Способ контроля антиокислительной активности профилактических и лечебных антиоксидантных средств

 

Изобретение относится к медицине. В способе в качестве субстрата окисления используют полиненасыщенные жирные кислоты кукурузного масла, в которое перед инкубацией вводят антиоксидантный препарат и воздействуют инициаторами окисления в течение определенного промежутка времени в стандартных условиях с последующим комплексным определением антиоксидантной активности препаратов спектрофотометрически и хемилюминесцентно по количеству образовавшихся продуктов перекисного окисления липидов, выражая ее в убихиноновых единицах, при этом антиокислительная активность обратно пропорциональна уровню продуктов перекисного окисления липидов. Способ позволяет стандартизировать оценку результатов, а также использовать доступный субстрат окисления.

Изобретение относится к медицине и фармации и может быть использовано для комплексного экспресс-тестирования фармакологических препаратов, пищевых добавок и биологических жидкостей на предмет их антиокислительной активности.

В связи с расширением рынка биодобавок и фармпрепаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, становится актуальной задача сравнительного изучения их антиокислительной активности (АОА) в тест-системах с применением различных методов регистрации. В современной литературе приводятся данные клинического и экспериментального обоснования антиоксидантных свойств разнообразных природных и синтетических веществ, а также лекарственных средств, обладающих помимо своего базисного (лечебного) эффекта и антиоксидантными свойствами. Проблема лечения многих заболеваний связана с восстановлением нарушенных функций систем специфической и неспецифической защиты. Немаловажная роль в защитных механизмах принадлежит антиоксидантной системе (АОС), так как в настоящее время установлено, что нарушение ее нормального функционирования приводит к усиленному образованию в тканях и биологических жидкостях организма реактивных оксигенных радикалов или активных форм кислорода (АФК), обладающих выраженной цитотоксичностью. Для коррекции АОС в профилактической и практической медицине используют разнообразные фармпрепараты и пищевые биодобавки отечественного и зарубежного производства. У одних препаратов антиоксидантный эффект является основным, у других сопутствующим другим лечебным свойствам (противовоспалительным, иммуномоделирующим, гепатопротекторным и т.д.). Широкая реклама современных антиоксидантных средств, зачастую дорогостоящих, ставит задачи по разработке эффективных и простых способов определения и контроля их антиокислительной активности в универсальных единицах.

Известен способ "Определения общей антиокислительной активности (АОА) плазмы крови и ликвора" (Е.Б. Спектр, А.А. Ананенко, Л.Н. Политова. // Лаб. дело. -1984. - 1. -С.26-28). Принцип метода заключается в оценке АОА исследуемой жидкости посредством определения ее ингибирующего действия на свободно-радикальное окисление мембран эритроцитов, в которых окисление индуцируется УФ-светом.

Недостатки: а) использование субстрата (мембраны эритроцитов), требующее особого трудоемкого приготовления - материал для модельной системы при каждом его приготовлении имеет разные исходные параметры; б) инкубация однократная - 30 минут; в) оценка продуктов перекисного окисления только при волне 532 нм; г) трудно получить тест-систему в стандартном виде, так как при хранении этой модельной системы начальный уровень продуктов ПОЛ и их АОА постоянно изменяются.

За прототип нами принят способ "Модификация метода определения суммарной антиоксидантной активности крови" (М.Ш. Промыслов, М.Л. Демчук. // Вопросы медицинской химии. -1996. -Т.36. - 4. -С.90-92).

Способ заключается в оценке АОА исследуемой жидкости посредством определения ее ингибирующего действия на свободно-радикальное окисление в модельной системе с линоленовой кислотой, в которой окисление индуцируется FeSO₄.

Недостатки: а) неоднородность и малая устойчивость эмульсии этой кислоты в растворе, в результате чего получается значительный разброс данных; б) использование малодоступного субстрата окисления; в) использование линолеата ограничивает возможность изучения процессов перекисного окисления других ненасыщенных жирных кислот, которые встречаются в природных субстратах (фосфолипиды плазмы, клеточные мембраны), г) низкая достоверность способа относительно природных биосубстратов перекисного окисления.

Задача - создание достоверного, легко воспроизводимого, дешевого, не требующего сложного оборудования способа контроля антиокислительной активности фармпрепаратов и пищевых биодобавок, используемых с профилактической и лечебной целью. Для решения этой задачи необходимы: 1) разработка адекватной тест-системы, сочетающей рациональные начала природных искусственных тест-систем; 2) использование нескольких инициаторов ПОЛ, которые присутствуют в биосистемах и в определенных условиях запускают свободнорадикальные цепные химические реакции; 3) разработка универсального стандарта оценки полученных результатов; 4) создание специализированной компьютерной программы для математической и статистической обработки полученных результатов.

Сущность изобретения состоит в том, что оценка антиоксидантных свойств биопрепаратов и биологических жидкостей базируется на предварительной индукции ПОЛ в авторских тест-системах УФО/Fe₂+ (пролонгированное воздействие физического и химического инициатора ПОЛ) и Н₂O₂/Fe₂+ (одномоментное разовое внесение химических инициаторов ПОЛ) и последующему определению степени ингибирования окисления субстратов по количеству промежуточных и минорных продуктов ПОЛ спектрофотометрическими и хемилюминесцентными методами.

Используемый субстрат более доступен и удобен при хранении, не требует особого приготовления, обеспечивается комплексная динамическая оценка пролонгированного и единовременного антиоксидантного эффекта фармпрепаратов, дополнительная оценка свободных радикалов люминолзависимым хемилюминесцентным методом; дополнительная регистрация промежуточных продуктов перекисного окисления липидов, а также анализ соотношения их и минорных метаболитов ПОЛ.

Способ осуществляется следующим образом.

А) Готовят 10 (Х)% раствор фармпрепарата и водно-спиртово-масляную смесь (ВСМ=800 мкл масла в 3 мл спирта на 100 мл воды), затем в центрифужной пробирке готовят реакционную смесь - 2 мл ВСМ + 100 мкл фармпрепарата + 200 мкл FeSO₄ + 10 мкл Н₂О₂, которую термостатируют при t=37^oС, τ=60 (15-30-45-60-75) мин. После инкубации добавляют 1 мл 28% ТХУК и центрифугируют 10 мин - 3000 об/мин. В большую пробирку отбирают 2 мл супернатанта и вносят также 1 мл 1% раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК), затем термостатируют на кипящей бане - 15 мин. Оптическую плотность раствора измеряют на SF-46 при длине волны 450 и 532 нм.

Б) Готовят 10 (Х)% раствор фармпрепарата и водно-спиртово-масляную смесь (ВСМ=800 мкл масла в 3 мл спирта на 100 мл воды). Из вышеназванных реагентов готовят в тигельках реакционную смесь - 2 мл ВСМ + 100 мкл фармпрепарата + 200 мкл FeSO₄, которую инкубируют под БУВ-15 (УФО) при h=150-200 мм в течение 150 (90-120-150-180) мин. После инкубации переносят количественно в центрифужные пробирки, добавить 1 мл 28% ТХУК и центрифугируют 10 мин - 6000 об/мин. В большую пробирку отбирают 2 мл супернатанта и вносят также 1 мл 1% раствора ТБК, затем термостатируют на кипящей бане - 15 мин. Оптическую плотность раствора измеряют на SF-46 при длине волны 450 и 532 нм.

В) Проводят хемилюминесцентный анализ интенсивности индуцированного перекисного окисления в присутствии исследуемых фармпрепаратов и биодобавок и без них.

Конечные результаты получают после обработки данных спектрофотометрического и хемилюминесцентного анализа специализированной компьютерной программой.

Обоснование достигнутых результатов. Проведены сравнительные исследования антиокислительной активности различных фармпрепаратов, относящихся к типичным антиоксидантам (Thioctacid-600Т - в описанную выше тест-систему добавляли 100 мкл препарата и инкубировали в стандартных условиях; убихинон - в описанную выше тест-систему добавляли 100 мкл рабочего раствора препарата, приготовленного путем растворения 1 капсулы убихинона в 10 мл дистиллированной воды, и инкубировали в стандартных условиях; аскорбиновая кислота - в описанную выше тест-систему добавляли 100 мкл рабочего раствора препарата, приготовленного путем растворения 1 капсулы аскорбиновой кислоты в 10 мл дистиллированной воды, и инкубировали в стандартных условиях), и не относящихся к таковым (диабетон - в описанную выше тест-систему добавляли 100 мкл рабочего раствора препарата, приготовленного путем растворения 6 таблеток диабетона в 10 мл дистиллированной воды, и инкубировали в стандартных условиях). В ходе исследований выявлено, что в тест-системе УФО/Fe₂+ Thioctacid-600Т ингибирует ПОЛ на 69%, аскорбиновая кислота - на 55%, убихинон - на 11%, диабетон - на 5%; в тест-системе Н₂O₂/Fe₂+ Thioctacid-600Т ингибирует ПОЛ на 59%, аскорбиновая кислота - на 16%, убихинон - на 15%, диабетон - на 6%. Антиокислительная активность убихинона во всех тест-системах была принята равной 100% или 1,0 убихиноновой единице. Проанализировано количественное соотношение образующихся продуктов окисления, характеризующих выраженность пролонгированного действия антиокислительных препаратов, рассчитываемое как коэффициент отношения оптической плотности при 450 нм (промежуточные продукты) и 532 нм (минорные продукты), который составил для Thioctacid-600Т 1,9 и 1,6; аскорбиновой кислоты - 1,4 и 1,0; убихинона 1,0 и 1,0; диабетона - 2,4 и 2,0 в тест-системах УФО/Fe₂+ и Н₂O₂/Fe₂+ соответственно.

Данное изобретение позволяет: 1. В качестве тест-системы использовать легкодоступный (в отличие от линоленовой кислоты), не требующий особого и трудоемкого приготовления (в отличие от мембран эритроцитов) окисляемый субстрат - кукурузное масло.

2. Стандартизировать оценку полученных результатов относительно антиокислительной активности убихинона (количество ТБК-реактивных продуктов в тест-системе при наличии убихинона принято за 100% и измеряется в убихиноновых единицах).

3. Проводить комплексную оценку анти-/прооксидантных свойств фармакологических препаратов и пищевых добавок по количеству промежуточных и минорных продуктов перекисного окисления липидов.

Медико-социальный эффект обеспечивается за счет использования более доступного, дешевого, удобного при хранении, не требующего особых условий приготовления субстрата окисления, адекватно показывающего уровень антиокислительной активности фармпрепаратов и биологически активных добавок.

Формула изобретения

Способ контроля антиокислительной активности лечебных и профилактических антиоксидантных препаратов, включающий инкубацию окисляемого субстрата и последующее инициирование перекисного окисления липидов в нем путем ультрафиолетового облучения и внесения ионов двухвалентного железа или ионов двухвалентного железа и перекиси водорода, отличающийся тем, что в качестве субстрата окисления используют полиненасыщенные жирные кислоты кукурузного масла, в которое перед инкубацией вводят антиоксидантный препарат и воздействуют инициаторами окисления в течение определенного промежутка времени в стандартных условиях с последующим комплексным определением антиокислительной активности препаратов спектрофотометрически и хемилюминесцентно по количеству образовавшихся продуктов перекисного окисления липидов, выражая ее в убихиноновых единицах, при этом антиокислительная активность обратно пропорциональна уровню продуктов перекисного окисления липидов.