовление 1-N-этилгентамицина С_1a:
1. Образование мутанта М.echinospora CGMCC 0197 индуцированной мутацией.

Используя исходный штамм М.echinospora, облучают ее ультрафиолетовыми лучами в течение 3 мин, и обрабатывают раствором 0,5% LiCl полчаса. Затем покрывают пластинку, содержащую микромономицин (2000 мкг/мл), суспензией вышеполученной моноспоры и культивируют при 37^oС в течение 14 дней. Отбирают моноколонию и подвергают скринингу с получением мутанта М.echinospora CGMCC 0197, который культивируют на скошенном агаре и сохраняют в пробирках с песком.

2. Получение исходного ядра гентамицина С_1a (ГМС_1a)
Ферментацию мутанта М.echinospora CGMCC 0197, продуцирующего однокомпонентный ГМС_1a, и последующее выделение ГМС_1a осуществляют трехстадийным способом, в котором гентамицин С_1a извлекают из бульона (800 единиц/мл, содержание > 85%) ионообменной смолой и после очистки получают гентамицин С_1a чистотой 90-95%.

Методика иллюстрируется схемой II (см. в конце текста).

3. Синтез производных 1-N-этилгентамицина (см. схему III в конце текста).

Пример 1. Способ получения СGМСС 0197 разведением в условиях индуцированной мутации
К скошенному агару с М.echinospora JIM-401 добавляют 10 мл стерилизованной воды, споры соскребают и переносят в стерилизованные колбы для встряхивания, заполненные стеклянными шариками. Колбы встряхивают 15 минут и фильтрованием раствора спор через стерилизованную фильтровальную бумагу получают суспензию моноспор. Суспензию разбавляют, обрабатывают 30 мин при 30^oС 0,3% раствором LiCl и затем 3 мин УФ (30 Вт). Обработанную суспензию разбавляют стерилизованной водой, наносят на планшеты, содержащие 2000 мкг/мл микрономицина и культивируют 14 дней при 35^oС. Отбирают микроколонии, засевают на скошенном агаре и культивируют 8 дней при 37^oС, затем пересевают в качалочные колбы и культивируют 6 дней при 35^oС при непрерывном перемешивании.

Проверкой культуральной жидкости с помощью ТСХ выявлено присутствие мутанта М.echinospora СGМСС 0197. Мутант отличается от исходного штамма характеристиками культуры, биохимически-физиологическими свойствами, потреблением источника углерода и продуктами ферментации. Исходный штамм продуцирует в качестве основного компонента микрономицин (60-70%), а также гентамицин С_1а (20%), в то время как мутант СGМСС 0197 продуцирует только однокомпонентный антибиотик, идентичный гентамицину С_1a (ГМС₁), идентифицированному с помощью ТСХ, УФ, ИК, ЯМР и МС.

Сравнение характеристик культуры, биохимически-физиологических свойств и потребление источника углерода для штаммов JIМ-202 и JIМ-401 приведено в таблицах 1-3, соответственно.

Результаты ТСХ, УФ, ИК, ЯМР и МС анализа продукта, продуцируемого мутантом СGМСС 0197, приведены на фиг. 7-10, соответственно.

Аминокислотный анализ гидролизата полных клеток СGМСС 0197 показал, что СGМСС 0197 содержит глицин и мезо-диаминопимелиновую кислоту.

Пример 2. Получение гентамицина С_1a
В питательную среду (100 л) вносят инокулят из суспензии спор штамма СGМСС 0197. После культивирования 48 ч при 35±0,5^oС с аэрацией (1,2 об/об. мин^-1) и перемешиванием (230 об/мин) полученный продукт засевают в 2000 л среды и культивируют в вышеуказанных условиях. Спустя 24 ч продуктом культивирования инокулируют в 6500 л ферментационной среды при начальной аэрации 0,5 об/об.мин^-1 (6 ч), после чего культивируют 126 ч при 34±0,5^oС в условиях аэрации (1 об/об.мин^-1) и перемешивании (180 об/мин). Через соответственно 24 ч - 60 ч добавляют 1500 л среды, а спустя 84 ч добавляют 1000 л воды. В результате получают 9000 л ферментационного бульона ГМС_1a (оценка биохимической активности 880 мкг/мл). Добавлением концентрированной соляной кислоты в бульоне устанавливают рН 2,5, нагревают до 70^oC и выдерживают 10 мин, добавлением 6 молей/л NаОН в бульоне устанавливают рН 6,8 и после прибавления 120 л ионообменной 732(NH₄ ⁺)смолы полученную смесь перемешивают 5 ч. Смолу загружают в колонну и промывают водой. Смолу элюируют 2 молями/л NH₃•H₂O. Элюат обесцвечивают пропусканием через колонку с С290(ОН^-)смолой и концентрируют в вакууме до 80 л. Концентрат абсорбируют на кoлонне (40•400 см), заполненной 450 л УРR-II смолой и после промывания водой элюируют 20%-ным водным раствором этанола. Содержащие ГМС_1a фракции объединяют, концентрируют в вакууме до 50 л и лиофилизацией получают 6050 г ГМС_1a чистотой 90-95%.

Смолы 732(NH₄ ⁺) и С290(ОН^-) производятся Шанхайской фабрикой смол, Китай.

Смола УPR-11 производится Янгжойской фармацевтической фабрикой, Китай.

Пример 3. Получение сульфата гентамицина С_1a.

В качалочную колбу для выращивания посевного материала на 500 мл, содержащую 100 мл питательной среды, вносят суспензию спор CGMCC 0197, культивируют 40 ч при 35±0,5^oC при непрерывном перемешивании (220 об/мин), затем полученный инокулят из пяти колб помещают в ферментеp, содержащий 10 л питательной среды и культивируют 120 ч при 35±0,5^oC и аэрировании (1 об/об. мин^-1) и перемешиванием с добавлением простерилизованной воды, компенсируя испаренную. Добавлением щавелевой кислоты в полученном ферментационном бульоне (9,5 л) (820 мкг/мл) устанавливают рН 3, нагревают до 70^oС и выдерживают 10 мин, затем добавлением 6 молей/л NаОН устанавливают рН 6,8. После фильтрования из фильтрата на колонке, содержащей 120 мл 732(NН₄ ⁺) смолы, извлекают антибиотики. После промывания водой колонку элюируют 2 молями/л NH₃•Н₂О, элюат обесцвечивают пропусканием через колонку, содержащей 120 мл 711 (ОН^-) смолы, концентрируют до 60 мл в вакууме и добавлением 3 молей/л H₂SO₄ подкисляют до рН 5. После добавления 5 г активированного угля раствор выдерживают 30 мин при 60^oC, фильтруют с удалением активированного угля и лиофилизацией фильтрата получают 9 г сульфата ГМС_1a (чистота 90-95%).

Пример 4. Получение 1-N-этилгентамицина С_1a
(1) 3,2',6'-три-N-ацетилгентамицина С_1a
В диметилсульфоксиде (400 мл) растворяют гентамицин С_1a (10 г, 22 моля) и при перемешивании добавляют при 25^oC тетрагидрат ацетата кобальта (11 г, 44 моля). После выдерживания реакционной смеси 20 мин при 25^oC прибавляют каплями свежеприготовленный 1М раствор уксусного ангидрида в тетрагидрофуране (56 мл). Затем реакционную смесь перемешивают еще 1 ч, разбавляют водой (500 мл) и добавлением 2 молей/л соляной кислоты подкисляют до рН 4. Продукт абсорбируют на колонке (4•30 см) со смолой 732(NН₄ ⁺); промывают водой (2000 мл) и элюируют 2 молями/л гидроксида аммония. Содержащие продукт фракции объединяют и концентрируют в вакууме до 100 мл. Через концентрат пробулькивают сероводород до полного осаждения кобальта. Осадок отфильтровывают пропусканием через диатомит, фильтрат концентрируют до 50 мл и лиофилизацией получают 12,2 г (выход 80%, чистота 85%) 3,2',6'-три-N-ацетилгентамицина С_1a.

(2) 1-N-этил-3,2',6'-три-N-ацетилгентамицин С_1a.

В перемешиваемом и охлаждаемом (3^oC) растворе 3,2',6'-три-N-ацетилгентамицина С_1a (10 г) добавлением 1М соляной кислоты устанавливают рН 2,5. При перемешивании добавляют свежеприготовленную 40%-ную водную смесь ацетальдегид-тетрагидрофуран (1: 1, 10 мл) и прибавлением по каплям при 3^oС 2,5%-ного водного раствора боргидрида натрия рН смеси доводят до 4. После выдерживания 1 ч вышеприведенную процедуру повторяют до исчезновения в ТСХ пятна 3,2', 6'-три-N-ацетилгентамицина С_1a, элюируемого низшей фазой смеси хлороформ-метанол-28%-ный водный аммиак (2:1:1). Смесь концентрируют в вакууме, удаляя ацетальдегид и остаток хроматографируют на колонке (4•50 см) со смолой УPR-11, элюируя растворами 5%-ного, 10%-го, 20%-го этанола, содержащими 0,5М гидроксида аммония. Собирают элюат, содержащий 1-N-этил-3,2',6'-три-N-ацетилгентамицин С_1a, концентрируют его с последующей лиофилизацией и сушкой, получая при этом 5,6 г продукта (выход 62%).

(3) 1-N-этилгентамицин С_1a
В 100 мл 1М раствора гидроксида натрия растворяют 5 г 1-N-3,2',6'-три-N-ацетилгентамицина С_1a и раствор кипятят (100^oС) 48 ч. После охлаждения раствор разбавляют до 1000 мл и перемешивают с ионообменной 732 смолой (Н⁺, 100 мл), пока значение рН в растворе не достигнет 9. Смолу отфильтровывают, промывают водой, переносят в колонку и элюируют раствором 2 молей/л гидроксида аммония. Элюат испаряют в вакууме и остаток хроматографируют на колонке (2,5•30 см) с УРR-11 смолой и применением в качестве элюента 5%-го, 7,5%-го, 15%-го этанола, содержащего 0,5М гидроксида аммония. Фракции, содержащие 1-N-этилгентамицин С_1a, объединяют, испаряют в вакууме и лиофилизацией получают 2,7 г (выход 70%) чистого продукта.

(4) Сульфат 1-N-этилгентамицина С_1a
В 15 мл воды растворяют чистый 1-N-этилгентамицин С_1a (2 г), добавлением 3М раствора Н₂SО₄ (3,5 мл) рН раствора доводят до 5,8, после чего добавляют активированный уголь (1 г). Суспензию перемешивают 30 мин при 60^oС и затем фильтруют. Лиофилизацией раствора получают 2,2 г (выход 91%) сульфата 1-N-этилгентамицина C_1а.

Строение продукта примера 4 (4) установлено с помощью анализа с применением следующих приборов.

1. ИК-спектр, показанный на фиг. 1, получен на инфракрасном спектрофотометре модели 399-В (а именно, ПЭКО). Получен типичный для аминогликозида ИК-спектр.

2. УФ-спектр поглощения, показанный на фиг. 2, получен на спектрофотометре модели УФ-240 (ШМАДУЗ), растворитель Н₂О. Спектр отличается отсутствием поглощения в интервале 200-400 нм.

3. ¹Н-ЯМР-спектр, показанный на фиг. 3, получен на ЯМР-спектрометре модели АМ500 (БРУКЕР Ко.), оксид дейтерия в качестве растворителя, тетраметилсилан (ТМС) в качестве внутреннего стандарта, резонансная частота составляет 500,13 МГц.

4. ¹³С-ЯМР-спектр, показанный на фиг. 4, получен на ЯМР-спектрометре, оксид дейтерия в качестве растворителя, триметилсилан (ТМС) в качестве внутреннего стандарта, резонансная частота составляет 125,76 МГц. Характеристический пик при 47,02 ч/млн соответствует углероду из метилена в 1-N-этильной группе, пик при 16,43 ч/млн соответствует углероду метила в 1-N-этильной группе.

5. МС-спектр, показанный на фиг. 5, получен на МC-спектрометре модели ZAB-2F: m/е для (М+1)⁺ = 478, что идентично молекулярной массе С₂₁Н₄₃N₅O₇ (молекулярная формула 1-N-этилгентамицина С_1a). Кроме того, характеристические пики для 1-N-этилгентамицина С_1a наблюдаются при m/е 317 и m/е 258 (характеристические пики для 3-N-этилгентамицина наблюдаются при m/е 289 и m/е 288).

Пример 5. Получение 1-N-этилгентамицина С_2b.

(1) 3,2'-ди-N-ацетилгентамицин С_2b
В 40 мл диметилсульфоксида растворяют лиофилизованный гентамицин С_2b (1 г, 2,16 ммоля) и при 25^oC и перемешивании добавляют тетрагидрат ацетата кобальта (II) (1,1 г, 4,52 ммоля). После перемешивания 20 мин прибавляют по каплям свежеприготовленный 1 М раствор уксусного ангидрида в тетрагидрофуране (6,5 мл). После перемешивания в течение 1 ч продукт экстрагируют из смеси катионообменной смолой (например, смолой 732 (NН₄ ⁺) с элюированием раствором 2 молей/л гидроксида аммония. Элюат концентрируют в вакууме до объема 30 мл и через концентрат пробулькивают сероводород до полного осаждения кобальта. Осадок фильтруют, фильтрат концентрируют и лиофилизацией получают 1,05 г (выход 80%) 3,2'-ди-N-ацетилгентамицина С_2b.

(2) 1-N-этил-3,2'-ди-N-ацетилгентамицин С_2b
В 30 мл воды растворяют 3,2'-ди-N-ацетилгентамицина C_2b (1,05 г, 1,73 ммоля, чистота 90%), охлаждают до 3^oС и добавлением 1 М соляной кислоты рН в растворе доводят до 2,5. После добавления 1М свежеприготовленного раствора ацетальдегида в тетрагидрофуране (2 мл) смесь перемешивают 10 мин. Затем прибавляют по каплям раствор боргидрида натрия (9,5 мг, 2,5 ммоля) в воде (2 мл), поддерживая температуру 3^oС. Смесь перемешивают 1 ч, добавлением 1М соляной кислоты вновь устанавливают рН 2,5, после чего добавляют 0,2 мл вышеуказанного исходного раствора ацетальдегида. После перемешивания 5 мин по каплям добавляют раствор боргидрида натрия (16 мг, 0,42 ммоля) в небольшом количестве воды. После перемешивания 1 ч вышеприведенную процедуру повторяют с использованием 1М соляной кислоты, 0,2 мл ацетальдегида и 8 мг боргидрида натрия. После перемешивания 2 ч смесь испаряют в вакууме до 30 мл и остаток хроматографируют на абсорбционной смоле (например, УРR-11 смоле) с применением в качестве элюента 3%-го, 6%-го, 15%-го этанола. Содержащие продукт фракции (соответствующее продукту пятно в ТСХ проявляется в низшей фазе смеси хлороформ-метанол-гидроксид аммония (2:1:1)) объединяют, концентрируют и после лиофилизации получают 1-N-этил-3,2'-ди-N-ацетилгентамицин C_2b (0,59 г, выход 51%, чистота 86%).

(3) 1-N-этилгентамицин С_2b
В 1 М растворе гидроксида натрия (100 мл) растворяют 1-N-этил-3,2'-ди-N-ацетилгентамицин С_2b (0,59 г, 0,88 ммолей) и раствор гидролизуют кипячением 48 ч до момента, пока в ТСХ не будет наблюдаться единственное, соответствующее продукту, пятно, элюируемое в низшей фазе смеси хлороформ-метанол-28%-ый гидроксид аммония (2:1:1).

Добавлением раствора 3 молей/л Н₂SО₄ устанавливают рН 6, после чего хроматографируют на колонке (1•30 см) с абсорбирующей смолой (например, УРR-11 смолой) с применением в качестве элюента 3%-го (50 мл), 6%-го (50 мл) и 15%-го (100 мл) этанола. Содержащие продукт фракции объединяют, испаряют в вакууме и лиофилизацией получают 1-N-этилгентамицин С_2b (0,3 г, 0,17 ммоля, выход 82%, чистота 91%). ¹Н-ЯМР (D₂O), показан на фиг. 11: 1,22 (3Н, 1-N-C-CH₃), 1,26 (3Н, 4''-CH₃), 2,17 (3Н, 1-N-C-CH₃), 2,95 (3H, 3''-N-CH₃), 5,17 (Н, 1''-H), 5,85 (Н, 1'-Н).

Пример 6. Получение 1-N-этилгентамицина С₂
(1) 3,2',6'-три-N-ацетилгентамицин C₂
В 200 мл диметилсульфоксида растворяют гентамицин C₂ (5 г, 10,6 ммоля) и при 25^oС и перемешивании добавляют тетрагидрат ацетата кобальта (II) (5,4 г, 22 ммоля). После перемешивания в течение 20 мин прибавляют по каплям свежеприготовленный 1М раствор уксусного альдегида в тетрагидрофуране (28,5 мл). По окончании прибавления смесь перемешивают 1 ч и разбавляют водой (250 мл). Продукт адсорбируют на колонке (3•30 см) с катионообменной смолой 110 (Н⁺), промывают водой с удалением органического растворителя и элюируют раствором 2 молей/л гидроксида аммония. Фракции, содержащие 3,2',6'-три-N-ацетилгентамицин С₂, объединяют и концентрируют в вакууме. Через концентрат пропускают сероводород до полного осаждения кобальта. Осадок отфильтровывают на диатомите в качестве фильтрующего средства. Фильтрат концентрируют и лиофилизацией получают 3,2',6'-три-N-ацетилгентамицин С₂ (5,8 г, выход 51%, чистота 85%).

(2) 1-N-этил-3,2',6'-три-N-ацетилгентамицин С₂
Раствор 3,2',6'-три-N-ацетилгентамицина C₂ (4,5 г) в воде (100 мл) подкисляют 3М Н₂SО₄ до рН 5, охлаждают до 3^oС в бане с ледяной водой и добавлением 1M HCl устанавливают рН 3. Затем добавляют 6 мл свежеприготовленного 40%-го водного раствора смеси ацетальдегид-тетрагидрофуран (1:1). Прибавлением по каплям и перемешиванием 25%-го водного раствора боргидрида натрия в смеси устанавливают рН 4. Смесь перемешивают и выдерживают при значении рН 3-4 в течение 1 ч. Вышеприведенную процедуру повторяют 3-4 раза до полного исчезновения пятна в ТСХ, соответствующего 1-N-этил-3,2',6'-три-N-ацетилгентамицину C₂, в низшей фазе смеси хлороформ-метанол-гидроксид аммония (2: 1: 1). Смесь концентрируют в вакууме с удалением ацетальдегида и остаток хроматографируют на колонке (25•300 мм) со смолой CAD-40 и применением в качестве элюента 3%-го, 6%-го и 15%-го этанола (0,5 моля/л гидроксида аммония). Содержащие продукт фракции объединяют, концентрируют и лиофилизацией получают 3,2 г (выход 65%) 1-N-этил-3,2',6'-три-N-ацетилгентамицина C₂.

(3) 1-N-этилгентамицин C₂
В 1М растворе гидроксида натрия (50 мл) растворяют 1-N-этил-3,2',6'-три-N-ацетилгентамицин С₂ (2,5 г) и раствор кипятят 48 ч при 100^oC. Раствор охлаждают, водой доводят до 500 мл и добавлением 732(Н⁺) ионообменной смолы устанавливают рН 9. Смолу извлекают, переносят в колонку (3•15 см) и элюируют раствором 2 молей/л гидроксида аммония. Содержащую продукт фракцию концентрируют в вакууме и хроматографируют остаток на колонке (2,5•30 см) с CAD-40 адсорбирующей смолой с применением в качестве элюента 3%-го, 6%-го и 15%-го растворов этанола (0,5 моля/л гидроксида аммония). Однородные фракции, содержащие продукт, объединяют, концентрируют и лиофилизацией получают 1-N-этилгентамицин С₂ (1,4 г, выход 70%).

Пример 7. Получение 1-N-этилгентамицина С₁
(1) 3,2'-ди-N-ацетилгентамицин С₁
В 20 мл диметилсульфоксида растворяют гентамицин С₁ (0,477 г, 1 ммоль) и при 25^oС и перемешивании добавляют тетрагидрат ацетата кобальта (II) (0,53 г). После перемешивания в течение 20 мин по каплям прибавляют свежеприготовленный 1М раствор уксусного ангидрида в тетрагидрофуране (2,9 мл). По окончании прибавления смесь перемешивают дополнительно в течение 1 ч и затем разбавляют водой (25 мл). Продукт адсорбируют на кoлонке, заполненной 732(Н⁺) катионообменной смолой, промывают водой и элюируют раствором гидроксида аммония (2 моля/л). Аммонийгидроксидный элюат концентрируют до 20 мл и через концентрат барбатируют сероводород до полного осаждения кобальта. Осадок отфильтровывают, фильтрат концентрируют и после лиофилизации получают 3,2'-ди-N-ацетилгентамицин С₁ (0,45 г, выход 82%, чистота 85%).

(2) 1-N-этил-3,2'-ди-N-ацетилгентамицин С₁
Раствор 3,2'-ди-N-ацетилгентамицина С₁ (0,45 г) в воде (15 мл) подкисляют до рН 3 добавлением 1М соляной кислоты, охлаждают до 3^oС и раствор поддерживают при этой температуре в бане с ледяной водой. Добавляют свежеприготовленный 40%-ный раствор смеси ацетальдегид-тетрагидрофуран (1:1, 0,84 мл), перемешивают 10 мин и затем по каплям прибавляют 10%-ный водный раствор цианоборгидрида натрия. Добавлением раствора 1 моля/л НС1 устанавливают рН 3-4. После перемешивания 1 ч вышеприведенную процедуру повторяют до тех пор, пока в ТСХ не исчезнет пятно, соответствующее 3,2'-ди-N-ацетилгентамицину С₁. Смесь концентрируют в вакууме с удалением ацетальдегида и остаток хроматографируют на колонке, заполненной УРR-11, с элюированием 5%-ным, 10%-ым и 20%-ым растворами этанола (0,5 моля/л гидроксида аммония). Содержащие продукт фракции объединяют, концентрируют и после лиофилизации получают 1-N-этил-3,2'-ди-N-ацетилгентамицин С₁ (0,234 г, выход 48%).

(3) 1-N-этилгентамицин С₁
Полученный на предшествующей стадии продукт растворяют в 30 мл 1М гидроксида натрия и кипятят 48 ч до момента, пока в ТСХ не останется единственное, соответствующее ожидаемому продукту пятно. Как и в примере 6, полученный элюат концентрируют и остаток хроматографируют на колонке, заполненной УРR-11 адсорбирующей смолой, с элюированием 3%-ным, 6%-ным и 15%-ным растворами этанола (0,5 моля/л гидроксида аммония). Содержащие продукт фракции объединяют, концентрируют и после лиофилизации получают 1-N-этилгентамицин С₁.

Пример 8. Приготовление раствора для инъекций, содержащего сульфат 1-N-этилгентамицина С_1a
Применимый клинический раствор для инъекций может быть получен на основе сульфата 1-N-этилгентамицина С_1a или его других водорастворимых солей.

Рецепт раствора для инъекций - На инъекцию
Сульфат 1-N-этилгентамицина С_1a - 50 г (единица)
Безводный сульфит натрия - 2 г
Вода для инъекций - доводят до 1 л
pH - 5-7
Методика. В подходящий сосуд помещают 80% от общего объема воды для инъекций. Загружают и растворяют безводный сульфит натрия и сульфат 1-N-этилгентамицина С_1a, устанавливают рН и добавляют необходимое количество активированного угля. Доводят объем загрузки до 1 л добавлением воды для инъекций и перемешивают до гомогенного состояния. Активированный уголь удаляют фильтрованием в стерильных условиях и раствор фильтруют через приемлемый, удерживающий бактерии фильтр. Фильтрат переносят в асептических условиях в безпирогенные закрытые сосуды, заполняют азотом, герметизируют и стерилизуют.

В вышеприведенный рецепт могут быть также введены пиросульфат натрия в качестве антиокислителя, а также метил-4-гидроксибензоат (1,3 мг/50 мг активного компонента) и пропил-4-гидроксибензоат (0,2 мг/50 мг активного компонента) в качестве антисептика.

Дозировка:
50 мг (единица)/1 мл
75 мг(единиц)/1,5 мл
100 мг (единиц)/2 мл
Пример 9. Приготовление высушенного вымораживанием порошка 1-N-этилгентамицина С_1a для инъекций
Рецептура - На инъекцию
Сульфат 1-N-этилгентамицина С_1a - 50 мг (единиц)
Хлорид натрия - 9 мг
Декстран (низкомолекулярный) - 7 мг
Пироcульфит натрия - 3 мг
Вода для инъекций - 0,5 мл
Методика. В подходящий сосуд загружают примерно 70% от всего количества воды для инъекций. Растворяют пиросульфит натрия ч.д.а.), хлорид натрия и сульфат 1-N-этилгентамицина _1a в указанном порядке и добавляют раствор низкомолекулярного декстрана. Добавлением воды для инъекций доводят раствор до конечного объема и перемешивают до однородного состояния. Раствор фильтруют дважды через удерживающий бактерии фильтр (фильтрующая мембрана с микропорами размером 0,22 мкм). В асептических условиях заполняют фильтратом (0,5-0,54 мл) безпирогенные ампулы, сушат вымораживанием и запаивают.

Пример 10. Приготовление таблеток 1-N-этилгентамицина С_1a (пролонгированного действия, всасывающихся кишечником)
Рецепт 1 - 100 мг (единиц) на таблетку на 100000 таблетoк
1-N-этилгентамицин С_1a (в виде сульфата) - 10 кг
Сахароза - 12,4 кг
Карбонат кальция - 6,8 кг
Крахмал - 5 кг
Лимонная кислота - 0,3 кг
Этанол (70%) - 8 л
Стеарат магния - 0,4 кг
Рецепт 2 - на 100000 таблеток
1-N-этилгентамицин C_1a (в виде сульфата) - 5 кг
Декстрин - 4,7 кг
20%-ная крахмальная паста - в необходимом количестве
Методика. Загруженные компоненты перемешивают до однородного состояния. Полученную взвесь сушат распылением. Добавляют зерновой крахмал и 1% (мас.) стеарата магния, перемешивают и прессуют в таблетки применением подходящего таблетирующего оборудования. Показания: дизентерия, энтерит и диарея бактериального происхождения.

Пример 11. Приготовление глазных капель, содержащих 1-N-этилгентамицин С_1a
Рецепт
1-N-этилгентамицин С_1a (в виде сульфата) - 5 г (единиц)
Хлорид натрия - 8 г
Пиросульфит натрия - 2 г
Дистиллированная вода - добавляют до 1000 мл
Методика. В подходящий сосуд для смешивания загружают 70% от всего количества дистиллированной воды. Добавляют хлорид натрия и пиросульфит натрия и перемешивают до полного растворения. Добавляют сульфат 1-N-этилгентамицина С_1a и вновь перемешивают до полного растворения. Добавлением 0,5 н. раствора гидроксида натрия устанавливают рН 7. Добавлением дистиллированной воды доводят раствор до конечного объема. Пропускают раствор через приемлемый стерилизующий фильтр. Полученным раствором заполняют подходящую стерильную бутылку для капель, герметизируют и стерилизуют. Показания: конъюктивит, острый эпидемический конъюктивит и т.п. бактериального происхождения.

Пример 12. Приготовление мазей, содержащих 1-N-этилгентамицин С_1a
Рецепт
1-N-этилгентамицин С_1a (в виде сульфата) - 1,6 г
Жидкий парафин - 3,3 г
Показания: абсцесс, пиодермит, жжение при мочеиспускании, ожоговые раны и иные кожные инфекции бактериального происхождения.

Пример 13. Приготовление аэрозолей, содержащих 1-N-этилгентамицин C_1a
Pецепт
1-N-этилгентамицин С_1a - 10 мг
Этанол - 4,5 мг
Дихлордифторметан - необходимое количество 14 мл/контейнер
Показания: трахеит, тонзиллит, ангина и т.п. бактериального происхождения.

Пример 14. Приготовление мазей (эмульсионная форма основы), содержащих 1-N-этилгентамицин С_1a
Рецепт 1 (эмульсия типа масло в воде в кач., основы)
1-N-этилгентамицин С_1a (в виде сульфата) - 1,6 г
Эмульгирующий воск - 30 г
Белый вазелин - 50 г
Жидкий парафин - 20 г
Рецепт 2 (основа: эмульсия типа вода в масле)
1-N-этилгентамицин С_1a (в виде сульфата) - 1,6 г
Полиглицеринстеарат - 6 г
Вазелин - 96,8 г
Рецепт 3 (водорастворимая, основа)
1-N-этилгентамицин С_1a (в виде сульфата) - 1,6 г
Желатин - 3 г
Глицерин - 3 г
Дистиллированная вода - необходимое количество конечная масса 100 г
В вышеприведенных примерах 8-14 для приготовления соответствующих препаратов вместо 1-N-этилгентамицина С_1a могут быть использованы в качестве активных компонентов 1-N-этилгентамицин С_2b, 1-N-этилгентамицин С₁ или 1-N-этилгентамицин С₂.

ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Преимущества настоящего изобретения очевидны. Мутант Micromonospora echinospora CGMCC 0197 настоящего изобретения способен продуцировать гентамицин С_1a в количестве, превышающем 800 мкг на мл бульона. Таким образом, настоящим изобретением дается биосинтетический способ получения ГМС_1a путем мутации гена. Мутант Micromonospora echinospora CGMCC 0197 обладает высокой продуцирующей способностью. Т.е. мутант может быть непосредственно использован для создания исходного ядра, применяемого для синтеза способом изобретения 1-N-этилгентамицина С_1a. Получаемые по изобретению производные гентамицина или их соли, а также препараты, содержащие их в качестве активных компонентов в смеси с фармацевтически приемлемыми добавками, являются антибиотиками широкого спектра действия. Если более конкретно, то 1-N-этилгентамицин проявляет активность против устойчивых к гентамицину штаммов при низкой ототоксичности и нефротоксичности. 1-N-этилгентамицин С_1a пригоден для лечения септицемии, бронхита, бронхоэктаза, пневмонии, перитонита, пиелонефрита, цистита, вызываемых такими чувствительными к лекарственному средству бактериями, как P.aeurginosa, вида proteum, serratia и такими устойчивыми к гентамицину (ГМ), канамицину (КМ), метициллину, амикацину (АМК) бактериями, как Еscherichia coli, Klebsiella, Staphylococcus. Кроме того, 1-N-этилгентамицин С_1a показан больным с аллергией на пенициллин, особенно престарелым людям и детям. Он безопаснее гентамицина, канамицина и амикацина. Ему следует отдать предпочтение при лечении инфекций, возбудителями которых являются штаммы с устойчивостью к ГМ, КМ, микрономицину (МКР) и метициллину. 1-N-этилгентамицин С_1a не показывает перекрестной резистентности с АМК, вследствие чего может применяться для лечения инфекций, вызываемых АМК-устойчивыми бактериями.

Изучение in vitro антибактериального и бактерицидного действия 1-N-этилгентамицина С_1a, проведенное на 1108 обычных патогенных бактериях, показывает, что по своей антибактериальной активности 1-N-этилгентамицин С_1a аналогичен или превосходит гентамицин. Величины МИК в половину или более, чем половину от величины для ГМ-устойчивых, МКР-устойчивых и кафазолин-устойчивых штаммов охватываются интервалом эффективных концентраций в сыворотке. В частности, в концентрации 8 мг/л или ниже 1-N-этилгентамицин С_1a способен подавить 66% 53 высокоустойчивых штаммов S.auеrus. Таким образом, 1-N-этилгентамицин С_1a настоящего изобретения усиливает активность против метициллин-устойчивых S.auеrus (МRSА) (см. таблицы 4-7).

In vivo 1-N-этилгентамицин С_1a оказывает хорошее лечебное действие на инфицированных бактериями мышей. Его защитное действие in vivo аналогично действию АМК, но превосходит действие ГМ и тобрамицина, правда, ниже действия 1-N-этилсисомицина. Лечебное действие in vivo на мышей, инфицированных ГМ-устойчивыми штаммами, в 2-5 раз превосходит действие АМК, ГМ и тобрамицина.

Лечебное действие 1-N-этилгентамицина С_1a настоящего изобретения нa инфицированных мышей отличаемся хорошей воспроизводимостью. Так, исследования, проведенные на крови сердца выживших мышей, показывают, что 1-N-этилгентамицин С_1a характеризуется хорошим коэффициентом отрицательного оборота, т.е. соединение обладает высокой ингибирующей активностью и бактерицидной активностью in vivo, которая аналогична тем же проявлениям активности in vitro.

Результаты токсикологических исследований для 1-N-этилгентамицина С_1a.

1. Острая токсичность 1-N-этилгентамицина С_1a
Значения ЛД₅₀ для 1-N-этилгентамицина, вводимого в.в., п.к., в.м. мышам Кунминг, составляют соответственно 65,47, 479,91, 172,89 мг/кг. Для NIН мышей ЛД₅₀ при введении в. в., п.к. составляет соответственно 79,88 мг/кг, 460,42 мг/кг. Острая токсичность 1-N-этилгентамицина _1a ниже, чем у нетилмицина и аналогична острой токсичности ГМ.

В опытах на крысах-ЛД₅₀ для 1-N-этилгентамицина С_1a при его введении в. в. , п. к. , в.м. и в.б. составляют соответственно 73,75, 402,65, 565,16 и 627,98 мг/кг.

2. Хроническая токсичность 1-N-этилгентамицина С_Ca
Для выявления безопасности постоянного введения 1-N-этилгентамицина С_1a определяют его токсичность на крысах в.б. в течение 90 дней и на собаках из породы гончих после введения в.в. в течение 90 дней.

В данном исследовании 1-N-этилгентамицин С_1a вводят крысам в.б. в дозах 30, 100 и 180 мг/кг/день (МКД), которые оценивают, как низкая, средняя и высокая дoзы соответственно. Проводят физиологические наблюдения, гематологические и патологические исследования. Результаты проведенного исследования показывают, что дозировки 1-N-этилгентамицина С_1a, при которых тот показывает явную интоксикацию и общую безопасность, равны 100 МКД и 30 МКД соответственно, по сравнению с 63 МКД и 25 МКД для МКР. Таким образом, хроническая токсичность 1-N-этилгентамицина С_1a не превышает хронической токсичности МКР.

Трем группам гончих вводят внутривенно в течение 90 дней соответственно 10, 30 и 60 МКД. Полученные результаты сравнивают с литературными данными МКР. Помимо трех вышеуказанных компонентов наблюдений исследуют также глазное дно. Результаты для 1-N-этилгентамицина С_1a, вводимого 90 дней в.в., аналогичны результатам для МКР при его введении в.в. в течение 30 дней. Таким образом, при клинических испытаниях 1-N-этилгентамицина С_1a полезным ориентиром могут служить клинические дозировки для МКР.

3. Ототоксичность
Для выявления ототоксичности 1-N-этилгентамицина С_1a, ГМ и КМ применяют модель с реакцией наружного уха на крысах и тест-модель на плавающих мышах. Полученные результаты показывают, что ототоксичность гентамицина гораздо ниже ототоксичности ГМ и КМ.

Сравнение ототоксичности 1-N-этилгентамицина С_1a с ототоксичностью ГМ и АМК в опытах на морских свинках. В этих опытах проверялись три уровня дозировок, которые вводились в каждой группе внутримышечно раз в день в течение 28 дней. В ходе экспериментов определяются слуховая способность и функционирование преддверия. На следующий день после последней инъекции морских свинок обезглавливают и проводят определение слуховой способности и функционирования преддверия. Височную кость фиксируют с получением образца внутреннего уха и препарата всей поверхности улитки, подсчитывают число омертвевших волосковых сенсорных клеток и с помощью электронного сканирующего микроскопа наблюдают морфологию образцов.

Результаты опытов состоят в следующем:
(1) Токсичность для улитки. При сравнении с контрольной группой морских свинок, которым вводился физиологический солевой раствор, для 1-N-этилгентамицина С_1a при всех трех дозировках никакого видимого токсичного действия на улитку не наблюдалось. В случае же гентамицина и амикацина повышение АВР-порога наблюдалось при средних дозировках, а при высоких дозировках у животных происходила потеря почти всех слуховых функций. В группе, получавшей 1-N-этилгентамицин С_1a, никаких изменений в морфологии волосковых клеток животных не происходило, спиральные нервы нормальны. Даже при дозировке 100 мг/кг/день кортиевы органы остаются нормальными. Никакой токсичности для улитки в случае 1-N-этилгентамицина С_1a, применяемого в интервале дозировок данного опыта, не наблюдалось. В группах животных, получавших гентамицин и амикацин, токсичное действие на улитку наблюдалось при всех трех дозировках. Даже при низких и средних дозировках наблюдалось рассеяние омертвевших волосковых сенсорных клеток и образование шрамов. При высокой дозировке наблюдается большое количество омертвевших волосковых клеток и даже поддерживающих и нервных клеток. Таким образом, 1-N-этилгентамицин С_1a обладает низкой токсичностью по отношению к улитке, в то время как гентамицин и амикацин вызывают заметное ее повреждение.

(2) Токсичное действие на преддверие. Все три лекарственных средства создают отличия по сравнению с контрольной группой. В группе животных, которым вводился 1-N-этилгентамицин С_1a, только при больших дозировках наблюдается повышение коэффициента ингибирования нистагмического ритма, слипание друг с другом статических волосковых клеток в пятне эллипсоидного узла и гребенчатых пузырьков, но коллоидные мембраны остаются незатронутыми. В группах животных, которым вводился ГМ или АМК, функции преддверия оказываются нарушенными и морфология - затронутой, а при высоких дозировках коллоидные мембраны и статические волосковые клетки в центре пятна эллипсоидного узла исчезают, а немногие оставшиеся волосковые клетки слипаются друг с другом. Происходит убывание или затемнение отолита, волосковые клетки в пятне шарового узла оказываются неполными или исчезают. Таким образом, 1-N-этилгентамицин С_1a проявляет самую низкую, КМ - среднюю и ГМ - самую высокую токсичность в отношении преддверия.

С учетом вышеизложенного можно считать, что 1-N-этилгентамицин С_1a проявляет очень низкую ототоксичность.

3. Нефротоксичность 1-N-гентамицина
1-N-гентамицин С_1a относится в аминогликозидным антибиотикам, для которых почка является одним из целевых органов проявления токсичности. При сравнении нефротоксичности 1-N-этилгентамицина С_1a, АМК и ГМ, вводимых крысам внутримышечно, учитывались шесть показателей для мочи и два биохимических показателя крови в сочетании с наблюдениями за патологией и морфологией почки. Во всех трех испытуемых группах число нормальных показателей возрастает и патологические изменения ухудшаются с увеличением интервала доз и дозировок. Начиная с седьмого дня от начала введения число мертвых животных в группах, где вводится 100 МКД и 150 МКД гентамицина, постепенно увеличивается, при отсутствии мертвых в группах животных, которым вводится 1-N-этилгентамицин С_1a и амикацин. В связи с этим сравнение нефротоксичности трех лекарственных средств может быть проведено только при низкой дозировке в 50 МКД. В группе животных, которым 5-15 дней вводится доза гентамицина в 50 МКД, происходит увеличение числа ненормальных показателей с трех (LU-LDH, U-Pr, BUN) до шести (LU-GОТ, U-LDH, U-Pr, U-Su, BUM, Scr). Некроз также увеличивается от единичного рассеянного некроза эпителиальных клеток почечных канальцев после 5 дней введения до расширенного серьезного некроза почки. В группах животных, которым в той же дозировке инъектировался 1-N-этилгентамицин С_1a или АМК, только отдельные показатели дают статистические отклонения от нормы или показывают небольшое увеличение. Что касается морфологии, то повреждения менялись от легкого денатурирования до единичного рассеянного некроза клеток. На основании результатов сравнения морфологии и функционирования почек нефротоксичность 1-N-этилгентамицина _1a оценена, как гораздо более низкая, чем у гентамицина и идентичная нефротоксичности АМК.

4. Тест Эймса оказался для 1-N-этилгентамицина С_1a отрицательным, и изучение репродукционной токсичности показало отсутствие у 1-N-этилгентамицина эмбриотоксичности. Изучение фармакокинетики и распределения 1-N-этилгентамицина С_1a в органах животных указывает на его быструю абсорбируемость и на короткий период полураспада. Концентрация лекарства в сыворотке крови возрастает с увеличением дозировки. Выводится 1-N-этилгентамицин С_1a в основном через почки. Высокая концентрация 1-N-этилгентамицина С_1a выявлена в почках, в несколько более низких концентрациях он обнаружен в легких, сердце и селезенке. Следует отметить, что 1-N-этилгентамицин С_1a, как найдено, более легко, чем ГМ, проникает в церебральные ткани. Это делает 1-N-этилгентамицин С_1a клинически более приемлемым. Степень его связывания с белком сыворотки крови низка.

Вышеприведенные примеры даны лишь с целью пояснить изобретение. Объем защиты настоящего изобретения определяется формулой изобретения.

Формула изобретения

Антибактериальная композиция, содержащая в качестве активного компонента полусинтетический 1-N-этилгентамицин С_1а или его соли, в которой указанный полусинтетический 1-N-этилгентамицин С_1а получен в результате следующих стадий: а) получение гентамицина С_1а при ферментации мутантного штамма Micromonospora echinospora CGMCC-0197 и выделение его из ферментационного бульона; б) селективное этилирование аминогруппы в положении 1 гентамицина С_1а, полученного на стадии (а), и выделение полученного 1-N-этилгентамицина С_1а, и фармацевтически приемлемый носитель.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19