Способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина

 

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к получению высокоочищенных монокомпонентных инсулинов различного происхождения. Сущность изобретения: инсулин-сырец подвергают двум колоночным обращенно-фазовым хроматографическим очисткам - при рН 1,5 - 4,5 и рН 6,5 - 9,5. Очистка проводится на неполярных сорбентах со средним размером пор и размером частиц 10 - 100 мкм. В качестве элюента применяют водно-органические растворители, содержащие ионные модификаторы. Процесс хроматографической очистки ведут при температуре 5 - 30^oС. Технический результат: способ обеспечивает получение инсулина высокого качества, содержащего не менее 98,5% основного вещества, не более 0,5% дезамидо-А21-инсулина, не более 1,0% неидентифицированных примесей, не более 1,0 млн^-1 проинсулина. 14 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к способу получения высокоочищенных монокомпонентных инсулинов: свиного, человеческого полусинтетического, человеческого генно-инженерного, применяемых для лечения сахарного диабета.

Современные требования к качеству высокоочищенного монокомпонентного инсулина очень высокие: содержание проинсулина, определенное методом радиоиммунологического анализа (далее по тексту РИА), не должно превышать 1,0 p.p.m. (0,0001%), содержание неидентифицированных примесей, определенное методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее по тексту ВЭЖХ) не должно превышать 1,0%, содержание дезамидо-А21-инсулина не более 1,0% (ВЭЖХ).

Известны способы [1, 2, 3, 4, 5] получения высокоочищенного инсулина, которые базируются на использовании ионообменной и гельпроникающей хроматографической очистки инсулина. Однако описанные способы не позволяют получить инсулин с содержанием основного вещества более 97% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина менее 1 p.p.m. (РИА). При этом выход не превышает 60%.

Известен способ [6] очистки инсулина на слабокислых ионитах с гидрофобной оболочкой в водно-органических растворителях при значениях рН от 1,5 до 5,5. Благодаря использованию двух механизмов адсорбции по данному способу достигается более глубокая очистка инсулина от примесей с изоэлектрической точкой pI более 6,5: аргинининсулинов, проинсулина и др. Однако при этом снижается эффективность очистки от примесей с рI менее 4,5: дезамидо-А21-инсулина, дезамидо-В3-инсулинов. В результате чистота полученного инсулина не превышает 96% (ВЭЖХ).

Наиболее близким к предлагаемому является способ [7] получения высокоочищенного инсулина, который сочетает использование жидкостной ионообменной хроматографии, обращенно-фазовой (далее по тексту ОФ) хроматографии при значении рН около 3,0 и гельпроникающей хроматографии. Данный способ позволяет получать инсулин с содержанием основного вещества более 98% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина менее 4 p.p.m. (РИА) при выходе от 60 до 65%. Однако из-за низкой селективности по таким примесям, как моноаргинининсулин, диаргинининсулин, сложноэфирные производные инсулина, дезамидо-В3-инсулины, дез-В30-инсулин уровень примесей в целом остается достаточно высоким. По этой же причине по данному способу используются очень невысокие нагрузки инсулина на хроматографические колонки при обращенно-фазовой хроматографии: от 13 до 15 г/л сорбента.

Целью изобретения является повышение выхода и улучшение качества инсулина при хроматографической очистке.

Для выполнения поставленной задачи исходный инсулин-сырец, с содержанием основного вещества не менее 85% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина не более 50 тыс. p. p. m. (РИА) последовательно подвергают двум хроматографическим очисткам: ОФ колоночной хроматографической очистке при значении рН от 1,5 до 4,5 и ОФ колоночной хроматографической очистке при значении рН от 6,5 до 9,5. Порядок проведения первой и второй ОФ хроматографической очистки может быть произвольным. Улучшение качества достигается за счет того, что при ОФ хроматографической очистке при значении рН от 6,5 до 9,5 по сравнению с ОФ хроматографической очисткой при значении рН от 1,5 до 4,5 происходит инверсия порядка выхода и улучшение селективности по целому ряду примесей (аргинининсулинам, дезамидо-В3-инсулину, дез-В30-инсулину и ряду других примесей) и улучшение селективности по дезамидо-А21-инсулину. Таким образом отпадает необходимость в проведении малопроизводительной ионообменной хроматографической очистки. Очистка проводится на неполярных макропористых сорбентах: модифицированных силикагелях (С-8, С-18) или полимерных сорбентах со средним диаметром пор и с размером частиц от 10 до 100 мкм. Максимальная эффективность очистки достигается при использовании сферических монодисперсных сорбентов со средним размером пор с размером частиц от 10 до 15 мкм, упакованных в хроматографические колонки с динамическим аксиальным сжатием сорбента. Высота слоя сорбента в хроматографической колонке от 10 до 60 см, предпочтительно от 25 до 40 см. В качестве элюента применяют водно-органические растворители со значением рН от 1,5 до 4,5 (предпочтительно от 2,3 до 2,8) и от 6,5 до 9,5 (предпочтительно от 7,3 до 8,0) и содержащие ионные модификаторы: органические и неорганические кислоты, основания и их соли с молярной концентрацией от 0,001 до 0,3 моль/л. Предпочтительно использовать кислоты: уксусную, трифторуксусную, ортофосфорную, соляную; основания: трис(оксиметил)аминометан (далее по тексту ТРИС), аммиак, гидроокись натрия и их соли. Значение рН элюентов устанавливают добавлением необходимого количества кислот и оснований. В качестве органического растворителя применяют ацетонитрил, спирты; предпочтительно использовать ацетонитрил, метанол, этанол, пропанол-2 при первой и этанол при второй хроматографических очистках. Процесс хроматографической очистки и кристаллизации инсулина проводят при температуре от 5 до 30^oС, предпочтительно от 10 до 20^oС.

По предлагаемому способу получают высокоочищенный монокомпонентный инсулин с содержанием основного вещества более 98,5%, с содержанием дезамидо-А21-инсулина менее 0,5%, с содержанием неидентифицированных примесей менее 1,0% (ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина менее 1 p.p.m. (РИА), при этом выход составляет не менее 70% при использовании нерегулярных сорбентов с размером частиц от 50 до 100 мкм и не менее 75% при использовании сферических сорбентов с размером частиц от 10 до 15 мкм в колонках с динамическим аксиальным сжатием сорбента.

Для проведения первой ОФ хроматографической очистки при значении рН от 1,5 до 4,5 исходный инсулин-сырец растворяют в стартовом элюенте А, содержащем от 10 до 30 объемных % органического растворителя, значение рН при необходимости устанавливают добавлением необходимого количества раствора соляной кислоты с массовой долей от 5 до 10%. Концентрация инсулина в растворе от 10 до 50 г/л. Нагрузка на хроматографическую колонку от 15 до 50 г на один литр сорбента. Перед вводом раствора инсулина в хроматографическую колонку его фильтруют через гидрофильный мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм. Хроматографическая колонка перед вводом инсулина должна быть предварительно уравновешена стартовым элюентом А в объеме, равном от трех до пяти объемов сорбента в колонке. Ввод раствора инсулина в хроматографическую колонку осуществляют с линейной скоростью потока от 0,25 см/мин (для сорбентов с размером частиц 50-100 мкм) до 1,5 см/мин (для сорбентов с размером частиц 10-15 мкм). После ввода раствора инсулина хроматографическую колонку промывают стартовым элюентом А в объеме, равном объему сорбента в хроматографической колонке. Элюируют инсулин, используя непрерывный или ступенчатый градиент по концентрации органического растворителя, крутизна непрерывного градиента от 0,5 до 3 (предпочтительно от 0,8 до 1,5) объемных % органического растворителя на объем элюента, равный объему сорбента в хроматографической колонке. Линейная скорость потока при элюции от 0,5 см/мин (для сорбентов с размером частиц 50-100 мкм) до 3 см/мин (для сорбентов с размером частиц 10-15 мкм). Контроль за элюцией инсулина осуществляют по адсорбции света при длине волны 276 нм. Элюат разбивают на фракции объемом, равном примерно 0,25 объема сорбента в колонке. В каждой фракции методом ВЭЖХ определяют содержание примесей. По результатам анализа формируют три пула: пул 1 - фракции с содержанием примесей более 40%, пул 2 - фракции с содержанием примесей от 3 до 40%, пул 3 - фракции с содержанием примесей менее 3%. Пул 3 содержит высокоочищенный инсулин с содержанием примесей от 2 до 3%, который является полупродуктом для второй хроматографической очистки. Пул 2 содержит инсулин с содержанием примесей от 7 до 12%, который подвергают рехроматографии при тех же режимах, что и исходный инсулин-сырец; полученный после рехроматографии высокоочищенный инсулин с содержанием примесей менее 3% присоединяют к пулу 3. Пул 1, содержащий от 40 до 65% примесей, направляют в отходы.

После окончания процесса очистки инсулина хроматографическую колонку регенерируют элюентом, содержащем от 60 до 80% органического растворителя в объеме, равном от трех до пяти объемов сорбента в хроматографической колонке, и уравновешивают тем же объемом стартового элюента А. Выход при первой хроматографической очистке от 83 до 86%. Высокоочищенный инсулин, содержащийся в пуле 3, кристаллизуют в цитратном буферном растворе. Для этого элюат разбавляют дистиллированной водой для снижения концентрации органического растворителя до 10-20 объемных % (10% при использовании ацетонитрила, пропанола-2 и 20% при использовании этанола, метанола), добавляют раствор хлорида цинка с массовой долей 10% из расчета 0,75-0,80 мл на 1 г инсулина и раствор лимонной кислоты с молярной концентрацией 1,5 моль/л из расчета 34-35 мл на 1 л разбавленного элюата. Затем в кристаллизационном растворе раствором аммиака с массовой долей 10-12,5% при постоянном перемешивании устанавливают значение рН от 6,8 до 7,0, продолжают перемешивание в течение 1-2 ч. Далее раствором кислоты соляной с массовой долей 5-10% в кристаллизационном растворе при постоянном перемешивании постепенно в течение 1-2 ч устанавливают значение рН от 5,9 до 6,1 и продолжают перемешивание еще в течение 4-6 ч. Полученные кристаллы высокоочищенного инсулина отделяют от маточного раствора, промывают дистиллированной водой и передают на вторую хроматографическую очистку. Потери инсулина при кристаллизации от 1 до 3%.

Для проведения второй ОФ хроматографической очистки при значении рН от 6,5 до 9,5 высокоочищенный инсулин-полупродукт, выделенный из пула 3, растворяют в стартовом элюенте В, содержащем от 10 до 30 объемных % органического растворителя. Для связывания ионов цинка в раствор инсулина добавляют раствор трилона Б с молярной концентрацией 0,1 моль/л из расчета 0,5 мл на 1 г инсулина. Значение рН при необходимости корректируют раствором аммиака с массовой долей 10-12,5%. Концентрация инсулина в растворе от 10 до 30 г/л. Нагрузка на хроматографическую колонку от 15 до 50 г на один литр сорбента. Перед вводом раствора инсулина в хроматографическую колонку его фильтруют через гидрофильный мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм. Хроматографическая колонка перед вводом раствора инсулина должна быть предварительно уравновешена стартовым элюентом В в объеме, равном от трех до пяти объемов сорбента в колонке. Ввод раствора инсулина в хроматографическую колонку осуществляют с линейной скоростью потока от 0,25 см/мин (для сорбентов с размером частиц 50-100 мкм) до 1,5 см/мин (для сорбентов с размером частиц 10-15 мкм). После ввода раствора инсулина хроматографическую колонку промывают стартовым элюентом В в объеме, равном объему сорбента в хроматографической колонке. Элюируют инсулин, используя непрерывный или ступенчатый градиент по концентрации органического растворителя, крутизна непрерывного градиента от 0,5 до 3 (предпочтительно от 0,8 до 1,5) объемных % органического растворителя на объем элюента, равный объему сорбента в хроматографической колонке. Линейная скорость потока при элюции от 0,5 см/мин (для сорбентов с размером частиц 50-100 мкм) до 3 см/мин (для сорбентов с размером частиц (10-15 мкм). Контроль за элюцией инсулина осуществляют по адсорбции света при длине волны 276 нм. Элюат разбивают на фракции объемом, равным примерно 0,25 объема сорбента в хроматографической колонке. В каждой фракции методом ВЭЖХ определяют содержание примесей. По результатам анализа формируют три пула: пул 4 - фракции с содержанием примесей более 20%, пул 5 - фракции с содержанием примесей от 1 до 20% и пул 6 - фракции с содержанием примесей менее 1%. Пул 4, содержащий от 30 до 45% примесей отправляют в отходы. Пул 6 содержит высокоочищенный монокомпонентный инсулин с содержанием примесей менее 1%. Пул 5 содержит инсулин с содержанием примесей от 2 до 5%, который подвергают рехроматографии при тех же режимах, что и инсулин, выделенный из пула 3, за исключением нагрузки, которая должна быть от 15 до 30 г на один литр сорбента в колонке. Полученный после рехроматографии пула 5 высокоочищенный монокомпонентный инсулин с содержанием примесей менее 1% присоединяют к пулу 6. После окончания процесса очистки инсулина хроматографическую колонку регенерируют элюентом, содержащим от 60 до 80% органического растворителя в объеме, равном от трех до пяти объемов сорбента в хроматографической колонке и уравновешивают тем же объемом стартового элюента В. Выход при второй хроматографической очистке от 91 до 94%. Высокоочищенный монокомпонентный инсулин, содержащийся в пуле 6, кристаллизуют в цитратном буферном растворе. Для этого элюат разбавляют дистиллированной водой до снижения концентрации органического растворителя до 10-20 объемных% (10% при использовании ацетонитрила, пропанола-2 и 20% при использовании этанола, метанола), добавляют раствор цитрата аммония с молярной концентрацией 1,5 моль/л и со значением рН от 7,5 до 8,5 из расчета 34-35 мл на один литр разбавленного элюата и раствор хлорида цинка с массовой долей 10% из расчета 0,75-0,80 мл на 1 г инсулина. Полученный кристаллизационный раствор фильтруют через стерилизующий гидрофильный мембранный фильтр с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм. Затем в кристаллизационном растворе инсулина раствором кислоты соляной с массовой долей 5-10% при постоянном перемешивании сначала устанавливают значение рН от 6,8 до 7,0, а после 1-2 ч выдержки рН постепенно в течение 1-2 ч доводят до значения от 5,9 до 6,1 и продолжают перемешивание еще в течение 4-6 ч. Полученные кристаллы высокоочищенного монокомпонентного инсулина отделяют от маточного раствора, промывают дистиллированной водой, этанолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы. Потери инсулина при кристаллизации от 1 до 2%. Получают высокоочищенный монокомпонентный инсулин, содержащий не более 1% неидентифицированных примесей, не более 0,5% дезамидо-А21-инсулина (ВЭЖХ) и не более 1 p.p.m. проинсулина (РИА). Выход при очистке по предлагаемому способу от 70 до 80%.

Пример 1. Процесс хроматографической очистки инсулина проводят при температуре 11^oС. 110 г по технической массе (100 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца, содержащего 3,5% дезамидо-А21-инсулина и 9% примесей растворяют в 1,8 л стартового элюента А, содержащего ацетат аммония с молярной концентрацией 0,020 моль/л, пропанол-2 с концентрацией 10 объемных % и со значением рН 2,5, значение рН раствора инсулина и элюента корректируют раствором кислоты соляной с массовой долей 10%. Полученный раствор инсулина фильтруют под избыточным давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG (фирма Pall) с диаметром 293 мм и с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,2 л стартового элюента А. Получают около 2 л раствора инсулина.

В хроматографическую колонку Superformance 500-100 (фирма Merck) с внутренним диаметром 10 см и высотой 50 см загружают 1 кг нерегулярного силикагеля С18 фирмы Amicon Matrex С18-100-50 (размер частиц 50 мкм, размер пор ). Колонку собирают и верхним подвижным адаптером сжимают слой сорбента. Затем через колонку в течение 15 мин пропускают пропанол-2 с линейной скоростью потока 5,1 см/мин (при этом давление на колонке не должно превышать 8 bar) и при необходимости опять верхним адаптером сжимают слой сорбента. Получают слой сорбента высотой 25,5 см и объемом 2 л. Для уравновешивания через колонку пропускают 8 л стартового элюента А.

Процесс очистки инсулина ведут на жидкостном хроматографе Gilson (фирма Gilson), укомплектованного насосами модели 305, 306 с головками 200 Wti, демпфером давления модели 807, фотометрическим УФ-детектором модели 112 и коллектором фракций FC-30 (фирма Fharmacia Biotech).

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 0,25 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 2 л стартового элюента А. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 0,5 см/мин в линейном градиенте концентрации пропанола-2 от 15 до 30 объемных % в течение 8 ч. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента А и элюента, содержащего ацетат аммония с молярной концентрацией 0,020 моль/л, пропанол-2 с концентрацией 30 объемных % и со значением рН 2,5. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим ацетат аммония с молярной концентрацией 0,020 моль/л, пропанол-2 с концентрацией 60 объемных % и со значением рН 2,5, который подают с линейной скоростью потока 1,27 см/мин в течение 80 мин. Элюат, содержащий белок, дробят на фракции объемом 0,5 л каждая. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 1 содержит 12 г белка (7,5 л элюата с концентрацией белка 1,6 г/л) следующего состава: инсулина - 48,3%, дезамидо-А21-инсулина - 6,7%, примесей - 45%. Пул 2 содержит 13 г белка (4,33 л элюата с концентрацией белка 3 г/л) следующего состава: инсулина - 85,1%, дезамидо-А21-инсулина - 4,0%, примесей - 10,9%. Пул 3 содержит 75 г белка (8,33 л элюата с концентрацией белка 9,0 г/л) следующего состава: инсулина - 94,2%, дезамидо-А21-инсулина - 2,9%, примесей - 2,9%. Пул 1 передают в отходы. Пул 2 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superformance 500-50 с внутренним диаметром 5 см, упакованную 0,45 л нерегулярного силикагеля С18 Matrex С18 - 100-20 с размером частиц 20 мкм. После рехроматографии пула 2 получают дополнительно 9,4 г инсулина (1,15 л элюата с концентрацией белка 8,17 г/л) следующего состава: инсулина - 94,3%, дезамидо-А21-инсулина - 2,7%, примесей - 3,0%. Элюат после рехроматографии пула 2 присоединяют к пулу 3. Получают 84,4 г инсулина в 9,48 л элюата с концентрацией 8,9 г/л. Концентрация пропанола-2 в элюате 17,5 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 7,11 л дистиллированной воды, 65 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%, 0,57 л раствора лимонной кислоты с молярной концентрацией 1,5 моль/л и раствор аммиака с массовой долей 10% до значения рН 6,8. Раствор перемешивают в течение 90 мин, затем доводят значение рН до 5,9 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 120 мин. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего отделяют кристаллы инсулина от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor N₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 293 мм и размером пор 0,8 мкм и промывают дистиллированной водой в количестве 200 мл. Получают 82,7 г инсулина в пересчете на сухое вещество следующего состава: инсулина свиного - 94,2%, дезамидо-А21-инсулина - 2,9%, неидентифицированных примесей - 2,9% (ВЭЖХ), содержание проинсулина - 8,2 p.p.m. (РИА).

Для второй хроматографической очистки используют те же упакованные хроматографические колонки, что и при первой хроматографической очистке: Superfоrmance 500-100 и Superformance 500-50 и тот же жидкостной хроматограф Gilson.

Полученные кристаллы инсулина после первой хроматографической очистки (82,7 г в пересчете на сухое вещество) растворяют в 2,5 л стартового элюента В, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,02 моль/л, этанол с концентрацией 20 объемных % и со значением рН 7,6, значение рН корректируют раствором кислоты соляной с массовой долей 10%. При растворении инсулина в элюент В до корректировки значения рН добавляют 41,4 мл раствора трилона Б с молярной концентрацией 0,10 моль/л. Полученный раствор инсулина фильтруют под давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG с диаметром 293 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,3 л стартового элюента В. Получают около 2,9 л раствора инсулина.

Перед вводом раствора инсулина хроматографическую колонку Superformance 500-100 предварительно уравновешивают. Для этого через колонку пропускают 8 л стартового элюента В с линейной скоростью потока 1,27 см/мин.

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 0,25 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 2 л стартового элюента В. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 0,5 см/мин в линейном градиенте концентрации этанола от 25 до 37,5 объемных % в течение 8 ч. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента В и элюента, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,02 моль/л, этанол с концентрацией 50 объемных % и со значением рН 7,6. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор ТРИС с молярной концентрацией 0,020 моль/л и этанол с концентрацией 70 объемных %, который подают с линейной скоростью потока 1,27 см/мин в течение 80 мин. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 4 содержит 4,1 г белка (5 л элюата с концентрацией белка 0,82 г/л) следующего состава: инсулина - 46,7%, дезамидо-А21-инсулина - 19,3%, примесей - 34%. Пул 5 содержит 13,2 г белка (3,8 л элюата с концентрацией белка 3,47 г/л) следующего состава: инсулина - 85,4%, дезамидо-А21-инсулина - 11,1%, примесей - 3,5%. Пул 6 содержит 65,3 г белка (7,9 л элюата с концентрацией белка 8,27 г/л) следующего состава: инсулина - 98,8%, дезамидо-А21-инсулина - 0,3%, примесей - 0,9%. Пул 4 передают в отходы производства. Пул 5 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superfоrmance 500-50, упакованную 0,45 л нерегулярного силикагеля С18 Matrex С18 - 100-20 с размером частиц 20 мкм. После рехроматографии пула 5 получают дополнительно 9,9 г инсулина (1,4 л элюата с концентрацией белка 7,07 г/л) следующего состава: инсулина - 98,1%, дезамидо-А21-инсулина - 1,0%, примесей - 0,9%. Элюат после рехроматографии пула 5 присоединяют к пулу 6. Получают 75,2 г инсулина в 9,3 л элюата с концентрацией белка 8,09 г/л. Концентрация этанола в элюате 33,5 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 5,28 л дистиллированной воды, 0,54 л раствора цитрата аммония с молярной концентрацией 1,5 моль/л и 58 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%. Полученный кристаллизационный раствор фильтруют под давлением 1 bar через стерилизующий мембранный фильтр Bio-Inert NRL (фирма Pall) с диаметром 293 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 1,0 л дистиллированной воды, промывную воду присоединяют к кристаллизационному раствору. В кристаллизационном растворе при перемешивании раствором кислоты соляной с массовой долей 5% устанавливают значение рН 6,9. Раствор перемешивают в течение 90 мин. Затем доводят значение рН до 6,0 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 2 ч. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего кристаллы инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor ₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 293 мм и с размером пор 0,8 мкм. Кристаллы инсулина промывают 100 мл дистиллированной воды, затем трижды этанолом порциями по 100 мл. Сушку кристаллов инсулина осуществляют в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы. Потеря массы при высушивании 9,0%. Получают 81,9 г по технической массе (74,5 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 98,7%, дезамидо-А21-инсулина - 0,4%, неидентифицированных примесей - 0,9% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина - 0,7 p.p.m. (РИА). Выход 74,5%.

Пример 2. Процесс хроматографической очистки инсулина проводят при температуре 20^oС. 5,2 г по технической массе (4,8 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца, содержащего 4,3% дезамидо-А21-инсулина и 8,7% примесей растворяют в 0,150 л стартового элюента А, содержащего раствор уксусной кислоты с молярной концентрацией 0,25 моль/л, ацетонитрил с концентрацией 17,5 объемных %, значение рН в растворе инсулина доводят до 2,7 раствором кислоты соляной с массовой концентрацией 10%. Полученный раствор инсулина фильтруют под избыточным давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG (фирма Pall) с диаметром 47 мм и с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,010 л стартового элюента А. Получают около 0,17 л раствора инсулина.

65 г сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8 (фирма АРО) с размером пор и размером частиц 10 мкм суспендируют в 0,16 л пропанола-2. В хроматографическую колонку Superformance 300-26 (фирма Merck) с внутренним диаметром 2,6 см и высотой 30 см загружают полученную суспензию сорбента. Перед загрузкой суспензии к верней части рабочей хроматографической колонки Superformance 300-26 присоединяют аналогичную упаковочную колонку. Колонки собирают и подают пропанол-2 с линейной скоростью потока 3,8 см/мин (при этом давление не должно превышать 50 bar). После формирования слоя сорбента упаковочную колонку снимают. Сорбент в рабочей колонке сжимают с усилием нижним и верхним подвижными адаптерами. Получают слой сорбента высотой 30 см и объемом 0,16 л. Для уравновешивания через колонку пропускают 0,64 л стартового элюента А.

Процесс очистки инсулина ведут на жидкостном хроматографе Gilson (фирма Gilson), укомплектованного насосами модели 305, 306 с головками 25Wti, демпфером давления модели 805, динамическим миксером модели 811, фотометрическим УФ-детектором модели 112 и коллектором фракций FC-30 (фирма Fharmacia Biotech).

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 1,5 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 0,160 л стартового элюента А. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 17,5 до 30 объемных % в течение 125 мин. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента А и элюента, содержащего раствор уксусной кислоты с молярной концентрацией 0,125 моль/л и ацетонитрил с концентрацией 50 объемных %. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор уксусной кислоты с молярной концентрацией 0,125 моль/л и ацетонитрил с концентрацией 50 объемных % с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в течение 40 мин. Элюат, содержащий белок, дробят на фракции объемом 0,040 л каждая. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 1 содержит 0,528 г белка (0,6 л элюата с концентрацией белка 0,88 г/л) следующего состава: инсулина - 15,1%, дезамидо-А21-инсулина - 28,6%, примесей - 56,3%. Пул 2 содержит 0,576 г белка (0,24 л элюата с концентрацией белка 2,4 г/л) следующего состава: инсулина - 88,1%, дезамидо-А21-инсулина - 5,1%, примесей - 6,8%. Пул 3 содержит 3,696 г белка (0,456 л элюата с концентрацией белка 8,11 г/л) следующего состава: инсулина - 97,1%, дезамидо-А21-инсулина - 0,7%, примесей - 2,2%. Пул 1 передают в отходы производства. Пул 2 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superformance 300-10 с внутренним диаметром 1 см, упакованную 0,023 л сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8 (размер частиц 10 мкм, размер пор ). После рехроматографии пула 2 получают дополнительно 0,432 г инсулина (0,055 л элюата с концентрацией белка 7,85 г/л) следующего состава: инсулина - 97,4%, дезамидо-А21-инсулина - 0,8%, примесей - 1,8%. Элюат, после рехроматографии пула 2 присоединяют к пулу 3. Получают 4,128 г инсулина в 0,511 мл элюата с концентрацией 8,08 г/л. Концентрация ацетонитрила в элюате 23 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 0,664 л дистиллированной воды, 3,2 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%, 40,5 мл раствора лимонной кислоты с молярной концентрацией 1,5 моль/л и раствор аммиака с массовой долей 10% до значения рН 6,8. Раствор перемешивают в течение 90 мин, затем доводят значение рН до 5,9 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 120 мин. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего отделяют кристаллы инсулина от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor N₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 47 мм и размером пор 0,8 мкм и промывают 15 мл дистиллированной воды. Получают 4,045 г инсулина в пересчете на сухое вещество следующего состава: инсулина свиного - 97,0%, дезамидо-А21-инсулина - 0,8%, неидентифицированных примесей - 2,2% (ВЭЖХ), содержание проинсулина 5,6 p.p.m. (РИА).

Для второй хроматографической очистки используют те же упакованные хроматографические колонки, что и при первой хроматографической очистке: Superformance 300-26 и Superformance 300-10 и тот же жидкостной хроматограф Gilson.

Полученные кристаллы инсулина после первой хроматографической очистки (4,045 г в пересчете на сухое вещество) растворяют в 130 мл стартового элюента В, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,02 моль/л, этанол с концентрацией 20 объемных % и со значением рН 7,8, значение рН корректируют раствором кислоты соляной с массовой долей 10%. При растворении инсулина в элюент В до корректировки значения рН добавляют 2,0 мл раствора трилона Б с молярной концентрацией 0,10 моль/л. Полученный раствор инсулина фильтруют под давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG с диаметром 47 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 5 мл стартового элюента В. Получают около 142 мл раствора инсулина.

Перед вводом раствора инсулина хроматографическую колонку Superformance 300-26 предварительно уравновешивают. Для этого через колонку пропускают 0,64 л стартового элюента В с линейной скоростью потока 3,0 см/мин.

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 1,5 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 160 мл стартового элюента В. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в линейном градиенте концентрации этанола от 25 до 37,5 объемных % в течение 125 мин. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента В и элюента, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,012 моль/л, этанол с концентрацией 50 объемных % и со значением рН 7,8. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор ТРИС с молярной концентрацией 0,04 моль/л, этанол с концентрацией 70 объемных % и значением рН 8,5, который подают с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в течение 40 мин. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 4 содержит 0,121 г белка (0,101 л элюата с концентрацией белка 1,2 г/л) следующего состава: инсулина - 50,5%, дезамидо-А21-инсулина - 7,8%, примесей - 41,7%. Пул 5 содержит 0,607 г белка (0,148 л элюата с концентрацией белка 4,1 г/л) следующего состава: инсулина - 94,8%, дезамидо-А21-инсулина - 2,7%, примесей - 2,5%. Пул 6 содержит 3,317 г белка (0,364 л элюата с концентрацией белка 9,11 г/л) следующего состава: инсулина - 99,1%, дезамидо-А21-инсулина - 0,2%, примесей - 0,7%. Пул 4 передают в отходы производства. Пул 5 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superformance 300-10, упакованную 23 мл сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8. После рехроматографии пула 5 получают дополнительно 0,485 г инсулина (0,057 л элюата с концентрацией белка 8,51 г/л) следующего состава: инсулина - 98,9%, дзамидо-А21-инсулина - 0,3%, примесей - 0,8%. Элюат после рехроматографии пула 5 присоединяют к пулу 6. Получают 3,802 г инсулина в 0,421 л элюата с концентрацией белка 9,03 г/л. Концентрация этанола в элюате 32,5 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 0,24 л дистиллированной воды, 0,024 л раствора цитрата аммония с молярной концентрацией 1,5 моль/л и 2,9 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%. Полученный кристаллизационный раствор фильтруют под давлением 0,7 bar через стерилизующий мембранный фильтр Bio-Inert NRL (фирма Pall) с диаметром 47 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,023 л дистиллированной воды, промывную воду присоединяют к кристаллизационному раствору. В кристаллизационном растворе при перемешивании раствором кислоты соляной с массовой долей 5% устанавливают значение рН 6,9. Раствор перемешивают в течение 90 мин. Затем доводят значение рН до 6,0 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 2 ч. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего кристаллы инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor N₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 47 мм и с размером пор 0,8 мкм. Кристаллы инсулина промывают 0,015 л дистиллированной воды, затем трижды этанолом порциями по 0,010 л. Сушку кристаллов инсулина осуществляют в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы. Потеря массы при высушивании 8,0%. Получают 4,091 г по технической массе (3,764 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 99,0%, дезамидо-А21-инсулина - 0,3%, неидентифицированных примесей - 0,7% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина 0,6 p.p.m. (РИА). Выход - 78,4%.

Пример 3. Процесс хроматографической очистки инсулина проводят при температуре 16^oС. 9,0 г по технической массе (8,19 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца, содержащего 5,1% дезамидо-А21-инсулина и 9,5% примесей растворяют в 0,300 л стартового элюента А, содержащего раствор трифторуксусной кислоты с массовой долей 0,15% и ацетонитрил с концентрацией 18,0 объемных %, значение рН в растворе инсулина корректируют до 2,4 раствором кислоты соляной с массовой концентрацией 10%. Полученный раствор инсулина фильтруют под избыточным давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG (фирма Pall) с диаметром 47 мм и с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,030 л стартового элюента А. Получают около 0,340 л раствора инсулина.

Для очистки инсулина используют готовую хроматографическую колонку с системой динамического аксиального сжатия Dynamax-300А С8 (фирмы Rainin), с внутренним диаметром 4,14 см и длиной 25 см. Колонка упакована сферическим силикагелем С8 с размером частиц 15 мкм и средним размером пор Для уравновешивания через колонку пропускают 1,30 л стартового элюента А.

Процесс очистки инсулина ведут на жидкостном хроматографе Gilson (фирма Gilson), укомплектованного насосами модели 305, 306 с головками 50SC, демпфером давления модели 806, динамическим миксером модели 811, фотометрическим УФ-детектором модели 112 и коллектором фракций FC-30 (фирма Fharmacia Biotech).

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 1,5 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 0,330 л стартового элюента А. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 18,0 до 30,0 объемных % в течение 100 мин. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента А и элюента, содержащего раствор трифторуксусной кислоты с массовой долей 0,075% и ацетонитрил с концентрацией 50 объемных %. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор трифторуксусной кислоты с массовой долей 0,075% и ацетонитрил с концентрацией 50 объемных %, с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в течение 30 мин. Элюат, содержащий белок, дробят на фракции объемом 0,080 л каждая. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют три пула. Пул 1 содержит 0,983 г белка (1,31 л элюата с концентрацией белка 0,75 г/л) следующего состава: инсулина - 6,9%, дезамидо-А21-инсулина - 29,1%, примесей - 64,0%. Пул 2 содержит 0,655 г белка (0,35 л элюата с концентрацией белка 1,87 г/л) следующего состава: инсулина - 75,8%, дезамидо-А21-инсулина - 14,1%, примесей - 10,1%. Пул 3 содержит 6,552 г белка (0,753 л элюата с концентрацией белка 8,70 г/л) следующего состава: инсулина - 97,6%, дезамидо-А21-инсулина - 0,6%, примесей - 1,8%. Пул 1 передают в отходы производства. Пул 2 подвергают рехроматографии при тех же режимах, но на хроматографической колонке меньшего объема: Superformance 300-10 с внутренним диаметром 1 см, упакованную 0,023 л сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8 (размер частиц 10 мкм). После рехроматографии пула 2 получают дополнительно 0,426 г инсулина (0,060 л элюата с концентрацией белка 7,1 г/л) следующего состава: инсулина - 97,2%, дезамидо-А21-инсулина - 0,8%, примесей - 2,0%. Элюат, после рехроматографии пула 2 присоединяют к пулу 3. Получают 6,978 г инсулина в 0,813 л элюата с концентрацией 8,58 г/л. Концентрация ацетонитрила в элюате 24,4 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 1,17 л дистиллированной воды, 5,4 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%, 68 мл раствора лимонной кислоты с молярной концентрацией 1,5 моль/л и раствор аммиака с массовой долей 10% до значения рН 6,8. Раствор перемешивают в течение 90 мин, затем доводят значение рН до 5,9 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 2 ч. Продолжают перемешивание еще 4 ч, после чего отделяют кристаллы инсулина от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor N₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 47 мм и размером пор 0,8 мкм и промывают 20 мл дистиллированной воды. Получают 6,84 г в пересчете на сухое вещество инсулина следующего состава: инсулина - 97,5%, дезамидо-А21-инсулина - 0,7%, примесей - 1,8% (ВЭЖХ), содержание проинсулина 4,7 p.p.m. (РИА).

Для второй хроматографической очистки используют ту же упакованную хроматографическую колонку, что и при первой хроматографической очистке: Dynamax-300 A C8 и тот же жидкостной хроматограф Gilson.

Полученные кристаллы инсулина после первой хроматографической очистки (6,84 г в пересчете на сухое вещество) растворяют в 0,2 л стартового элюента В, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,01 моль/л, этанол с концентрацией 20 объемных % и со значением рН 7,8, значение рН корректируют при необходимости раствором кислоты соляной с массовой долей 10%. При растворении инсулина в элюент В до корректировки значения рН добавляют 3,4 мл раствора трилона Б с молярной концентрацией 0,10 моль/л. Полученный раствор инсулина фильтруют под давлением 0,7 bar через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG с диаметром 47 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 28 мл стартового элюента В. Получают около 0,25 л раствора инсулина.

Перед вводом раствора инсулина хроматографическую колонку Dynamax-300 A C8 предварительно уравновешивают. Для этого через колонку пропускают 1,3 л стартового элюента В с линейной скоростью потока 3,0 см/мин.

Раствор инсулина подают с линейной скоростью потока 1,5 см/мин в хроматографическую колонку. Затем колонку промывают 0,33 л стартового элюента В. Элюцию инсулина ведут с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в линейном градиенте концентрации этанола от 25,0 до 37,5 объемных % в течение 100 мин. Формирование градиента осуществляется автоматически путем смешения двух элюентов: стартового элюента В и элюента, содержащего ТРИС с молярной концентрацией 0,005 моль/л, этанол с концентрацией 50 объемных % и со значением рН 7,8. После окончания градиента сорбент в колонке регенерируют элюентом, содержащим раствор ТРИС с молярной концентрацией 0,01 моль/л, этанол с концентрацией 70 объемных % и значением рН 8,0, подают с линейной скоростью потока 3,0 см/мин в течение 35 мин. Фракции анализируют методом ВЭЖХ на содержание примесей и по результатам анализа формируют два пула. Пул 4 содержит 0,27 г белка (0,35 л элюата с концентрацией белка 0,77 г/л) следующего состава: инсулина - 48,7%, дезамидо-А21-инсулина - 15,3%, примесей - 36,0%. Пул 5 содержит 6,57 г белка (0,792 л элюата с концентрацией белка 8,3 г/л) следующего состава: инсулина - 99,5%, дезамидо-А21-инсулина - 0,1%, примесей - 0,4%. Пул 4 передают в отходы. Инсулин, содержащийся в пуле 5, кристаллизуют.

Концентрация этанола в элюате 32,0 объемных %. В элюат при перемешивании добавляют 0,450 л дистиллированной воды, 0,044 л раствора цитрата аммония с молярной концентрацией 1,5 моль/л и 5,1 мл раствора хлорида цинка с массовой долей 10%. Полученный кристаллизационный раствор фильтруют под давлением 0,7 bar через стерилизующий мембранный фильтр Bio-Inert NRL (фирма Pall) с диаметром 47 мм и абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 0,025 л дистиллированной воды, промывную воду присоединяют к кристаллизационному раствору. В кристаллизационном растворе при перемешивании раствором кислоты соляной с массовой долей 5% устанавливают значение рН 6,9. Раствор перемешивают в течение 90 мин. Затем доводят значение рН до 6,1 раствором кислоты соляной с массовой долей 5% постепенно в течение 2 ч. Продолжают перемешивание еще 5 ч, после чего кристаллы инсулина отделяют от маточного раствора фильтрацией на нутч-фильтре через мембрану Ultipor ₆₆ NH (фирма Pall) с диаметром 47 мм и с размером пор 0,8 мкм. Кристаллы инсулина промывают 0,020 л дистиллированной воды, затем трижды этанолом порциями по 0,015 л. Сушку кристаллов инсулина осуществляют в вакуум-сушильном шкафу до постоянной массы. Потеря массы при высушивании 9,1%. Получают 7,15 г по технической массе (6,50 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 99,3%, дезамидо-А21-инсулина - 0,2%, неидентифицированных примесей - 0,5% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина 0,3 p.p.m. (РИА). Выход - 79,4%.

Пример 4. Процесс хроматографической очистки проводят при температуре 15^oС. Берут полусинтетический инсулин-сырец человека, полученный по способу, описанному в [8] из свиного дезаланин-В30-инсулина путем взаимодействия с производным треонина в присутствии трипсина. В связи с высоким содержанием примесей в полусинтетическом инсулине-сырце человека (22,5%) вначале делают его предочистку методом фронтально-вытеснительной колоночной хроматографии. Для этого 4,88 г по технической массе (4,44 г в пересчете на сухое вещество) полусинтетического инсулина-сырца человека растворяют в 40 мл элюента А, содержащего кислоту уксусную с молярной концентрацией 0,12 моль/л и ацетонитрил с концентрацией 26 объемных %. В растворе инсулина устанавливают значение рН 2,6 раствором кислоты соляной с массовой долей 10%. Раствор фильтруют через мембранный фильтр Bio-Inert NRLG (фирма Pall) с абсолютной удерживающей способностью 0,2 мкм, фильтр промывают 5 мл элюента А. Полученный раствор инсулина с линейной скоростью потока 1,27 см/мин пропускают через хроматографическую колонку Superformance 300-10 (фирма Merck), заполненную 55 мл сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-C8 (размер частиц 10 мкм). Затем колонку промывают 110 мл элюента А. Получают 140 мл элюата, содержащего 3,99 г инсулина с содержанием основного вещества 84,9%. К элюату добавляют 68 мл водного раствора уксусной кислоты с молярной концентрацией 0,25 моль/л и дальнейшую очистку ведут аналогично примеру 2. Получают 3,34 г по технической массе (3,04 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного полусинтетического человеческого инсулина с содержанием основного вещества 98,9%. Содержание дезамидо-А21-инсулина - 0,3%, содержание неидентифицированных примесей - 0,8%, в том числе инсулина свиного - 0,2% (ВЭЖХ). Содержание свиного проинсулина - 0,3 p.p.m. (РИА). Выход - 68,4% с учетом предочистки.

Пример 5. Процесс хроматографической очистки проводят при температуре 15^oС. Берут инсулин-сырец человека, который получен из генно-инженерного (биосинтетического) проинсулина человека под действием трипсина и карбоксипептидазы В по способу, описанному в [9]. Содержание примесей в инсулине-сырце человека - 9,5%. Берут 9,0 г по технической массе (8,1 г в пересчете на сухое вещество) инсулина-сырца человека и дальнейшую очистку ведут аналогично примеру 3. Получают 7,1 г по технической массе (6,4 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного генно-инженерного человеческого инсулина с содержанием основного вещества 99,0%, содержание дезамидо-А21-инсулина - 0,2%, содержание примесей - 0,7% (ВЭЖХ), содержание человеческого проинсулина 0,3 p.p.m. (РИА). Выход - 78,9%.

Пример 6. Процесс хроматографической очистки проводят при температуре 18^oС. Берут 3,60 г по технической массе (3,25 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца с содержанием примесей 8,7% и проводят очистку аналогично примеру 2 за исключением того, что вместо сферического силикагеля С8 DuraSil S-100-С8 (фирма АРО) с размером пор и размером частиц 10 мкм используют полимерный монодисперсный ОФ-сорбент Source 15RPC фирмы Fharmacia Biotech с размером частиц 15 мкм.

Получают 2,75 г по технической массе (2,50 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 98,8%, дезамидо-А21-инсулина - 0,4%, неидентифицированных примесей - 0,8% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина 0,8 p.p.m. (РИА). Выход - 76,9%.

Пример 7. Процесс хроматографической очистки проводят при температуре 17^oС. Берут 5,20 г по технической массе (4,80 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца с содержанием примесей 8,7% и проводят очистку аналогично примеру 2 за исключением того, что: 1. Меняют порядок проведения первой и второй хроматографических очисток: вначале проводят хроматографическую очистку при значении рН элюентов 7,6, а затем хроматографическую очистку при значении рН элюентов 2,7.

2. Используют в элюентах вместо ацетонитрила этанол.

Получают 4,20 г по технической массе (3,79 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 98,6%, дезамидо-А21-инсулина - 0,5%, неидентифицированных примесей - 0,9% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина 0,4 p.p.m. (РИА). Выход - 78,9%.

Пример 8. Процесс хроматографической очистки проводят при температуре 16^oС. Берут 5,20 г по технической массе (4,80 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца с содержанием примесей 8,7% и проводят очистку аналогично примеру 2 за исключением того, что вместо непрерывного линейного градиента при первой хроматографической очистке используют ступенчатый градиент. Элюцию пула 3 проводят элюентом, который содержит кислоту уксусную с молярной концентрацией 0,20 моль/л и ацетонитрил с концентрацией 26,5 объемных %, который подают в течение 60 мин с линейной скоростью потока 1,5 см/мин. Элюцию пула 2 проводят элюентом, содержащим кислоту уксусную с молярной концентрацией 0,20 моль/л и ацетонитрил с концентрацией 28,0 объемных %, который подают в течение 20 мин с линейной скоростью потока 3,0 см/мин. Дальнейшую очистку (рехроматографию пула 2, вторую хроматографическую очистку) и регенерацию сорбента ведут, как описано в примере 2.

Получают 4,15 г по технической массе (3,81 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 98,9%, дезамидо-А21-инсулина - 0,2%, неидентифицированных примесей - 0,9% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина 0,7 p.p.m. (РИА). Выход - 79,3%.

Пример 9. Процесс хроматографической очистки проводят при температуре 14^oС. Берут 5,20 г по технической массе (4,80 г в пересчете на сухое вещество) свиного инсулина-сырца с содержанием примесей 8,7% и проводят очистку аналогично примеру 2 за исключением того, что для улучшения степени разделения инсулина и аргинининсулинов вместо линейного градиента при первой хроматографической очистке используют экспоненциальный градиент, который описывается следующим выражением: С=16+1,2е^N/3, где С - концентрация ацетонитрила в подвижной фазе, выраженная в объемных %; е - основание натурального логарифма (2,71828...); N - отношение объема элюента, поданного на колонку к объему сорбента в колонке (от 0 до 10).

Получают 4,21 г по технической массе (3,89 г в пересчете на сухое вещество) высокоочищенного монокомпонентного свиного инсулина следующего состава: инсулина свиного - 99,1%, дезамидо-А21-инсулина - 0,3%, неидентифицированных примесей - 0,6% (ВЭЖХ). Содержание проинсулина 0,7 p.p.m. (РИА). Выход 81,0%.

Библиографические данные 1. В.С.Белинский, Г.Н.Хлябич, И.А.Донецкий. Масштабирование и внедрение технологии получения высокоочищенного инсулина. Тезисы докладов. Всероссийский симпозиум "Биосепарация-96". С-Петербург, 1996 г.

2. Dillon, W. W. , and Romans, R. G.: Heterogeneity of Insulin II. Chromatography of Insulin on Carboxymethyl Cellulose in Urea Buffers. Canad. J. Biochem. 1967.

3. Smith, L. F.; Isolation of Insulin from Pancreatic Extracts Using Carboxymethyl and Diethylaminoethyl Cellulose. Biochem. Biophys. Acta. 1964.

4. В. В. Кандарюк, И.А.Донецкий, В.А.Гуляев и др. Патент СССР 2734204, 19.02.79 г.

5. Патент США 2105543, 15.03.78 г.

6. Патент Франции 2581647, 17.04.85 г.

7. Е. Р. Kroeff, R. A. Owens, Е.L.Campbell, R.D.Johnson and Н.I.Marks. Production Scale Purification of Biosynthetic Human Insulin by Reversed-phase High-performance Liquid Chromatography., Journal of Chromatography, 461 (1989) 45-61.

8. Morihara et al. Pat. 4511505 (US), 16.04.85 г.

9. Элли Лилли Энд Компани. Брюс Хилл Френк, Ричард Юджин Хини и др. Патент США 1829939, 13.10.87 г.

Формула изобретения

1. Способ получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина, содержащего не менее 98,5% основного вещества, не более 0,5% дезамидо-А21-инсулина, не более 1,0% неидентифицированных примесей и не более 1,0 млн^-1, проинсулина при помощи жидкостной колоночной хроматографической очистки инсулина-сырца при температуре 5 - 30^oС в водно-органических элюентах с ионными модификаторами на неполярных сорбентах, отличающийся тем, что инсулин-сырец с общим количеством 15 - 50 г на 1 л сорбента в хроматографической колонке растворяют в элюенте А со значением рН 1,5 - 4,5, содержащем ионные модификаторы с концентрацией 0,001 - 0,3 моль/л и органический растворитель с концентрацией 10 - 30 об.%, вводят с линейной скоростью потока 0,25 - 1,5 см/мин в хроматографическую колонку с высотой слоя сорбента 10 - 60 см предварительно уравновешенную элюентом А и заполненную неполярным сорбентом со средним размером пор размером частиц 10 - 100 мкм, элюируют сорбированный инсулин с хроматографической колонки с линейной скоростью потока 0,5 - 3,0 см/мин, используя ступенчатый или непрерывный градиент концентрации органического растворителя и получают высокоочищенный инсулин-полупродукт, который затем выделяют в кристаллическом виде и растворяют в элюенте В со значением рН 6,5 - 9,5, содержащем ионные модификаторы с концентрацией 0,001 - 0,3 моль/л и органический растворитель с концентрацией 10 - 30 об.%, вводят с линейной скоростью потока 0,25 - 1,5 см/мин в хроматографическую колонку с высотой слоя сорбента 10 - 60 см, предварительно уравновешенную элюентом В и заполненную неполярным сорбентом со средним размером пор размером частиц 10 - 100 мкм, элюируют сорбированный инсулин с хроматографической колонки с линейной скоростью потока 0,5 - 3,0 см/мин, используя ступенчатый или непрерывный градиент концентрации органического растворителя, и получают раствор высокоочищенного монокомпонентного инсулина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя в элюенте А используют ацетонитрил, этанол, пропанол-2, метанол.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя в элюенте В используют этанол.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве неполярного сорбента используют силикагель С8.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве неполярного сорбента используют силикагель С18.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве неполярного сорбента используют полимерный ОФ-сорбент.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют неполярный сорбент с размером частиц 10 - 15 мкм.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют неполярный сорбент с размером пор 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют сферический неполярный сорбент.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ионного модификатора используют органические и неорганические кислоты, основания и их соли.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве ионного модификатора используют уксусную, трифторуксусную, ортофосфорную, соляную кислоты, ТРИС, аммиак, гидроокись натрия и их соли.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют элюент А со значением рН 2,3 - 2,8.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют элюент В со значением рН 7,3 - 8,0.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют хроматографические колонки с высотой слоя сорбента 25 - 40 см.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс хроматографической очистки ведут при температуре 10 - 20^oС.