Модифицированные нуклеозид-5'-трифосфаты как антивирусные агенты

 

Описываются новые модифицированные нуклеозид-5'-трифосфаты общей формулы: R'''-P(= O)OH-CXX''-P(= O)OH-O-P(= O)OH-CH₂-A-B, где В=тимин, аденин, урацил или 5-этилурацил; А имеет формулу (I), R'=Н или N₃, R''=H или R и R''' вместе образуют двойную связь; Z=O или СН₂; R'''=Ph, OAlkyl, Oph, NHPh; X'= X''= Br, F; или Х'=H, a X''=Br. Новые соединения являются антивирусными агентами, в частности, они способны ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека в культуре лимфоцитов человека.

3 табл.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии, а точнее к новым соединениям, модифицированным по P-α, β, γ и сахарному остаткам нуклеозид-5'-трифосфатам D- и L-рядов.

Новые соединения являются терминаторными субстратами обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и ингибиторами репродукции ВИЧ в культуре лимфоцитов человека, а также обладают способностью предохранять от инфицирования здоровые клетки. Кроме того, заявленные соединения являются специфическими ингибиторами вируса гепатита В в культуре гепатоцитов человека, вирусов группы герпеса в различных клеточных культурах, а также обратных транскриптаз ретровирусов, гепаднавирусов и ДНК-полимераз вирусов группы герпеса.

В настоящее время известны различные соединения, подавляющие репродукцию вируса иммунодефицита человека. Наиболее эффективным из известных соединений является 3'-азидо-3'-дезокситимидин (AZT), находящий применение в медицинской практике (Mitsuya H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 7096-7100; Mitsuya H. , Broder S. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 1911-1915). Молекулярный механизм действия указанного соединения включает диффузию его внутрь клетки, инфицированной ВИЧ. Далее он подвергается трифосфорилированию и специфично блокирует синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ. Аналогичным образом действуют другие противовирусные нуклеозиды, применяемые в медицинской практике для лечения СПИД: 2',3'-дидезоксицитидин (Mitsuya H., Broder S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 1911-1915), 2', 3'-дидезоксиинозин (там же), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (Herdewijn P. et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 1270-1278; Baba M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 142, 128-134) и 2',3'-дидезокси-3'-тиотимидин (Soudeyns H. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1991, 35, 1386-1390). Однако фосфорилирование модифицированных нуклеозидов клеточными ферментами происходит значительно менее эффективно, чем природных нуклеозидов. Процесс превращения нуклеозида в организме человека в соответствующий 5'-трифосфат занимает около 1,5-2 часов. За это время проникший в клетки вирус успевает в форме провирусной ДНК интегрировать в геном человека. Использование в качестве лекарственных препаратов нуклеозид-5'-трифосфатов с немодифицированной трифосфатной частью невозможно из-за их низкой стабильности к действию ферментов гидролиза и вследствие этого низкой способности проникать внутрь клетки. Таким образом, применяемые препараты, даже если они приняты в момент инфицирования, не могут предохранить от заражения ВИЧ. В качестве противовирусного препарата было предложено использовать производные 3'-азидо-3'-дезокситимидина, содержащие модифицированную фосфатную группу в 5'-положении, а именно Н-фосфонат AZT (Н.Б. Тарусова, и др., Мол. Биол. , 1989, 23, 6, 1716-1724; Патент США 5043437). Однако было показано, что в организме это соединение в основном подвергается дефосфорилированию, превращаясь в AZT (Кузнецова Е.В. и др., Мол. Биол., 1995, 29, 2, 415-420).

В основу изобретения положена задача создания новых нуклеозид-5'-трифосфатов, которые устойчивы к действию ферментов дефосфорилирования, способны проникать внутрь клетки и обладают избирательной активностью в подавлении биосинтеза ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ.

Задача решена тем, что согласно изобретению заявляются новые соединения - P-α, β, γ модифицированные 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты, общей формулы: где В=тимин, аденин, урацил или 5-этилурацил R'=H или N₃; R''=Н или R' и R'' вместе образуют двойную связь; Z=O или СН₂; R'''=Ph, OAlkyl, OPh, NHPh; X'=X''=Br, F или X'=H, a X''=Br.

Новые соединения получают путем активации соответствующим образом модифицированного мононуклеотида с помощью N,N'-карбонилдиимидазола и последующей его конденсации с модифицированным трифосфтатом.

Структура заявленных соединений подтверждена методами УФ-, ЯМР- и массспектрометрии.

Пример 1. 5'-(γ-Фениламидо-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидин. (Соединение I, В=Thy, R'=N₃, R''=H, Z=O, R'''=NHPh, X'=X''=Br).

К раствору 0,5 ммоль 3'-азидо-2',3'-дидезокси-4'-нортимидин-4'-норфосфоната в 10 мл ДМФА прибавляют 162 мг (1 ммоль) N,N'-карбонилдиимдазола, перемешивают 2 часа при 20^oС, приливают 1 мл метанола, оставляют на 30 мин и упаривают досуха, к остатку прибавляют 1 ммоль γ-фениламида дибромметилендифосфоната бистрибутиламмониевой соли, перемешивают 3 час, а при 20^oС, приливают 200 мл воды и наносят на колонку (20•2,5 см) с Toyopeari DEAE (НСО₃ ^-). Элюцию проводят линейным градиентом буфера NH₄HCO₃, рН 7,5 (0->0,4 М, общий объем 600 мл) с УФ-контролем. Фракции с веществом лиофилизуют, остаток растворяют в 1 мл воды и наносят на колонку (20•1,5 см) с LichroPrep RP18. Элюцию проводят водой с УФ-контролем. Раствор, содержащий вещество, лиофилизуют, выход 0,26 ммоль, 52%. УФ-спектр (вода) λ_max266 nm (ε9600), ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м. д.): 7.64 m (2Н, Ph), 7.32 m (3H, arom), 7.60 s (1H, H-6); 6.30 m (1H, Н-1'); 5.52 s (1-H, H-4'); 4.46 m (1-H, H-3'); 3.64 d (2H, j_СH, _P=8.5 Гц, ); 2,44 m (1H, H-2'); 1.92 s (3H, СН₃-Thy); 1.86 d (3H, J_H,P'=17.9Гц, СН₃РО); ³¹P ЯМР спектр (D₂O, d, м.д.):9,58 д (α-P, J_α-β = 33,0 Гц), 8.16 д (γ-P, J_β-γ = 13,85 Гц), 0,10 м (β-P) FAB-масс, m/z: 735 (М⁺+Н), 752 (М⁺+Н+NН₃)
Пример2.5'-(γ-Метил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидин. (Соединение 2, B=Thy, R'=N₃, R''=H, Z=O, R'''=OMe, X'=X''=Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидина и бис(трибутиламмонийной) соли метилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 0,34 ммоль, 68%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε9600), ¹H -ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.60 м (1H, H-6); 6.30 м (1H, Н-1'); 5.60 м (1-H, H-4'); 4.38 м (1H, H-3'); 3.64 д (2H, J_CH, _P= 8.5 Hz, ); 3.36 (3H, ОМе); 2.39 м (1H, H-3'); 1.92 с (3H, Me), . ³¹P ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 10,87 д (α-P, J_α-β = 35,0 Гц), 8,46 д (γ-P, J_β-γ = 14,95 Гц), -0,12 м (β-P). FAB-масс, m/z: 679 (М⁺+1).

Пример3.5'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидин (Соединение 3, B=Thy, R'=H, R''=H, Z= O, R'''=OPh, X'=X''=Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-3'-азидо-3'-дезокситимидина и бис(трибутиламмонийной) соли фенилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 0.34 ммоль, 68%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε9600), ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.68 m (2H, Ph), 7.32 m (3H, Ph), 7.60 с (1Н, Н-6); 6.30 м (1H, Н-1'); 5.46 м (1-H, H-4'); 4.60 м (1-H, Н-3'); 3.91 д (2H, J_CH,P=8,5 Гц, ); 2.28 м (1H, Н-2'); 1.94 с (3H, СН₃). ³¹P ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 11,67 д (α-P, J_α-β = 33,56 Гц), 8,43 д (γ-P, J_β-γ = 14,08 Гц), 0,05 м (β-P) FAB-масс, m/z: 741 (М⁺+Н), 758 (M⁺+H+NH₃).

Пример4.5'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-2', 3'-дидезоксиуридин (Соединение 4, B=Ura, R'=N₃, R''= H, Z=O, R'''=OPh, X'=X''=Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-3'-азидо-2', 3'-дидезоксиуридина и бис(трибутиламмонийной) соли фенилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 0.34 ммоль, 68%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε9600), ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.60 д (1H, J= 8 Гц, Н-6); 7.68 м (2H, arom); 7.32 м (3H, Ph); 6.22 м (1H, Н-1'); 5.80 д (1H, J=8 Гц, Н-5); 5.28 м (1H, H-4'); 4.50 м (1-H, Н-3'); 3.64 д (2H, j_CH,P= 8.5 Гц, ); 2.22 м (1H, Н-2');. ³¹Р ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 9,24 д (α-P, J_α-β = 30,19 Гц), 8,86 д (γ-P, J_β-γ = 13,87 Гц), 0,23 м (β-P) FAB-масс, m/z: 728 (M⁺+H).

Пример5.5'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-3'-азидо-2',3'-дидезокси-5-этилуридин (Соединение 5, В=5-этилурацил, R'=N₃, R''=H, Z=O, R'''=OPh, X'=X''=Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-3'-азидо-2', 3'-дидезокси-5-этилиуридина и бис-(трибутил-аммонийной) соли фенилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 38%. УФ-спектр (вода) λ_max272 nm (ε12400). ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.72 д (1Н, J=7.5 Гц, Н-6); 7.68 м (2Н, arom), 7.32 м (3Н, Ph), 6.23 м (1Н, Н-1'); 5.68 д (1Н, J=7.5 Гц, Н-5); 5.50 м (1-Н, Н-4') 4.46 м (1-Н, Н-3'); 2,55 м (2Н, СH₂-СН₃), 2.42 м (1Н, Н-2'), 1.37 м (3Н, СН₂-СH₃). ³¹P ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 12,34 д (α-P, J_α-β = 36,5 Гц), 9,13 д (γ-P, J_β-γ = 14,15 Гц), 0,05 м (β-P) FAB-масс, m/z: 749 (М⁺+Н).

Пример6.5'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-2', 3'-дидезоксиаденозин (Соединение 6, B= Ade, R'=R''=H, Z=O, R'''=PhO, X'=X''=Br).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из N-защищенного 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-2', 3'-дидезоксиаденозина и бис(трибутилам-монийной) соли фенилового эфира дибромметилендифосфоновой кислоты. Выход 0,32 ммол, 64%. УФ-спектр (вода) λ_max260 nm (ε15000), ¹Н-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 8.30 с (1Н, Н-2); 8.09 с (1Н, Н-8); 7.68 m (2Н, arom), 7.32 m (3Н, Ph), 6.33 м (1Н, Н-1'); 5,36 м (1Н, Н-4'); 3.56 д (2Н, J=9,0 Гц, CH₂-P), 2,6-2,3 (4Н, Н-3', Н-2'). ³¹Р ЯМР спектр (D₂О, δ, м.д.): 11,82 д (α-P, J_α-β = 34,5 Гц), 8.59 д (γ-P, J_β-γ = 13,90 Гц), -0.11 м (β-P) FAB-масс, m/z: 707 (М⁺+Н), 724 (M⁺+H+NH₃).

Пример7.5'-(γ-Фенил-β, γ-дифторметилендифосфонил-α-фосфонилметил)-5'-дезоксиметил-2',3'-дидезокситимидин (Соединение 7, B=Thy, R'=R''=H, Z=O, R'''= PhO, X'=X''=F).

Синтез проводят по методике примера 1 исходя из 5'-фосфонилметил-5'-дезоксиметил-2', 3'-дидезокситимидина и бис(трибутиламмонийной) соли фенилового эфира дифторметилендифосфоновой кислоты. Выход 0,16 ммол, 32%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε9600). ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.62 м (2Н, arom), 7.56 м (1Н, Н-6),
7.32 м (3Н, Ph), 6.04 т (1Н, J=6.5 Гц, Н-1'); 6.24 м (1-Н, Н-1'); 5.18 м (1H, Н-4'); 3.64 д (2Н, J=9,0 Гц, CH₂-P), 2.6-2.2 м (4Н, Н-3', Н-2'); 1.98 с (3Н, ). ³¹P ЯМР спектр (D₂O, δ, м.д.): 12,08 д (α-P, J_α-β = 34,5 Гц), 6,26 д (γ-P, J_β-γ = 13,86 Гц), -1,81 м (β-P). FAB-масс, m/z: 572 (М⁺+Н), 589 (M⁺+H+NH₃).

Пример 8. 2',3'-Дидезокси-4'-нор-4'-(γ-фенилβ, γ-дибромметилендифосфонил-α-фосфонилметил-L-карбоаденозин (Соединение 8, B=Ade, R'=R''=H, Z=CH₂, R'''=Ph, X'=X''=Br).

Синтез проводят по методике примера 1. Выход 0,33 ммоль, 66%. УФ-спектр (вода) λ_max268 nm (ε14600), ¹H ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 8.59 с (1Н, Н-2); 8.30 с (1Н, Н-8); 7.82 м (2Н, arom), 7.32 m (3Н, Ph), 4.95 т (1Н, J=6.5 Гц, Н-1'); 3.58 д (2Н, J=8,5 Гц, СН₂-Р), 2.8-2.5 м (3Н, Н-3', H-5ʹα); 2.3-2.1 м (2Н, Н-2'); 1.92 м (1Н, H-5ʹβ). ³¹Р-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 11.82 д (α-P, J_α-β = 32,25 Гц); 0.26 м (β-P, Гц); 7.80 д (γ-P, J_β-γ = 15,18 Гц). FAB-масс, m/z: 576 (М⁺+Н).

Пример9.4'-(γ-Фенил-β, γ-дибромметилендифосфонил-α-метиленфосфонил)-2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-4'-нор-L-карбоаденозин (Соединение 9, B=Ade, R' и R'' образуют двойную связь, Z=CH₂, R'''=OPh, X'=X''=Br).

Синтез проводят по методике, аналогичной методике примера 1, исходя из 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-4'-нор-L-карбоаденозин-4'--α--метиленфосфоната и дибромметилендифосфоната бис(трибутиламмониевой) соли. Выход 58%.

УФ-спектр (вода) λ_max262 nm (ε14200). ¹H ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 8.18 с (1Н, Н-2); 8.16 с (1Н, Н-8); 7.68 м (2Н, Ph), 7.32 м (3Н, Ph), 6.13 м (1-Н, Н-3'); 5.92 м (1Н, Н-2'); 5.39 м (1Н, Н-1'); 4.66 с (1Н, Н-4'); 3.61 д (2Н, J=9,0 Гц, СН₂-Р), 2.92 м(1Н, H-5ʹα); 1.96 м (1Н, H-5ʹβ). ³¹P ЯМР-спектр (D₂O, δ, м. д. ): 11.6 д (α-P, J_α-β = 35,10 Гц); 0.29 м (β-P); 10.7 д (γ-P, J_β-γ = 16,3 Гц), FAB-масс, m/z: 582 (М⁺+Н).

Пример 10. 2',3'-Дидезокси-2',3'-дидегидро-4'-(γ-фениламино-β, γ-дифтор-метилендифосфонил-α-метиленфосфонил)-4'-норкарбоаденозин (Соединение 10, B= Ade, R' и R'' образуют двойную связь, Z=CH₂, R'''=NHPh, X'=X''=F).

Синтез проводят по методике, аналогичной примеру 1, исходя из 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-4'-норкарбоаденозин-4'-α-метиленфосфоната и дифторметилендифофоната бистрибутиламмониевой соли. Выход 26%.

УФ-спектр (вода) λ_max260 nm (ε14100). ¹H ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 8.18 с (1Н, Н-2); 8.16 с (1H, Н-8); 7.68 м (2Н, Ph), 7.32 м (3Н, Ph), 6.24 м (1-Н, Н-3'); 5.99 m (1Н, Н-2'); 5.46 м (1Н, Н-1'); 4.66 с (1Н, Н-4'); 3.74 д (2Н, J_CH,P=8.5 Гц, ), 2.86 i (1H, H-5ʹα); 1.90 м (1H, H-5ʹβ). ³¹P-ЯMP-cпeктp (D₂O, δ, м.д.): 12,97 д (α-P, J_α-β = 33,5 Гц), 6,80 д (γ-P, J_β-γ = 13,32 Гц), -0,71 м (β-P) FAB-масс, т/z: 598 (М⁺+Н).

Пример11.2',3'-Дидeзoкcи-4'(γ-фeнил-β, γ-бpoммeтилeндифocфoнил-α-мeтилeн-фосфонил)-4'-нортимидин (Соединение 11, B=Thy, R'=R''=H, Z=O, R'''=PhO, X'= H, X''=Br).

Синтез проводят по аналогичной примеру 1 методике из 2',3'-дидезокси-4'-нортимидин-4'-α-метиленфосфоната и бис(трибутил-аммонийной) соли фенилфосфонилбромметиленфосфоната. Выход 0,16 ммол, 32%. УФ-спектр (вода) λ_max268 нм (ε9600), ¹H-ЯМР-спектр (D₂O, δ, м.д.): 7.68 м (2Н, аrom), 7.32 м (3Н, Ph), 7.14 с (1H, Н-6); 6.14 т (1H, J=6.5 Гц, Н-1'); 5.56 м (1H, Н-4'); 3.57 д (2Н, j_CH,P=8.5 Гц, ); 2.7-2.2 м (4Н, Н-2', Н-3'); 1.95 с (3Н, ). ³¹P-ЯMP-cпeктp (D₂O, δ, м.д.): 11,84 д (α-P, J_α-β = 35,0 Гц), 9,13 д (γ-P, J_β-γ = 13,55 Гц), 0,05 м (β-P). FAB-масс, m/z: 644 (М⁺+Н), 661 (M⁺+H+NH₃).

Изучение ингибирования биосинтеза ДНК заявляемыми соединениями при катализе реакции ДНК-полимеразами проводили с использованием обратной транскриптазы ВИЧ [К. Ф. 2.7.7.49], а также концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы из тимуса теленка [К.Ф. 2.7.7.31] ("Amersham"), ДНК-полимеразы α, β и ε из плаценты человека. Одноцепочечную ДНК фага М13тр10 выделяли из культуральной жидкости реципиентного штамма Е. coli K12XL1. Для ДНК-полимераз α, β, ε и обратной транскриптазы ВИЧ использовали одноцепочечную ДНК фага М13mp10 в качестве матрицы и в качестве праймера синтетический 2'-дезокситетрадекануклеотид (структура рабочей части комплекса показана на фиг. 1). Для концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы использовали тот же праймер, но без матрицы.

Праймерный тетрадекануклеотид метили по 5'-положению с помощью (уд. акт. 1500 Ки/ммоль, "Радиоизотоп") при катализе полинуклеотидкиназой фага Т4 ("Amersham").

Условия реакции выбирали в зависимости от свойств соответствующей ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы).

Одноцепочечную ДНК фага М13тр10 (0,5 мкМ) гибридизовали с праймером, меченым ³²P до 5'-концу (0,75 мкМ) в следующих буферах: 10 мМ Трис-НСl (рН 8,2), 5 мМ MgCl₂, 40 мМ КСl, 1 мМ дитиотреитол (в случае обратной транскриптазы), 100 мМ какодилат натрия (рН 7,2), 10 мМ MgCl₂, 1 мМ CaCl₂ и 1 мМ дитиотреитол (в случае концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы), 10 мМ Трис-НСl (рН 7,4), 6 мМ MgCl₂ и 0,4 мМ дитиотреит (в случае ДНК-полимераз а и е), 10 мМ Трис-НСl (рН 8,5), 6 мМ MgCl₂ и 0,4 мМ дитиотреитол (в случае ДНК-полимеразы β).

Исследование ингибиторных свойств соединений в бесклеточной системе с индивидуальным ферментом проводили в 6 мкл инкубационой смеси, содержащей 0,01 мкМ меченого праймер-матричного комплекса (фиг.1), исследуемое соединение, соответствующие природные 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты и фермент (1 ед. акт. ДНК-полимераз α, ε и β, 2 единицы активности обратной транскриптазы или 3 ед. акт. концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы) в соответствующем буфере (см. выше). Реакцию начинали добавлением фермента и проводили в течение 20 мин при 37^oС. Для остановки реакции добавляли 3 мкл деионизованного формамида, содержащего 20 мкМ EDTA, 0,1%-ный бромфеноловый синий и 0,1%-ный ксиленцианол. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном денатурирующем ПААГ. Полученные гели подвергали радиоавтографии, используя рентгеновскую пленку Kodak XRP-5. Просчитывали радиоактивность соответствующих полос на геле и определяли концентрацию ингибитора, дающую 50% ингибирование элонгации цепи. Далее рассчитывалось соотношение этой концентрации к концентрации природного субстрата. Для сравнения использовали 3'-азидо-2', 3'-дидезокситимидин-5'-трифосфат (AZTTP). Результаты приведены в таблице 1.

Как видно из табл. 1, все соединения обладают высокой активностью в подавлении синтеза ДНК при катализе обратной транскриптазой ВИЧ, но не влияют на синтез ДНК при катализе ДНК-полимеразами человека даже при концентрациях в 25-100 раз более высоких. Они несколько превосходят в этом отношении хорошо известный ингибитор этого фермента AZTTP.

Определение противовирусной активности проводили на клетках фибробластов мыши, инфицированных вирусным конструктом, содержащим обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей Молони (Mo-MLV) (Шевелев Л.Я. др., Мол.биол., 1995, 29, N 5, 1114-1123).

Фибробласты крысы линии Ratl рассеивали на 4-луночные плашки Libro (Flow) 1:10. Через 2 суток клетки заражали вирусом pSG1, собранным со свежего монослоя клеток упаковщиков РАЗ17 и разведенным свежей средой в соотношении 1:10. Исследуемые соединения в 10-кратных серийных разведениях добавляли в культуральную среду в момент заражения. Через 1 сутки среду меняли на свежую и еще через 1 сутки фиксировали, окрашивали Xgal и подсчитывали количество колоний, окрашенных в голубой цвет и, следовательно, экспрессирующих β-галактозидазу E. coli, кодируемую вирусом pSG1 (Шевелев Л.Я. др., Мол. биол. , 1995, 29, N 5, 1114-1123). Результаты выражали в % зараженных клеток в присутствии исследуемого соединения по отношению к контролю в отсутствие этого соединения. Каждая точка является средней из 3 параллельных измерений в 2 независимых экспериментах. Стандартные отклонения не превышают 20%. Для сравнения использовали азидотимидин (AZT).

В таблице 2 показаны результаты подавления вируса, выраженные в концентрациях исследуемого соединения, подавляющих вирус на 50 и 90%.

Как видно из таблицы 2, антивирусная активность всех соединений соизмерима с таковой для азидотимидина (AZT)
Скорость дефосфорилирования синтезированных соединений в сыворотке крови человека определяли, добавляя по 2,5 мкл 10 мМ растворов всех синтезированных соединений к 47,5 мкл 100% фетальной сыворотки человека. Растворы инкубировали при 37^oС и через 2,5, 5, 10, 20, 30, 40, 60, мин, 2, 3, 4, 5, 8, 12, час, 2, 4, 7, и 14 суток, прибавляли по 50 мкл воды и 230 мкл метанола, встряхивали и оставляли на 30 мин при -20^oС. Образцы центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин, супернатанты концентрировали до 100 мкл и анализировали ВЭЖХ на колонке Nucleosil 120C18 (4•150 мм, 5 мкм) линейным градиентом метанола от 0 до 35% в 0,05 М КН₂РO₄-буфере за 25 мин, скорость потока 0,5 мл/мин. Для сравнения использовали 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-5'-фосфат и природные субстраты dTTP и dATP.

В таблице 3 представлены данные по скорости гидролиза заявляемых соединений в неразбавленной плазме крови человека, характеризующие их стабильность в этих условиях. Кроме того, даны времена удерживания соединений на твердой фазе при ВЭЖХ, что отражает степень их гидрофобности.

Из таблицы 3 видно, что время гидролиза половинного количества соединений 1-8 примерно в 2000 раз больше, чем для природных субстратов dTTP и dATP, а также AZTTP. При этом их гидрофобность, пропорциональная времени удерживания при ТСХ, значительно увеличивается, что облегчает их диффузию в клетки.

Формула изобретения

Модифицированные нуклеозид-5 -трифосфаты общей формулы

где В=тимин, аденин, урацил или 5-этилурацил;

R' - Н или N₃;
R'' - Н или R' и R'' вместе образуют двойную связь;
Z - O или CH₂;
R'''=Ph, OАlkyl, OPh, NHPh;
X'=X''=Br, F; или Х'=H, a X''=Br
как антивирусные агенты.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2