Новый препарат молочнокислых бактерий со свойствами биологической очистки (варианты)

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Препарат содержит живые клетки Lactobacillus clearans и живые или убитые, или те и другие клетки Enterococcus faecalis. Применение препарата способствует биологической очистке организма, активации иммунных функций, нормализации микрофлоры кишечника, дезодорации фекалий. 3 с.п. ф-лы, 37 табл.

Изобретение относится к препарату молочнокислых бактерий, исключительно важных для здоровья людей и животных, где совместное применение Lactobacillus clearans, впервые выделенных авторами изобретения и принадлежащих к роду Lactobacillus, и обладающих также специфическими свойствами, не обнаруженными у традиционно известных бактерий, живых или убитых, или тех и других, клеток Enterococcus faecalis (Enterococcus), серьезно участвующих в метаболизме липидов, позволяет более отчетливо и эффективно проявляться преимуществам каждого.

Предшествующий уровень техники Как сообщается, в кишечнике предшествует 300 видов и 100 триллионов отдельных бактерий, масса которых составляет около 1 кг и далеко превосходит общее число - примерно 60 триллионов, клеток человека. Годы поисков и иммунологических исследований постепенно прояснили их существенную роль в здоровье и различных болезнях людей и животных, и теперь специалисты рассматривают кишечную флору как функционирующий жизненный орган. Полезные бактерии, принадлежащие к группе молочнокислых бактерий, таких как род Bifidobacterium и род Lactobacillus, сосуществуют в балансе, когда преобладают по численности. Этот баланс может быть нарушен различными факторами, такими как изменения в количестве и качестве ежедневной пищи, перенапряжение, бессонница и эмоциональный стресс, приводящими к быстрому размножению вредных бактерий, таких как палочка Welch и Veillonella. Вытеснение полезных бактерий приводит к повышенному образованию вредных веществ, что может привести к различным заболеваниям и ускорить общее старение - от нарушений структуры фекалий, таких как диарея и констипация, до нарушений, проистекающих от зараженной крови, таких как хроническая усталость, потрескавшаяся кожа, дисфункция печени, гипертензия и артериосклероз.

Русский ученый Мечников (1845-1916) предсказал теоретически, что первопричиной старения является отравление токсинами, образующимися при гнилостном брожении в кишечнике, и предложил в качестве средства, помогающего предупреждать старение, употреблять напитки, содержащие молочнокислые бактерии, такие как йогурт. С тех пор на всем протяжении истории молочнокислых бактерий не было возможности подтвердить действительную практическую полезность таких бактерий. Это связано с тем, что данные, полученные в настоящее время с помощью иммунологических исследований и поясненные другими экспериментами, ранее были непонятны.

Гипотеза Мечникова подтвердилась, и теперь является общеизвестной в области наук о здоровье, поскольку последние достижения в области микробиологии объяснили многие важные функции, выполняемые полезными кишечными бактериями, такие как снижение кишечной кислотности и активирование кишечной подвижности, способствующей перевариванию пищи и поглощению питательных веществ, одновременное подавление и разрушение вредных веществ, синтез витаминов и аминокислот, защита от заражения кишечника патогенными микроорганизмами и усиление иммунитета.

Кроме того, согласно с последними направлениями в области наук о здоровье молочнокислые бактерии стали основой для многих людей как напитки и ветрогонные средства. Однако можно возразить, что такие продукты неинтересны для людей, которые ожидают положительных результатов и терпят неудачу в попытках улучшить здоровье и ослабить симптомы с помощью ежедневного приема или потребления молочнокислых бактерий. К несчастью, продукты, содержащие молочнокислые бактерии, все еще потребляются только как освежающие или еще есть тенденция рассматривать их как предмет выбора подобно кофе.

Как следует из вышеизложенного, существует потребность в продукте, который можно быстро вводить и получить лучший эффект, который не обеспечивают традиционные напитки и препараты, содержащие молочнокислые бактерии. Хотя авторы изобретения обнаружили ранее, что новый вид, названный Lactobacillus clearans, является высокоэффективным для целей здоровья, они отметили, в частности, что этому виду не хватает очищающего действия на кишечник. Усилия по получению штамма с большей эффективностью и лишенного этого недостатка привели к неизбежному выводу, что применение бактерии самой по себе позволяет получить лишь ограниченные результаты. Таким образом, поиск препарата молочнокислых бактерий, способного укрепить здоровых людей и вернуть хорошее ощущение жизни и восстановить здоровье людей с некоторыми проблемами со здоровьем, приводили одновременно с применением другого активного вещества.

Сущность изобретения В результате широких исследований с целью обнаружения совместимого биологического или небиологического партнера для устранения указанных выше недостатков авторы осуществили настоящее изобретение, обнаружив среди Enterococcus faecalis принадлежащих к той же группе молочнокислых бактерий, что и Lactobacillus clearans, вид, способный снижать содержание по меньшей мере одного соединения из числа триглицеридов и холестерина. Иными словами, настоящее изобретение относится к препарату молочнокислых бактерий, содержащему живые клетки Lactobacillus clearans и живые клетки Enterococcus faecalis, способному снижать содержание по меньшей мере одного соединения из числа триглицеридов и холестерина.

В другом аспекте изобретение относится к препарату молочнокислых бактерий, содержащему живые клетки Lactobacillus clearans и убитые клетки Enterococcus faecalis, способному снижать содержание по меньшей мере одного соединения из числа триглицеридов и холестерина.

В третьем аспекте изобретение относится к препарату молочнокислых бактерий, содержащему живые клетки Lactobacillus clearans и живые и убитые клетки Enterococcus faecalis, способному снижать содержание по меньшей мере одного соединения из числа триглицеридов и холестерина.

Описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения Lactobacillus clearans, о которых идет речь в настоящем изобретении, является новым штаммом, принадлежащим к роду Lactobacillus и обладающим перечисленными далее биохимическими характеристиками 1, 2, 3 и 4. А именно, он включает штаммы рода Lactobacillus, которые 1) способны снижать содержание как Na₂S•9H₂O, так и NH₄OH, когда 0,5 г Na₂S•9Н₂O и 0,5 мл NH₄OH добавляют к 5 г мясного экстракта, 5 г пептона, 1 г глюкозы, 1 г СаСО и 1 л воды (нейтральный рН); 2) не ускоряют рост при добавлении 0,5 г Na₂S•9Н₂О и 0,5 мл NH₄OH, во время логарифмической фазы роста бактериальной культуры к среде, содержащей 1 г казаминокислот и витамины (А - 900 ME; В₁ - 1 мг; В₂ - 1 мг; B₆ - 1 мг; В₁₂ - 5 мкг; никотинамид - 16 мг; пантотенат кальция - 8 мг; С - 64 мг и D - 120 ME) в среде Stephenson-Wetham (сокращенно S-W) 1 г КН₂РО₄, 0,7 г MgSO₄•7H₂O, 1 г NaCl, 4 г (NH₄)₂PO₄, 0,03 г FeSO₄• 7H₂0 и 5 г глюкозы); 3) обладают устойчивостью, в форме свободно выделенных штаммов, к Na₂S•9H₂O большей, чем у традиционно известных молочнокислых бактерий, но меньшей, чем у Lactobacillus deodorans и 4) являются грамположительными, палочкообразными, неподвижными и каталазоотрицательными и не восстанавливают нитраты и не разрушают желатин, не продуцируют индол или сульфид водорода, обладают высокой способностью к образованию молочной кислоты из глюкозы и лактозы и ускоряют рост при добавлении уксусной кислоты (см. публикацию патента Японии (Kokoku) H4-632).

Преимущества Lactobacillus clearans, кроме действия обычных Lactobacillus, включают сильное очищающее действие на кишечник, которым не обладают обычные Lactobacillus, как описано в патенте Японии 1714413 и заявке на патент Японии 11-15177, таким как 1) разложение гниющих дурно пахнущих веществ; 2) повышение числа полезных бактерий, таких как Bifidobacterium и Lactobacillus, в кишечной флоре при существенном снижении числа вредных бактерий, таких как палочка Welch и Veillonella, обеспечивая посредством этого лучший баланс в кишечной флоре, что улучшает кишечную среду, и 3) подавление роста в первую очередь этиологических факторов, вызывающих кишечные инфекции, и понижение токсичности.

Такое влияние будет продемонстрировано далее с помощью тестирования. Сначала проводили тестирование in vitro. В пробирки (18 x 180 мм) вносили 15 мл 10-кратно разведенных фекалий. Затем пробирки инокулировали образцами бактерий: 1) стерилизованных при высоком давлении в течение 15 минут при 120^oС и 2) нестерилизованных. Пробирки закрывали резиновыми пробками для анаэробного культивирования при 37^oС в течение 72 часов. Затем шприцем из внутреннего пространства пробирок отбирали по 1 мл воздуха и вводили его в 5-литровые мешки для образцов для оценки запаха, осуществляемой группой из 6 человек. Запах оценивали, основываясь на критериях запаха фекалий, приведенных в табл.1.

Три типичных штамма Lactobacillus clearans, а именно FERM ВР-6972, FERM BP-6971 и FERM BP-6973, тестировали на дезодорирующую способность в рассмотренном выше тесте in vitro. Результаты, приведенные в табл.2, показывают, что образцы, стерилизованные при высоком давлении, отчетливо дезодорированы, и их запах оценен как слабый или легкий запах фекалий. С другой стороны, нестерилизованные образцы показали меньшую дезодорацию, чем образцы, стерилизованные при высоком давлении, поскольку образовывались дурно пахнущие вещества, вероятно, в результате деятельности многих гнилостных бактерий в фекалиях, но тем не менее они дезодорированы достаточно отчетливо. Результаты для 3 типичных штаммов Lactobacillus clearans, полученные в рассмотренном выше тесте, воспроизводились с другими подобными штаммами.

В последующих тестах in vivo 150 мл йогурта, полученного с использованием Lactobacillus clearans FERM BP-6973, употребляли в пищу один раз в день и определяли запах фекалий после 20-30 дней, 50-60 дней и 80-90 дней употребления, получив средние показатели, приведенные в табл.3. Результаты получали посредством введения 0,5 г образцов фекалий от 10 индивидуумов в 20-литровые пакеты для образцов для оценки запаха, которые хранили при комнатной температуре, и через 30 минут запах оценивала группа из 6 человек. Средний запах фекалий 5 индивидуумов, не употреблявших йогурт, принят за 100. Хотя запах фекалий существенно изменялся в зависимости от содержания пищи, средний запах 10 индивидуумов, употребляющих йогурт, ослабевал на 50% после 1 месяца употребления, на 70% после 2 месяцев и на 85% после 3 месяцев. Однако через 3 месяца продолжающееся употребление приводило к пику в ослаблении запаха от 80 до 90%.

При рассмотрении корреляции между очисткой и бактериями в естественном состоянии авторы ограничили анализируемые соединения соединениями с легко определяемым неприятным запахом, которые в широком смысле подразделили на соединения серы, соединения азота и соединения углерода. Обнаружено, что бактерии, способные разрушать дурно пахнущие соединения серы, такие как Na₂S•9H₂0, дурно пахнущие соединения азота, такие как NН₃, и дурно пахнущие соединения углерода, такие как уксусная кислота, масляная кислота и подобные низшие жирные кислоты, способны разрушать большинство дурно пахнущих полимерных соединений серы, азота и углерода, причем это обстоятельство назвали SNC-теорией. В соответствии с данной теорией проводили описанные далее испытания.

К 1 мг синтетической среды, содержащей 5 г мясного экстракта, 5 г пептона, 3 г бутирата натрия, 5 г глюкозы и 3 г СаСО₃, добавляли 0,5 г Na₂S•9H₂O или 0,5 мл аммиачной воды (NH₄OH), среду инокулировали Lactobacillus clearans, культивировали в анаэробных условиях в течение 72 часов при 37^oС и определяли снижение содержания Na₂S•9Н₂O или NH₄OH во времени. Количество Na₂S•9H₂O определяли методом иодометрического титрования по JIS K0102-1985, а количество NH₄OH определяли методом поглощения индолфенолового синего по JIS K0102-1985. Результаты приведены в таблицах 4 и 5. Из таблиц видно, что Lactobacillus clearans обладает способностью снижать содержание токсичных дурно пахнущих Na₂S•9H₂O и NH₄OH на 40-50% за 72 часа. Это означает, что они могут разлагать и ассимилировать большинство дурно пахнущих токсичных веществ.

Указанные выше сенсорные тесты и химические анализы описаны как способы оценки дезодорирующего действия Lactobacillus clearans. Полученные при этом 10-кратно разведенные образцы фекалий центрифугировали до культивирования и через 72 часа после культивирования отбирали 5 мл супернатанта и разводили в 10 раз для определения концентрации ионов S²⁺ или NH₄ ⁺, и вычисляли степень ее снижения. Результаты, приведенные в табл.6, показывают, что снижение содержания ионов S²⁺ или NH₄ ⁺ в фекалиях даже выше, чем снижение в вышеуказанной синтетической среде, что показывает, что фекалии являлись более подходящей средой обитания для Lactobacillus clearans. Содержание ионов S²⁺ определяли методом иодометрического титрования по JIS K0102-1985, а содержание ионов NH₄ ⁺ определяли методом поглощения индолфенолового синего по JIS K0102-1985.

Указанный выше супернатант (2 мкл) вводили в газовый хроматограф для анализа низших жирных кислот. Газовая хроматография включала применение колонки с unisole F-200, стекло 30/60 (3 ⊘ 3 м), при скорости газа-носителя 50 мл/мин (Не), при давлении водорода 152 кПа (0,55 кг/см² G) и воздуха 152 кПа (0,55 кг/см² G), и температуре колонки 140^oС и инжектора 200^oС. Анализируемыми соединениями были уксусная кислота, пропионовая кислота, изомасляная кислота, н-масляная кислота, изовалериановая кислота и н-валериановая кислота; вычисленные концентрации приведены в табл.7. Из табл.7 видно, что концентрации низших жирных кислот снижались на 50-70% в образцах, стерилизованных при высоком давлении, и на 40-60% в нестерилизованных образцах.

Получали лиофилизованные клетки трех типичных штаммов Lactobacillus clearans, а именно FERM BP-6972, 6971 и 6973, и для получения препарата смешивали в равных частях. Периодически отбирали 2 г препарата (5•10⁸ клеток/г) и определяли изменения числа клеток во времени (клеток на 1 г фекалий) Bifidobacterium и Lactobacillus (за исключением Lactobacillus clearans), которые, как известно, являются типичными полезными бактериями в кишечной флоре, также как и типичных вредных бактерий, таких как Veillonella и Clostridium perfringens (палочка Welch). В табл.8 приведены результаты в случае перорального введения препарата 20 здоровым индивидуумам, а в табл.9 приведены результаты в случае перорального введения 20 конституционно слабым индивидуумам.

Таблицы 8 и 9 показывают, что до введения препаратов Lactobacillus clearans полезных бактерий в кишечной флоре у здоровых индивидуумов было в среднем на 220% больше, чем у конституционно слабых индивидуумов, в то время как вредных бактерий было только примерно 22,5%. Это показывает, что состояние кишечной флоры является показателем состояния здоровья, иными словами, насколько велико значение кишечной флоры для здоровья. Новый вывод состоял в том, что потребление препарата сначала приводило к увеличению числа полезных бактерий у здоровых индивидуумов и что наряду с таким увеличением происходило постепенное снижение числа вредных бактерий. В противоположность этому, картина, наблюдавшаяся у конституционно слабых индивидуумов, состояла в том, что сначала уменьшалось число вредных бактерий, а затем постепенно возрастало число полезных бактерий. В целом, средние изменения в количестве полезных и вредных бактерий отражались в возрастании числа полезных бактерий и соответствующем снижении числа вредных бактерий. Эта тенденция ускорялась через 3 месяца для Bifidobacterium, возрастая до 50% через 6 месяцев и до 110% через 1 год, а для Lactobacillus до 300% после 6 месяцев и до 950% через 1 год. Напротив, количество Clostridium снижалось на 70% через 6 месяцев и на 85% через 1 год, в то время как количество Veillonella снижалось на 67,5% через 6 месяцев и на 82,5% через 1 год.

Escherichia coli О-157, Salmonella enteritidis и Shigella flexneri выращивали без и совместно с Lactobacillus clearans (FERM BP-6973), для того чтобы определить влияние Lactobacillus clearans на патогенные микроорганизмы, и сравнивали полученные результаты. Среда для культивирования включала 10 г мясного экстракта, 10 г пептона, 2 г глюкозы, 2 г NaCl и 1 г СаСО₃ на литр, рН 7,2. Анаэробное культивирование осуществляли при 37^oС, субкультивирование повторяли каждые 72 часа, и в это же время содержимое чашек разводили и высевали мазок для определения изменения числа клеток, типа колонии с-исходыне колонии S-типа или мутированные R-типа с пониженной токсичностью, их соотношение и т.п. Патогенные микроорганизмы, используемые при тестировании, приобретали у Medic KK (зарегистрированный исследовательский институт санитарии).

В табл. 10 приведены результаты для Е. coli О-157, культивированной отдельно, а в табл.11 приведены результаты для смешанной культуры Е. coli О-157 и Lactobacillus clearans. Табл.10 показывает, что в культуре Е. coli О-157 число клеток являлось фактически постоянным (4-5•10⁹ клеток/г) во всех 20 субкультурах, причем R-тип не обнаружен. Табл.11 показывает, что в смешанных культурах Е. coli О-157 и Lactobacillus clearans произошли небольшие изменения в числе клеток Lactobacillus clearans, при этом в числе клеток Е. coli О-157 произошли существенные изменения. R-типы были обнаружены при 5-м субкультивировании, и относительное число R-типов возрастало по мере накопления последующих субкультур до тех пор, пока все клетки не образовали R-тип при 18-м субкультивировании. Реверсии в S-тип при последующем субкультивировании не происходило.

В табл. 12 приведены результаты, полученные для Salmonella enteritidis, культивированной отдельно, а в табл.13 приведены результаты, полученные для смешанных культур Salmonella enteritidis и Lactobacillus clearans. Табл.12 показывает, что в культурах Salmonella enteritidis число клеток составляло 3-5•10⁹ клеток/г. R-Типы появились спонтанно в 14-ой субкультуре, достигая относительного числа 5% в 20-ой субкультуре. Относительное количество возрастало в последующих субкультурах, достигая пика 23% в 50-ой субкультуре. После этого относительное количество R-типов оставалось примерно в 20%. Табл. 13 показывает, что в смешанных культурах Salmonella enteritidis и Lactobacillus clearans относительное количество R-типов составляло 29% в 5-ой субкультуре и что относительное количество R-типов возрастало по мере накопления следующих субкультур, достигая 50% в 10-ой субкультуре, 90% в 20-ой субкультуре и 100% в 47-ой субкультуре. Реверсия в S-тип в последующих субкультурах была менее 1%. После 70-ого субкультивирования все S-типы исчезли без дальнейшей реверсии.

В табл. 14 приведены результаты, полученные для Shigella flexneri, культивированной отдельно, а в табл.15 приведены результаты, полученные для смешанных культур Shigella flexneri и Lactobacillus clearans. Табл.14 показывает, что в культурах Shigella flexneri R-типы появились спонтанно в 10-ой субкультуре, достигая относительного числа 9% при 20-ом субкультивировании. Относительное количество возрастало в последующих субкультивированиях, достигая пика 20% при 40-ом субкультивировании. После этого относительное количество R-типов оставалось на уровне примерно 10-20%. Табл.15 показывает, что в смешанных культурах Shigella flexneri и Lactobacillus clearans R-типы появились в 5-ой субкультуре, и что относительное количество R-типов возрастало по мере накопления следующих субкультур, достигая 100% в 80-ой субкультуре. Реверсия в S-тип в последующих субкультурах имела место, но составляла менее 1%. После 108-ого субкультивирования все S-типы исчезли без дальнейшей реверсии.

Для исследования токсичности S- и R-типов Е. coli О-157, Salmonella enteritidis и Shigella flexneri группам из десяти 8-недельных самцов мышей интраперитонеально вводили •10⁸ клеток на животное. Были использованы консервированные штаммы в случае S-типов и штаммы, мутированные в R-типы до 100% в присутствии Lactobacillus clearans в случае R-типов. Результаты, приведенные в табл.16, показывают, что все животные погибали в течение 4 дней при заражении патогенными микроорганизмами S-типов, в то время как ни одно животное не погибло в случае R-типов, за исключением зараженных Shigella flexneri, приведшему к гибели на 7-ой день.

Йогурт, полученный с помощью описанной выше культуры Lactobacillus clearans, назначали перорально людям, и один раз в месяц проводили анализ крови для исследований изменений в кишечной флоре. Содержание холестерина и триглицеридов у 80% индивидуумов снижалось примерно на 10% по сравнению с содержанием до потребления йогурта.

Табл. 17 показывает различия в свойствах между Lactobacillus clearans настоящего изобретения и обычными штаммами Lactobacillus.

Enterococcus faecalis являются группой бактерий, содержащихся в кишечной флоре, и принадлежат к группе молочнокислых бактерий, обычно находящихся в количестве примерно 1•10⁷ клеток на грамм фекалий. Они существуют в двух формах - сферической или яйцевидной или в форме коротких цепей. Они являются грамположительными кокками, обладающими высокой устойчивостью к нагреванию, высушиванию, хлору, галловой кислоте и т.п., и растут в более широком, по сравнению с обычными стрептококками, интервале температур от 10 до 45^oС. Хотя существуют некоторые патогенные штаммы, они являются нетоксичными. Живые клетки действуют как ветрогонное средство и коммерчески доступны в Японии уже более 10 лет. Показано, что они нетоксичны при пероральном приеме. В отличие от коммерческих продуктов недавно было обнаружено, что живые и убитые клетки некоторых штаммов эффективно снижают содержание в крови холестерина и триглицеридов. Таким образом, они перспективны для предупреждения или лечения типичных заболеваний взрослых людей (заболеваний, возникающих вследствие образа жизни), таких как гиперлипидемия, гипертензия и артериосклероз. Enteriococcus faecalis в настоящем изобретении включает штаммы, обладающие такими свойствами.

Далее приводится пример способа получения живых клеток Enterococcus faecalis, пригодных для применения в настоящем изобретении. А именно, клетки, выращенные и центрифугированные обычным способом, суспендировали в физиологическом растворе, промывали, снова центрифугировали и собирали. Их можно лиофилизировать с использованием в качестве консерванта растворимого крахмала. Как пример способа получения убитых клеток Enteriococcus faecalis промытые и центрифугированные клетки, полученные при сборе вышеуказанных живых клеток, и растворимый крахмал можно обработать в течение 30 минут в нагретой до 100^oС воде и затем лиофилизировать.

Хотя Enterococcus faecalis не обладает активностью снижать содержание сульфида натрия (Na₂S•9H₂O) или аммиака in vitro, они обладают слабой дезодорирующей активностью против 10-кратно разведенных фекалий. В табл.18 приведены данные по дезодорирующей активности двух типичных штаммов Enterococcus faecalis, а именно FERM ВР-7230 и FERM ВР-7231. Тестирование проводили так же, как описано для Lactobacillus clearans, и критерии были такими же, какие указаны в табл.1.

Два типичных штамма Enterococcus faecalis вводили перорально в количестве 1•10⁹ клеток на человека в день. Запах фекалий до введения оценивали как 100. Запах фекалий определяли после 20-30 дней, 50-60 дней и 80-90 дней после введения, результаты приведены в табл. 19.

Для получения препарата получали живые и убитые клетки двух типичных штаммов Enterococcus faecalis, а именно FERM ВР-7230 и FERM ВР-7231, и смешивали живые и убитые клетки в равных частях. Препарат принимали в количестве 1•10⁹ клеток в день на человека в течение 6 месяцев и определяли изменения в числе клеток кишечной флоры во времени посредством измерения числа клеток (клетки/г фекалий) Bifidobacterium и Lactobacillus (за исключением Lactobacillus clearans), которые известны как типичные полезные бактерии, а также числа клеток типичных вредных бактерий, таких как Veillonella и Clostridium perfringens. В табл.20 приведены результаты при пероральном введении 10 здоровым индивидуумам. Табл. 20 показывает, что живые клетки обладали значительно большей степенью улучшения показателей, чем убитые клетки. Однако результаты оказались значительно менее выраженными для Lactobacillus clearans.

Получали смешанные культуры Escherchia coli О-157, Salmonella enteritidis и Shigella flexneri, чтобы исследовать влияние Enterococcus faecalis против патогенных микроорганизмов. Соотношения, в которых патогенные микроорганизмы мутировали из S-типов в R-типы, фактически были такими же, какие наблюдали при спонтанном мутировании. Число патогенных клеток постепенно снижалось с каждым субкультивированием до тех пор, пока клетки Salmonella enteritidis не исчезли при 25 субкультивировании, клетки Shigella flexneri исчезли при 33 субкультивировании и клетки Е. coli О-157 исчезли при 35 субкультивировании. Хотя такая картина предполагала, что рост Enterococcus faecalis превышал рост патогенных микроорганизмов, нельзя было исключить потенциальное продуцирование некоторых физиологически активных веществ, подавляющих патогенные микроорганизмы.

Вышеуказанные препараты живых и убитых клеток Enterococcus faecalis добавляли в корм в количестве 1•10⁹ клеток на грамм каждого вида корма. Мышей, выращенных в течение 3 месяцев на таком корме, и мышей, выращенных на обычном корме, сравнивали на содержание в сыворотке триглицеридов и холестерина. Мышей делили на группы по 10 особей и давали свободный доступ к корму. Триглицериды и холестерин определяли с помощью Е-теста Wako и С-теста Wako соответственно. Результаты приведены в табл.21. Табл.21 показывает, что у мышей, постоянно получавших с кормом или живые, или убитые клетки, имелось 20-40% снижение уровня обоих параметров, что не оставляет сомнения в эффективности препаратов.

Пятнадцать 8-недельных крыс со спонтанной гипертензией (SHR) делили на 3 группы. Животных в группах кормили кормом, содержащим препараты живых и убитых клеток Enterococcus faecalis в количестве 1•10⁹ клеток на грамм корма. Контрольная группа не получала каких-либо клеточных препаратов. Животных выращивали в течение 3 месяцев. В табл.22 приведены данные о кровяном давлении через 3 месяца. Табл.22 показывает приблизительно 10% снижение давления.

Примеры Совместное применение Lactobacillus clearans и Enterococcus faecalis позволило быстро получить удивительно эффективные результаты. Способы получения и примеры препаратов настоящего изобретения описаны ниже, однако объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами получения и рабочими примерами.

Пример получения 1 Получение препарата Lactobacillus clearans.

10 л среды, содержащей 5 г мясного экстракта, 5 г пептона, 3 г ацетата натрия, 1 мл аммиачной воды, 10 г глюкозы, 0,5 г цистина и 2 г дрожжевого экстракта на литр среды, инокулировали Lactobacillus clearans и анаэробно культивировали при 37^oС в течение 72 ч. Полученную культуру центрифугировали и получали 10 г биомассы. Биомассу дважды промывали 500 мл физиологического раствора и центрифугировали. Промытую биомассу вносили в 500 мл раствора, содержащего 50 г обезжиренного молока, 30 г трегалозы и 0, 5 г таурина, и тщательно перемешивали. Смесь лиофилизировали обычным способом и получали 82,5 г клеточного препарата (3•10⁹ клеток/г). Препарат смешивали с 330 г тщательно высушенного обезжиренного молока и получали препарат Lactobacillus clearans, содержащий 5•10⁸ живых клеток на грамм.

Пример получения 2 Получение препарата живых клеток Enterococcus faecalis.

10 л среды, содержащей 5 г мясного экстракта, 5 г пептона, 2 г хлорида натрия, 2 г дрожжевого экстракта и 10 г глюкозы на литр среды, инокулировали Enterococcus faecalis и анаэробно культивировали при 37^oС в течение 72 часов. Полученную культуру центрифугировали и получали 16 г биомассы. Биомассу дважды промывали 800 мл физиологического раствора и центрифугировали. Промытую биомассу вносили в 500 мл раствора, содержащего 20 г обезжиренного молока, 30 г растворимого крахмала и 0,5 г глутамата натрия, и тщательно перемешивали. Смесь лиофилизировали обычным способом и получали 54 г клеточного препарата (5•10⁹ клеток/г). Препарат смешивали с 486 г тщательно высушенного растворимого крахмала и получали препарат живых клеток Enterococcus faecalis, содержащий 5•10⁸ живых клеток на грамм.

Пример получения 3 Получение препарата убитых клеток Enterococcus faecalis.

Промытую биомассу, полученную в примере получения 2, суспендировали в 500 мл физиологического раствора, добавляли 50 г растворимого крахмала, раствор стерилизовали нагреванием при 110^oС в течение 15 минут, суспензию лиофилизировали обычным способом и получали 53 г клеточного препарата (приблизительно 5•10⁹ клеток/г). Препараты убитых клеток также можно получить посредством разрушения клеток ультразвуком или подобным способом.

Пример получения 4 Получение смешанного препарата Lactobacillus clearans и Enterococcus faecalis.

Препарат Lactobacillus clearans, полученный в примере получения 1, и препарат живых клеток Enterococcus faecalis, полученный в примере получения 2, или препарат убитых клеток Enterococcus faecalis, полученный в примере получения 3, смешивали в равных долях, и получали смешанный препарат. В этом случае препарат содержал Lactobacillus clearans в количестве 2,5•10⁸ клеток/г и Enterococcus faecalis в количестве 2,5•10⁸ клеток/г, но соотношение препаратов Lactobacillus clearans и Enterococcus faecalis можно изменять в процессе приготовления и получать смеси, содержащие любое желательное число клеток. Препарат может находиться в форме порошка, гранул, капсул или других обычных композиций с подходящим носителем.

Пример 1.

В пробирки (18 х180 мм) вносили 15 мл 10-кратно разведенных фекалий. Затем пробирки инокулировали образцом бактерий: 1) стерилизованных при высоком давлении в течение 15 минут при 120^oС и 2) нестерилизованных. Пробирки закрывали резиновыми пробками и анаэробно культивировали при 37^oС в течение 72 час. Затем шприцем отбирали 1 мл воздуха из пробирок и вносили его в 5-литровые пакеты для оценки запаха для тестирования запаха группой из 6 человек. Запах оценивали на основе критериев, приведенных в табл.1. В случае препаратов с убитыми клетками Enterococcus faecalis в пробирки добавляли 0,1 г препарата, полученного в примере получения 3. Результаты испытаний, приведенные в табл. 23, показывают, что запах фекалий существенно ослабевал, особенно, в случае разведенных фекалий, обработанных образцами, стерилизованными при высоком давлении. Это станет очевидным при сравнении с результатами, полученными в серии опытов при инокуляции только Lactobacillus clearans, приведенными в табл.2.

Пример 2.

10 индивидуумам постоянно давали комбинацию 1 г препарата живых клеток Enterococcus faecalis (FERM BP-7230) или 1 г препарата убитых клеток Enterococcus faecalis (FERM BP-7230) и 100 мл йогурта, приготовленного с помощью Lactobacillus clearans FERM ВР-6973, из среды, содержащей 100 г обезжиренного молока, 50 г сахарозы и 2 г агара на литр, и постоянно определяли запах фекалий после 20-30 дней, 50-60 дней и 80-90 дней приема. Результаты определяли посредством введения 0,5 г образцов фекалий в 20-литровые пакеты для оценки запаха, которые хранили при комнатной температуре для оценки запаха группой из 6 человек через 30 минут. Средний запах фекалий 5 индивидуумов, не употреблявших йогурт, принимали за 100. Средние величины, приведенные в табл.24, показывают, что пероральное введение препарата существенно ослабляет запах фекалий во времени. Через 90 дней приема запах существенно ослабел и в дальнейшем не изменялся. Заметное влияние станет очевидным при сравнении с результатами, полученными при приеме одной Lactobacillus clearans, приведенными в табл.3.

Пример 3.

Таким же способом, как в примере 1, пробирки с 10-кратно разведенными фекалиями инокулировали образцом бактерий: 1) стерилизованных при высоком давлении в течение 15 минут при 120^oС и 2) нестерилизованных. Пробирки закрывали резиновыми пробками и анаэробно культивировали при 37^oС в течение 72 час. Затем культуры центрифугировали, от каждой отбирали 5 мл супернатанта, разводили в 10 раз и в полученных 50 мл раствора определяли концентрацию свободных ионов серы (S²⁺) и ионов аммония (NH₄ ⁺). Также методом газовой хроматографии определяли концентрацию низших жирных кислот. Результаты измерений приведены в таблицах 25 и 26. Таблицы показывают, что содержание типичных для фекалий веществ снижается в высокой степени (на 70-90%) как в случае образцов, стерилизованных при высоком давлении, так и нестерилизованных. Степень снижения станет очевидной при сравнении с результатами, полученными при инокуляции только Lactobacillus clearans, приведенными в таблицах 6 и 7.

Пример 4.

20 здоровым индивидуумам и 20 конституционно слабым индивидуумам постоянно, в течение 6 месяцев, давали препарат Lactobacillus clearans (1 г, 5•10⁸ клеток/г), содержащий смесь равных частей трех типичных штаммов Lactobacillus clearans, a именно FERM BP-6972, FERM ВР-6971 и FERM ВР-6973, и 1 г препарата живых клеток Enterococcus faecalis (5•10⁸ клеток/г), Enterococcus faecalis FERM BP-7230 или 1 г препарата убитых клеток Enterococcus faecalis (5•10⁸ клеток/г), Enterococcus faecalis FERM BP-7231. Кишечную флору определяли во времени, и результаты приведены в таблицах 27 и 28. Таблицы показывают, что пероральный прием живых или убитых клеток Enterococcus faecalis в смеси с Lactobacillus clearans быстрее увеличивает количество полезных бактерий и сокращает количество вредных бактерий, чем при введении одной Lactobacillus clearans, как показано в таблицах 8 и 9. Иначе говоря, улучшения у здоровых индивидуумов, выразившиеся в 10-50% возрастании числа полезных бактерий и 20-40% снижении числа вредных бактерий, происходили на 25% быстрее. У конституционно слабых индивидуумов улучшения, выразившиеся в 10-30% возрастании числа полезных бактерий и 20-50% снижении числа вредных бактерий, происходили на 30% быстрее. Таким образом, можно сделать вывод, что улучшение в кишечной флоре было более эффективным у конституционно слабых индивидуумов.

Пример 5.

Живые клетки Enterococcus faecalis добавляли к смешанным культурам Lactobacillus clearans, E. coli O-157, Salmonella enteritidis или Shigella flexneri для анаэробного культивирования при 37^oС и субкультивирование повторяли каждые 72 часа, в это время образцы разбавляли и брали мазки для определения изменений числа клеток и степени S-R мутации E. coli О-157, Salmonella enteritidis и Shigella flexneri. Результаты приведены в таблицах 29, 30, 31, 32, 33 и 34. Использовали штамм FERM BP-6973 Lactobacillus clearans, а также штамм FERM ВР-7231 Enterococcus faecalis. Добавляли вышеуказанный препарат убитых клеток Enterococcus faecalis в количестве 1 г на литр среды. Среда, используемая для культивирования, содержала 10 г мясного экстракта, 10 г пептона, 2 г глюкозы, 2 г NaCl и 1 г СаСО на литр при рН 7,2, стерилизацию проводили при высоком давлении в течение 15 минут при 120^oС. Таблицы, представленные ниже, показывают, что инокуляция патогенных микроорганизмов, таких как E. coli O-157, Salmonella enteritidis и Shigella flexneri, Lactobacillus clearans и живыми клетками Enterococcus faecalis приводит к быстрому снижению числа клеток этих патогенных микроорганизмов и их мутации в R-типы в ходе субкультивирования. E. coli O-157 мутировала в R-тип на 100% при 13-м субкультивировании и исчезала при 15-м субкультивировании. Salmonella enteritidis и Shigella flexneri исчезали ранее достижения 100% мутации в R-тип при 13-м и 15-м субкультивировании соответственно. При использовании одной Lactobacillus clearans, как показано в таблицах 11, 13 и 15, эти патогенные микроорганизмы мутировали в R-типы в ходе многочисленных пересевов, но число бактерий оставалось постоянным (1-3•10⁹ клеток/мл), и они не исчезали. Хотя добавление Lactobacillus clearans и убитых клеток Enterococcus faecalis к вышеуказанным патогенным микроорганизмам показало ту же тенденцию, которая преобладает при инокуляции живых клеток, мутация в R-типы была слабее, чем преобладающая при инокуляции живых клеток, и число клеток снижалось, но клетки не исчезали. Тем не менее, число субкультивирований, приводивших к 100% мутации в R-типы, составило 15 для Е. coli О-157, 30 для Salmonella enteritidis и 15 для Shigella flexneri, что значительно быстрее, чем при инокуляции одной Lactobacillus clearans.

Пример 6.

Препарат живых клеток Lactobacillus clearans FERM BP-6972 или Lactobacillus clearans FERM BP-697, полученный способом, описанным в примере получения 1, препарат живых клеток Enterococcus faecalis FERM BP-7230 или Enterococcus faecalis FERM BP-7231, полученный способом, описанным в примере получения 2, и препарат убитых клеток Enterococcus faecalis FERM BP-7230 или Enterococcus faecalis FERM BP-7231, полученный способом, описанным в примере получения 3, объединяли и добавляли в корм, который давали группам мышей из пяти 10-недельных самцов. В 1 г корма содержалось •10⁸ клеток Lactobacillus clearans и 5•10⁸ клеток Enterococcus faecalis (по 2,5•10⁸ живых и убитых клеток, если они использовались в сочетании). Животным предоставляли свободный доступ к корму в течение 3 месяцев. Определяли содержание триглицеридов и холестерина в сыворотке и сравнивали с содержанием у контрольных мышей, питавшихся только обычным кормом. Содержание триглицеридов измеряли методом Е-теста Wako на триглицериды, а содержание холестерина измеряли методом С-теста Wako на триглицериды. Получали среднее содержание для каждой группы. Среднее содержание у мышей контрольной группы принимали за 100%. Результаты приведены в табл.35. Таблицы 35 и 21 показывают, что добавление к Lactobacillus clearans живых или убитых клеток, также как и живых и убитых клеток Enterococcus faecalis, обладающих способностью снижать содержание триглицеридов и холестерина, значительно эффективнее, чем введение одной Enterococcus faecalis. В отличие от результатов, полученных при введении клеток одного вида, комбинированное применение с убитыми клетками приводит к большему эффекту, чем с живыми клетками. По сравнению с контрольной группой указанные уровни снижались примерно как 1/2.

Пример 7.

Семь групп крыс со спонтанной гипертензией (SHR), включающих в целом тридцать пять 8-недельных самцов, выращивали в течение 7 месяцев на корме, содержащем клеточные препараты примера 6. Измеряли кровяное давление до и после введения группам каждого клеточного препарата и в контрольной группе, получили результаты, приведенные в табл.36. Таблицы 36 и 22 показывают, что кровяное давление через 3 месяца улучшилось в среднем примерно на 15%. Убитые клетки Enterococcus faecalis действовали более эффективно, чем живые клетки, как и в примере 6. Падение кровяного давления составляло примерно 10-20% - лучше, чем результаты, полученные при введении одной Enterococcus faecalis.

Табл. 37 показывает влияние в плане различных свойств при применении Lactobacillus clearans, Enterococcus faecalis и обоих видов бактерий.

Сохранение здоровья и подходы к этому вопросу постепенно изменились в нашем все более стареющем обществе. В настоящее время, когда лечению острых и хронических заболеваний придается существенное значение, уже происходит и будет продолжаться в ближайшем будущем перемещение к "профилактической медицине" и даже к "питательной терапии", в свете старения нашего общества. Не существует видов лечения, которые предпринимаются после начала заболевания. Скорее подходы для созидания собственного здоровья через грамотное питание в настоящее время все в большей степени направлены, в основном, на предупреждение заболеваний естественным путем. Не станет преувеличением предположение, что предупреждение болезни, чтобы вовсе избежать лечения, является передовым направлением для 21-ого века.

Пероральное введение препарата молочнокислых бактерий настоящего изобретения постепенно расширяет влияние полезных кишечных бактерий, устойчиво защищает слизистую кишечника, продуцирует витамины и синтезирует аминокислоты, причем под влиянием препарата молочнокислых бактерий происходит подавление роста чужеродных бактерий и чужеродных патогенных микроорганизмов, снижение их токсичности и активация иммунных функций. В итоге заметно снижается число вредных бактерий, и подавляется образование дурно пахнущих веществ гниения, что приводит к существенной дезодорации фекалий. Как при энергичном натиске, молочнокислые бактерии препарата активно кормятся гниющими в кишечнике веществами, что приводит к более чистой кишечной среде и нормализации слизистой оболочки кишечника и окружающих сосудов и нервов.

Очистка кишечника, являющегося источником жизнеспособности человека, энергии, крови и полноты, приводит к более хорошему поглощению жизненно важных веществ и, напротив, к меньшему поглощению токсичных веществ в кишечнике. Это неизбежно приводит к улучшению функции печени и, таким образом, к меньшему содержанию триглицеридов и холестерина в сыворотке, а также к более чистой крови. Такая оживленная кровь приводит к снижению кровяного давления, так что не блокируется распределение жизненно важных веществ, таких как гормоны, ферменты, антитела и иммунологические вещества, по всему организму. Таким образом, улучшается метаболизм и укрепляются все системные функции. То есть, загрязненный кишечник очищается и возвращается к своему первоначальному состоянию, что приводит к улучшению состояния здоровья без признаков заболевания. Можно сказать, что доктрина Мечникова о долголетии реализовывается в настоящее время, на век позднее.

Препарат молочнокислых бактерий настоящего изобретения можно хранить без потери титра в течение 2-3 лет, что позволяет производить его в форме товаров, удобных для перевозки, которые можно легко использовать где угодно в любое время, что очень важно. В обществе с населением все более пожилого возраста возможно, что все больше и больше пожилых людей станут слабыми; и если даже удаление отходов может стать проблемой, дезодорация таких отходов сделает эту задачу менее неприятной и может помочь рабочим очистных сооружений (caretakers).

Формула изобретения

1. Препарат молочнокислых бактерий, содержащий живые клетки Lactobacillus clearans и живые клетки Enterococcus faecalis, способный снижать содержание, по меньшей мере, одного или нескольких веществ из числа триглицеридов и холестерина.

2. Препарат молочнокислых бактерий, содержащий живые клетки Lactobacillus clearans и убитые клетки Enterococcus faecalis, способный снижать содержание, по меньшей мере, одного или нескольких веществ из числа триглицеридов и холестерина.

3. Препарат молочнокислых бактерий, содержащий живые клетки Lactobacillus clearans и живые и убитые клетки Enterococcus faecalis, способный снижать содержание, по меньшей мере, одного или нескольких веществ из числа триглицеридов и холестерина.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30