Способ коррекции показателей крови и увеличения продолжительности жизни больных т-лимфолейкозом животных

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии. Предложен способ торможения Т-лимфолейкозного процесса у животных, заключающийся в том, что один раз в 10-14 дней подкожно в дозе 0,2 мл вводят смесь, содержащую ммоль/кг веса: аденозинтрифосфорная кислота - 0,1; аденозин-3', 5'-монофосфорная кислота - 0,1; глютатион окисленный - 0,05; теофиллин - 0,05; этилендиамин - 0,01; 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота - 0,1; 1-β-D-арабинофуранозилцитозин - 0,17; причем все вводимые вещества растворяют в среде RPMI, добавляя 0,2-0,3 н. гидроокись натрия до рH 5,6-6,5, а теофиллин и этилендиамин используют в составе 2,4%-ного эуфиллина. Способ позволяет повысить эффективность лечения Т-лимфолейкозов. 1 табл., 5 ил.

Изобретение относится к области медицины и касается восстановления продолжительности жизни больных Т-лимфолейкозом животных, восстановления до нормы числа лейкоцитов и лимфоцитов с активацией системы кроветворения путем введения веществ, индуцирующих внутриклеточную регуляторную систему цАМФ и процессы репарации на фоне радиопротекторов и широко используемых в онкоклинике цитостатиков. Заложенный в заявляемом способе принцип основан на известных данных о типичных для всех типов злокачественных клеток нарушениях и изменениях в геноме. Используемые в онкологии цитостатики лишь увеличивают нарушения уже во всем организме (1,2), в результате чего ускоряются и усиливаются и без этих воздействий развивающиеся лейкопения, анемия, снижение активности иммунной системы (3, 4). Поэтому в онкологии проблема ликвидации злокачественных клонов стоит в одном ряду с проблемами защиты систем иммунитета и кроветворения. На возможность разрешения этих проблем и указывает заявляемый нами способ.

Наиболее эффективным способом защиты систем иммунитета и кроветворения онкобольных является введение им после курса химиотерапии цитостатиками законсервированных до заболевания аутологичных клеток костного мозга или стволовых кроветворных клеток. Криоконсервация клеток до заболевания для всего населения нереальна.

Наиболее близким к заявляемому является способ химиотерапии цитостатиками с одновременным поддержанием активности систем иммунитета и кроветворения цитокинами. К используемым в онкологии цитокинам можно отнести рекомбинантный интерлейкин ИЛ-1-β (5), интерфероны, тактивин (6), ИЛ-2 (7). Однако цитокинотерапия не решает одной из неотложных задач, а именно репарации как уже имеющихся нарушений в злокачественной клетке, так и вновь возникающих в любой ткани под действием цитостатиков. В результате эффекты цитокинов кратковременны и носят лишь поддерживающий характер.

Целью изобретения является способ поддержания числа лейкоцитов и лимфоцитов на уровне нормы, активации эритропоэза и увеличения продолжительности жизни больных лимфолейкозом.

Заявляемый способ отличается от известных способов торможения лейкозных процессов тем, что в основе подхода лежит репарация как уже имеющихся повреждений в злокачественных клетках, так и вновь возникающих в любой ткани под действием практикуемых в онкологии цитостатиков. Индукция репарационных процессов запланирована радиопротекторами в условиях усиления координации внутриклеточных регуляторных систем через активацию внутриклеточной регуляторной системы цАМФ.

Принятый в заявляемом способе подход к торможению лимфолейкозного процесса исходит из полученных нами данных практически полной инактивации системы цАМФ в злокачественных клетках тимомы мышей линии AKR/J со спонтанно развивающимся под действием ретровируса Т-лимфолейкозом. Из таблицы видно, что фосфотрансферазная активность цАМФ-зависимых протеинкиназ (ПК А) в клетках тимомы мышей AKR/J не превышает 5%-ной активности ПК А в тимоцитах молодых (3-4 мес.) еще здоровых мышей данной линии. Введение больным лейкозом мышам AKR/J в возрасте 10 мес цАМФ в концентрации 0,1 ммоль на 1 кг веса увеличивает активность ПК А более чем в 2 раза, но достигнутая активность остается очень низкой на фоне активности ПК А в тимоцитах как молодых еще здоровых мышей AKR/J, так и генетически здоровых (CBAxC57BL/6)F₁ гибридов. Тем не менее индукция и такой остаточной активности может хотя бы на период инъекций приблизить к норме функционирование мембран клеток и их рецепторов и обеспечить более эффективное включение в клетки вводимых веществ и их действие. Система цАМФ вовлечена в координацию всех внутриклеточных регуляторных систем; следовательно, с активацией системы цАМФ на фоне радиопротекторов можно ожидать активации не только энергетических процессов, находящихся под контролем цАМФ, но и системы репарации повреждений. Для клеток и тканей, не подвергнутых злокачественной трансформации, такие создаваемые условия могут явиться защитой, обеспечивающей репарацию вновь возникающих повреждений под действием цитостатиков, используемых в онкологии. Данные предположения и заложены в основу заявляемой смеси аналогично разработанному нами ранее способу восстановления активности стволовых кроветворных клеток после радиации (8).

Сущность способа заключается в следующем. Мышам линии AKR/J со спонтанно развивающимся Т-лимфолейкозом с возраста 10 мес и количества лейкоцитов в периферической крови, превышающего 10-12 млн в 1 мл крови (при 7-8 млн. у животных данной линии в 5 мес), вводится один раз в 10-14 дней подкожно (п/к) в объеме 0,2-0,1 мл смесь, содержащая в среде RPMI следующие вещества, ммоль на 1 кг веса животного: аденозинтрифосфорную кислоту (АТФ) - 0,1; глютатион окисленный - 0,05; аденозин-3',5'-монофосфорную кислоту (цАМФ) - 0,1; теофиллин (в составе 2,4%-ного эуфиллина) - 0,05; этилендиамин (в составе 2,4%-ного эуфиллина) - 0,01; 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту - 0,05; 5-(2'-пиридил)-3-тиапентан-1,1-дифосфоновую кислоту - 0,1; 1-β-D-apaбинофуранозилцитозин (цитарабин, ЦА) - 0,17. Раствор нейтрализуется 0,2-0,3 н. NaОН до рН 5,5-6,5.

Все компоненты смеси направлены на активацию систем внутриклеточной регуляции и системы репарации через индукцию системы цАМФ на фоне радиопротекторов.

Индукция системы цАМФ осуществляется такими веществами, как глютатион окисленный (активатор ПК А), теофиллин (ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ), цАМФ (активатор экспрессии многих функционально важных генов), АТФ. Глютатион и этилендиамин известны как радиопротекторы, эффективные при введении до облучения. Вещества 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота и 5-(2'-пиридил)-3-тиапентан-1,1-дифосфоновая кислота введены в смесь как способные нести двойную функцию: ингибиторов фосфодиэстеразы цАМФ (благодаря активному связыванию Са²⁺ и снижению концентрации последнего в клетке) и радиопротекторов (исходя из особенностей структур). ЦА введен в смесь как используемый в онкоклинике цитостатик, включающийся в первую очередь в активно пролиферирующие клетки, в том числе и злокачественные.

Введенные в смесь вещества известны и разрешены фармакологией, за исключением двух новых веществ, синтезированных в Институте химической кинетики и горения СО РАН. Одно из этих веществ - 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота - описано в патенте (8). Способ получения другого вещества приводится ниже. Концентрации вводимых веществ подобраны экспериментальным путем.

Новое химическое вещество - 5-(2'-пиридил)-3-тиапентан-1,1-дифосфоновая кислота - в литературе не описано. Способ получения этого вещества основан на реакции нуклеофильного присоединения 2-винилпиридина к 2-меркаптоэтилиден-1,1-дифосфоновой кислоте, способ получения которой опубликован (9). Реакция протекает в водном растворе, слабощелочной среде (рН 8-9) и дает целевой продукт с выходом, близким к 70%. Вещество легко выделяется из реакционной смеси в форме осадка.

Получение 5'-(2-пиридил)-3-тиапентан-1,1-дифосфоновой кислоты формулы 1,2 г Триаммонийной соли 2-меркаптоэтилиден-1,1-дифосфоновой кислоты растворяется в 10 мл воды и пропускается через колонку, заполненную смолой КУ-2 в Н⁺-форме. Элюат упаривается до 10 мл. К упаренному элюату добавляется 10,1 г (10 ммоль) триэтиламина и 0,84 г (8 ммоль) 2-винилпиридина. Смесь выдерживается 12 ч при перемешивании и 80^oС. Для предотвращения окисления через реакционную смесь пропускается слабый поток азота. Через 12 ч смесь охлаждается, к смеси добавляется 10 мл воды и 1 г углекислого калия. Смесь очищается экстракцией этиловым эфиром 4 раза. Водная фаза после удаления остатков эфира пропускается через колонку со смолой КУ-2 в Н⁺-форме. Элюат упаривается до 5 мл, после чего добавляется метанол до помутнения. После начала кристаллизации добавляется еще 10 мл метанола. Через 12 ч осадок выделяется фильтрацией, промывается метанолом и высушивается. Вещество перекристаллизовывается из воды. Выход продукта - 1,2 г (72%).

Данные pН-метрического титрования и элементного анализа.

Найдено, %: С 32,48; Н 4,60; Р 18,40.

Экв. 325,0.

С₉Н₁₅NP₂O₆S.

Вычислено,%: С 32,44; Н 4,54; Р 18,59.

Экв.327,2.

³¹Р-ЯМР-спектр (Д₂О+K₂CO₃, рН 7): 18,6 м.д. отн. 85%ной Н₃РО₄ при подавлении спин-спинового взаимодействия.

с¹Н-синглет.

Токсичность данного вещества не превышает токсичности 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновой кислоты (8).

Эксперименты, выявляющие влияние заявляемой смеси на продолжительность жизни и на показатели крови больных лимфолейкозом животных, проведены на мышах линии АКR/J со спонтанно развивающимся под действием ретровируса Т-лимфолейкозом. Активность системы цАМФ в иммунной системе данной линии мышей определена по фосфотрансферазной активности ПК А в тимоцитах молодых еще здоровых животных (3-4 мес) и клетках тимомы у животных в 10-12 мес по методу (10). Количество лейкоцитов и эритроцитов в периферической крови определялось в камере Горяева. Формула лейкоцитов выявлялась по мазкам крови, окрашенным по Романовскому-Гимзе. Полученные данные обработаны методом непараметрической статистики по Вилконсону. Количество животных в контрольной и опытной группах - 14 и 17 соответственно в трех опытах.

Пример. Один раз в 10-14 дней мышам АКR/J с возраста 10 мес и при количестве лейкоцитов более 10 млн в 1 мл периферической крови (при 7-8 млн. в 1 мл крови у мышей данной линии в 5 мес.) вводится п/к (подкожно) 0,2 мл смеси в среде RРМI, содержащей следующие вещества в концентрациях (ммоль на 1 кг веса животного): АТФ - 0,1; цАМФ - 0,1; глютатион окисленный -0,05; теофиллин (в составе 2,4%-ного эуфиллина) - 0,05; этилендиамин (в составе 2,4%-ного эуфиллина) - 0,01; 2-S-тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновую кислоту - 0,05; 5-(2'-пиридил)-3-тиапентан-1,1-дифосфоновую кислоту - 0,1; цитарабин (ЦА) - 0,17. Смесь нейтрализуется 0,2-0,3 н. NaOH до рН 5,5-6,5. Через 5-7 дней после каждого введения определяется количество лейкоцитов и эритроцитов в периферической крови, формула лейкоцитов. Количество введений заявляемой смеси - 15-20.

Данные фиг.1 показывают, что введение заявляемой репарационной смеси по такой схеме способствует поддержанию количества лейкоцитов на уровне значений, характерных для мышей данной линии в 5 мес. и генетически здоровых (CBA•C57BL/6)F₁ гибридов. Процент атипичных лимфоцитов в крови животных на фоне вводимой заявляемой смеси (фиг.2) после колебаний от 20 до 40% снижался до значений, выявляемых у мышей данной линии в 5 мес (14-15%) при 70% атипичных лимфоцитов у контрольных лейкозных животных без введений. Данные рис.3 убеждают в активации системы кроветворения заявляемой смесью. До 30-40% больных Т-лимфолейкозом мышей (фиг.4) в условиях хронического периодического введения заявляемой смеси имеют продолжительность жизни, свойственную генетически здоровым мышам. Продолжительность их жизни превышает 18 мес при 100%-ной гибели контрольных животных к 14-15 мес. Фотография подтверждает здоровый внешний вид мышей Т-лимфолойкозной линии АКR/J ко времени жизни в 25 мес в случае инъекций репарационной смеси с возраста 10 мес.

Заявляемый способ подтверждает действенность принятого подхода к снятию патологических процессов в организме, сопряженных с нарушениями в геноме, и в первую очередь злокачественных. Очевиден широкий спектр применения заявляемой репарационной смеси. Репарационная смесь может явиться неотложной для онкобольных как препарат, восстанавливающий системы кроветворения и иммунитета с существенным продлением жизни.

Литература 1. Rigad O., Guedenye G., Duranton I., Levoy A., Daloy M.T., Magdelenat H. 1. Genotoxic effects of radiotherapy and chemotherapy on the circulating lymphocytes of breast cancer patient. Chromosоme aberrations induced in vivo. Mutat. Res.Toxicol.Test, 1990, v.242, n.1, 17-23.

2. Sadamori N., Isode M., Shimisu S., Yamamory T., Itoyama T., Ikeda S., Yamoda Y., Ichimaru M. Relationship between chromosomal breackpoint and molecular rearrangement of T-cell antigen receptors in adult T-cell leukemia. Acta Haematol., 1991, v.86, n.1, 14-19.

3. Противоопухолевая химиотерапия Под ред. Н.И. Перевозчикова М., 1986, с.26.

4. А 61 К37/36 РСТ 91/00103 91.06.16. USA 5. Гершанович М. Л., С.А. Кетлинский, Л.В. Филатова, Л.А. Данова, В.О. Короленко, А. С. Симбирцев. Стимулирующее и протекторное влияние рекомбинантного интерлейкина-1-β (беталейкина) на лейкопоэз при химиотерапии злокачественных опухолей. Вопросы онкологии, 1996, т.42, 6, 13-18.

6. Махонова Л.А., А.В. Киселев, Г.А. Гордина, З.Г. Кадагидзе. Интерферон и тактивин в программе лечения неходжкинских лимфом у детей в период ремиссии. Вопросы онкологии, 1995, т.41, 2, 80-81.

7. Sodel P. M., Kawal H., Wesly O.H. Harnessing graft versus leukemia: implications for 1L-2 treatment. Bone Marrow Transplant., 1992, v.10, Suppl. 1, n.1, 13-15 8. Новикова В. М. , В. А. Козлов, И.С. Алферьев, Н.В. Михалин. Способ восстановления стволовой кроветворной клетки облученных животных. Патент 2017494 РФ // БИ 1994, 15.

9. Михалин Н. В. Винилидендифосфоновая кислота, ее синтез и химические превращения. Дисс. на соискание к.х.н., Новосибирск, 1980.

10. Nesterova M. V. , L.P. Sashchenko, V.Yu. Vasiliev, E.S. Severin. A cyclic adenosine 3,5-monophosphate-dependent histone kinase from pig brain. Purification and some properties of the enzyme. Biochim. Acta, Enzymology, 1975, v.377, n.2, 271-281.

Формула изобретения

Способ торможения Т-лимфолейкозного процесса у животных, включающий введение веществ, тормозящих лейкозный процесс, отличающийся тем, что один раз в 10-14 дней подкожно в дозе 0,2 мл вводят смесь, содержащую, ммоль/кг веса: Аденозинтрифосфорная кислота - 0,1 Аденозин-3', 5'-монофосфорная кислота - 0,1 Глютатион окисленный - 0,05
Теофиллин - 0,05
Этилендиамин - 0,01
2-S-Тиурониоэтилиден-1,1-дифосфоновая кислота - 0,1
1-β-D-Арабинофуранозилцитозин - 0,17
причем все вводимые вещества растворяют в среде RРМI, добавляя 0,2-0,3 н гидроокись натрия до рН 5,6-6,5, а теофиллин и этилендиамин используются в составе 2,4%-го эуфиллина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6