Способ анализа клеточного состава крови по мазку

 

Изобретение относится к области медицины. Способ осуществляют следующим образом. Для реализации способа предварительно окрашивают предметное стекло. После нанесения на него мазка в виде монослоя из дозированного объема крови предметное стекло выдерживают в камере влажности до насыщения слоя красителя водяным паром. Мазок разбивают на поля зрения путем выбора участков с однородными характеристиками элементов. При разбивке мазка на поля зрения учитывают неравномерность распределения различных типов клеток на мазке путем выбора соответствующей траектории расположения полей зрения. Поля зрения вводят в память компьютера. Кадры одновременно сегментируют. При анализе лейкоцитов проводят дополнительную сегментацию по статистической процедуре, выделяя на участке содержащего лейкоцит кадра внутриклеточные структуры объекта. Получают информацию о количественных характеристиках клеток крови и их качественном описании. Способ обеспечивает возможность проведения анализа клеточного состава крови в экстремальных условиях.

Изобретение относится к области медицины и может использоваться в медицинской технике при анализе клеточного состава крови, преимущественно периферической.

Известен способ анализа клеточного состава крови по мазку, включающий приготовление сухого окрашенного мазка, разбивку мазка на поля зрения, которые посредством оптико-цифровой системы вводят в память компьютера в виде серии кадров, кадры сегментируют, измеряют выделенные объекты, находят распределение тромбоцитов по размерам, выделяют нормальные и патологические формы эритроцитов и подсчитывают их соотношения, определяют лейкоцитарную формулу (Медовый B. C. и др. Автоматизированные цитофотометрические тесты мазков крови для общей клиники и скрининговых обследований населения. "Клиническая лабораторная диагностика", 1997, 10, с. 6-8).

Этот способ позволяет анализировать отдельные типы клеток крови и не приспособлен к их комплексному анализу, что не позволяет получить качественную картину состояния клеток. Он не обеспечивает получения информации о количестве клеточных элементов в объеме крови. Кроме того, он непригоден в условиях, когда используемый прием подготовки пробы в виде окрашенного сухого мазка невозможен, например на космических станциях.

Из известных способов наиболее близким к заявленному является способ анализа клеточного состава крови по мазку, включающий приготовление мазка на предметном стекле в виде монослоя из дозированного объема крови, разбивку мазка путем выбора участков с однородными характеристиками элементов на поля зрения, которые посредством оптико-цифровой системы вводят в память компьютера в виде серии кадров, кадры одновременно сегментируют, измеряют выделенные объекты, находят распределение тромбоцитов по размерам, выделяют нормальные и патологические формы эритроцитов и подсчитывают их соотношения, определяют лейкоцитарную формулу, при этом тип всех выделенных в кадре клеток определяют одновременно, подсчитывают число выделенных клеток каждого типа в каждом кадре, а количество клеток крови различных типов определяют пересчетом количества клеток по площади мазка на объем пробы (RU 2147123 Cl, G 01 N 33/49, 2000). В этом способе мазок крови приготавливают, используя окрашивание крови жидкостными красителями, преимущественно по методике Романовского-Гимза.

Этот способ более диагностически информативен, позволяет получить информацию о количественных характеристиках крови одновременно с их качественным описанием. Однако он также неприменим в экстремальных условиях, например в условиях космической станции, когда невозможно приготавливать окрашенный сухой мазок, поскольку жидкостные красители здесь неприменимы. Вместе с тем, в механизмах адаптации человека к комплексу факторов, характерных для космического полета, большое значение имеет именно состояние крови, изменения которой являются определяющим показателем влияния внешней среды на организм. Поэтому во время длительных космических полетов необходимо регулярно проводить анализ крови космонавтов. Способы же анализа, основанные на разведении крови различными жидкими реагентами, здесь непригодны в принципе из-за нетекучести жидкости в невесомости. Указанный известный способ становится неэффективным и в некоторых других экстремальных ситуациях, когда необходимо проводить обследование состояния крови у большого контингента людей (пандемии; военные действия, особенно с применением оружия массового поражения - ядерного, химического и биологического; земные и атмосферные катастрофы глобального характера), поскольку применение жидкостных красителей для приготовления проб увеличивает время анализа и может быть значительно затруднено или вообще невозможно.

Задача, решаемая изобретением, заключается в создании эффективного способа анализа клеточного состава крови по мазку, лишенного недостатков прототипа. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, состоит в обеспечении возможности проведения анализа клеточного состава крови в экстремальных условиях при одновременном сохранении высокой диагностической информативности анализа (информации о количественных характеристиках крови и их качественном описании).

Это достигается тем, что в способе анализа клеточного состава крови по мазку, включающем приготовление мазка на предметном стекле в виде монослоя из дозированного объема крови, разбивку мазка путем выбора участков с однородными характеристиками элементов на поля зрения, которые посредством оптико-цифровой системы вводят в память компьютера в виде серии кадров, кадры одновременно сегментируют, измеряют выделенные объекты, находят распределение тромбоцитов по размерам, выделяют нормальные и патологические формы эритроцитов и подсчитывают их соотношения, определяют лейкоцитарную формулу, при этом тип всех выделенных в кадре клеток определяют одновременно, подсчитывают число выделенных клеток каждого типа в каждом кадре, а количество клеток крови различных типов определяют пересчетом количества клеток по площади мазка на объем пробы, предметное стекло предварительно окрашивают, после нанесения на него мазка его выдерживают в камере влажности до насыщения слоя красителя водяным паром, при этом при разбивке мазка на поля зрения учитывают неравномерность распределения различных типов клеток на мазке путем выбора соответствующей траектории расположения полей зрения, а при анализе лейкоцитов проводят дополнительную сегментацию по статистической процедуре, выделяя на участке содержащего лейкоцит кадра внутриклеточные структуры объекта.

Указанный выше технический результат обеспечивается всей совокупностью существенных признаков.

В соответствии с заявленным способом предварительно (заранее) окрашивают предметное стекло путем нанесения на вымытое и обезжиренное стекло слоя необходимых красителей, например 100 мкл 2,5% раствора эозин-метиленового синего на метиловом спирте. Раствору дают равномерно растечься и высохнуть. На сухом предметном стекле (которое может храниться длительное время) изготавливают мазок в виде монослоя, например, с помощью автоматической пипетки из дозированного объема крови. Приготовленный мазок помещают в камеру влажности с воздухом, насыщенным парами воды, например, при температуре 20-25^oС и выдерживают в ней, например, 15 минут до насыщения слоя красителя водяным паром, вследствие чего происходит окрашивание мазка. После извлечения из камеры влажности предметное стекло с мазком подсушивают, например, 3 минуты. При этом на мазке сохраняются все типы форменных элементов (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты), что позволяет проводить их дальнейшее исследование. Разбивку мазка на поля зрения осуществляют путем выбора участков с однородными характеристиками, при этом учитывают неравномерность расположения различных типов клеток на мазке путем выбора соответствующей траектории расположения полей зрения. Такой учет оказывается необходимым, поскольку указанная неравномерность возникает из-за особенностей, характерных для приготовления мазка на окрашенном стекле. Поля зрения мазка под микроскопом посредством оптико-цифровой системы вводят в память компьютера в виде серии цифровых кадров. Для сканирования препарата и ввода серии кадров, содержащих изображения полей зрения микроскопа, может использоваться, например, биологический оптический бинокулярный микроскоп DMLS фирмы Leica с тринокулярной насадкой, включающей тубус с видеокамерами. В качестве видеокамеры может быть использована, например, цифровая камера EDC-1000E фирмы Electrim, а в качестве компьютера - персональный компьютер типа PC Pentium II. Введенные кадры одновременно сегментируют - клетки всех типов и их внутриклеточные структуры выделяют в каждом сохраненном кадре. При этой (первичной) сегментации выделяют на изображении эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, участки фона и прочие объекты (грязь и др.). Далее подсчитывают количество выделенных клеток каждого типа - эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов пересчетом количества клеток по площади мазка на объем пробы, определяют соотношения количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, измеряют выделенные объекты, определяют распределение тромбоцитов по размерам, проводят распознавание (классификацию) изображений клеток эритроцитов и лейкоцитов, выделяют нормальные и патологические формы эритроцитов и подсчитывают их соотношения, определяют лейкоцитарную формулу. При этом тип всех выделенных в кадре клеток определяют одновременно.

При сегментации на изображении выделяют области, соответствующие различным физическим объектам, таким как фон, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты и т. д. , которые могут быть как однородными по своим цветояркостным характеристикам, например эритроцит или тромбоцит, так и неоднородными, например лейкоцит с выраженным ядром. Для решения этой задачи изображение разбивается на более мелкие участки, в данном случае отвечающие свойству однородности в рамках статистической модели. Это означает, что все элементы участка однородности описываются одной и той же математической моделью. Для описания случайной структуры однородных участков изображения используют, например, модель независимых пикселов, распределенных по нормальному закону. При этом однородной считается область с одинаковыми значениями параметров распределения. Первичная сегментация - это выделение на изображении эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, участков фона и прочих объектов. В предположении наличия на изображении достаточного количества эритроцитов и участков фона строят первый (априорный) порог с целью разделения гистограммы на участки "фон" и "не фон". Затем на каждом из полученных участков с помощью устойчивой к засорению выборки (робастной) процедуры оценивания строят оценки параметров главных пиков гистограммы - фона и эритроцитов, ограничивающие симметричный относительно среднего участок пика, суммарная вероятность которого равна заданной величине. На базе этих оценок строят окончательные пороги. Далее путем анализа площадей группы соседних участков, отнесенных на первом этапе к участкам средней яркости и темным участкам изображения, производят распознавание выделенных объектов (отнесение клеток к соответствующему типу) и подсчет числа клеток в кадре.

При анализе лейкоцитов проводят дополнительную сегментацию по статистической процедуре, выделяя на участке содержащего лейкоцит кадра внутриклеточные структуры объекта (цитоплазму и включения). Такая дополнительная сегментация необходима из-за малой контрастности изображений участков препарата, приготовленного на окрашенном стекле. Для этого применяют статистическую (не пороговую) процедуру, заключающуюся, например, в проверке статистических гипотез, которые формируются в виде вероятностного распределения. При этом рассматривают выделенный на первом этапе сегментации небольшой участок изображения, содержащий лейкоцит. Далее формируют список гипотез о распределении яркости внутри выделенных участков изображения. С этой целью строят гистограмму выделенного участка изображения. Используя алгоритм разделения смесей вероятностных распределений, по построенной гистограмме получают оценки параметров распределений, отвечающих областям фона, эритроцитов, цитоплазмы и ядра лейкоцита. В качестве оценок параметров распределений, отвечающих фону и эритроцитам, берут, например, оценки, полученные на предыдущем этапе сегментации. Для каждого пиксела изображения выбирают окрестность заданной конфигурации. Из элементов этой окрестности формируют выборку. По построенной выборке проверяют гипотезы о соответствии ее распределения распределениям из списка. Элементу изображения приписывают номер области в соответствии с тем, какая гипотеза принята для его окрестности. Формируют области однородности, т.е. области изображения, отвечающие одному распределению. Процедура заканчивается за один проход. После этого на выбранном участке изображения выделяют связные области и осуществляют первичное распознавание элементов изображения - определяют области сегментов ядра и цитоплазмы лейкоцитов. На следующем этапе обработки строят формальное описание выделенных и идентифицированных элементов изображения. Для тромбоцитов определяют ограниченный набор признаков объекта - малый размер, относительно темная окраска, округлая форма. Для выделения нормальных и патологических форм эритроцитов и для определения лейкоцитарной формулы используют более полное описание объектов. При этом описывают форму клетки и внутриклеточных элементов (форма эритроцита, ядра и цитоплазмы эритроцита).

Характеристики изображений клеток можно условно разделить на три группы - текстурные характеристики элемента изображения, характеристики формы, включая размеры, и цветояркостные характеристики. Описание текстурных характеристик определяется параметрами модели элемента изображения. В рамках выбранной модели изображения цветояркостными и текстурными характеристиками, используемыми при анализе, являются параметры распределений элементов изображения, соответствующих областям однородности. В качестве модели распределения для каждой цветовой компоненты используют распределение с кусочно-дифференцируемой плотностью, которая на существенном участке представляет собой экспоненту с полиномом заданной степени в показателе. Для описания формы объекта используют преимущественно параметрическое представление внешнего контура элемента изображения в виде комплексной функции и последующее ее разложение в ряд Фурье. Характеристиками формы объекта, включая площадь и периметр, являются 30 первых коэффициентов такого разложения. Для сравнения формы используют метрику (расстояние) в пространстве кривых, не зависящую от движений плоскости и представляющую собой минимум симметрической разности площадей, ограниченных кривыми по всем элементарным движениям плоскости. На следующем шаге определяют информативные признаки выделенных объектов. Для снижения размерности пространства признаков используют стандартный метод главных компонент. В качестве процедуры используют, например, процедуру классификации (проверки гипотез) в рамках модели Фишера для нескольких классов, как в способе-прототипе.

Анализ клеточного состава крови в соответствии с изобретением применим в экстремальных условиях, когда приготовление окрашенных мазков крови невозможно или, по крайней мере, значительно затруднено. В то же время заявленный способ высокоинформативен. Способ обеспечивает определение количества эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов на площади мазка, выделение патологических и нормальных форм эритроцитов, подсчет их количественных соотношений, определение среднего содержания гемоглобина в эритроцитах, описание распределения тромбоцитов по размеру и подсчет лейкоцитарной формулы.

Формула изобретения

Способ анализа клеточного состава крови по мазку, приготовление мазка на предметном стекле в виде монослоя из дозированного объема крови, разбивку мазка путем выбора участков с однородными характеристиками элементов на поля зрения, которые посредством оптико-цифровой системы вводят в память компьютера в виде серии кадров, кадры одновременно сегментируют, измеряют выделенные объекты, находят распределение тромбоцитов по размерам, выделяют нормальные и патологические формы эритроцитов и подсчитывают их соотношения, определяют лейкоцитарную формулу, при этом тип всех выделенных в кадре клеток определяют одновременно, подсчитывают число выделенных клеток каждого типа в каждом кадре, а количество клеток крови различных типов определяют пересчетом количества клеток по площади мазка на объем пробы, отличающийся тем, что предметное стекло предварительно окрашивают, после нанесения на него мазка его выдерживают в камере влажности до насыщения слоя красителя водяным паром, при этом при разбивке мазка на поля зрения учитывают неравномерность распределения различных типов клеток на мазке путем выбора соответствующей траектории расположения полей зрения, а при анализе лейкоцитов проводят дополнительную сегментацию по статистической процедуре, выделяя на участке содержащего лейкоцит кадра внутриклеточные структуры объекта.