Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к производству и применению иммунодиагностических тест-систем для определения антител к инфекционным агентам. Иммунодиагностикум готовят на основе мелкоизмельченного активированного угля. Он представляет собой водную взвесь частиц активированного угля размером менее 10 мкм, сорбционно связанных при соотношении по массе от 1: 10000 до 1: 1000 с одним из специфических иммунореагентов (антигенами, иммуноглобулинами, стафилококковыми протеинами и т.п.), стабилизированных высокомолекулярными полимерами (альбумины, полиэтиленгликоли, желатин, поливинилпирролидон и т.п.). Изобретение обеспечивает визуализацию результатов анализа за счет свойств маркера, высокую чувствительность анализа. 4 з.п.ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности к производству и применению иммунодиагностических тест-систем для определения антител к инфекционным агентам. Точное и своевременное определение наличия или количества антител к тому или иному инфекционному агенту может помочь в постановке диагноза инфекционного заболевания, в выработке тактики оказания медицинской помощи, в прогнозировании течения и исхода заболевания. В ряде случаев наличие специфических антител является показателем напряженности поствакцинального иммунитета и может служить критерием эффективности профилактических мероприятий.

Наиболее важные требования к диагностикумам - высокая чувствительность и специфичность, однако большое значение в практическом использовании того или иного диагностикума имеют его стоимость и простота применения. В настоящее время одним из наиболее чувствительных тестов является иммуноферментный анализ (ИФА). Он характеризуется высокой воспроизводимостью, приемлемой скоростью получения результатов (1,5 - 3 часа) и достаточно прост в исполнении. Однако этот метод требует применения дорогого дозирующего и регистрирующего оборудования, а также высокой квалификации исполнителей, что ограничивает применение ИФА в широкой сети малооснащенных лабораторий. Кроме того, такие тест-системы сориентированы на серийные исследования большого количества проб и экономически невыгодны для выполнения одиночных анализов.

Известны агглютинационные тесты, основанные на агрегации сенсибилизированных специфическими антигенами макрочастиц (эритроцитов, латекса) находящимися в сыворотке антителами. Однако эти тесты обладают недостаточной специфичностью и чувствительностью. Кроме того, они требуют навыков исполнителя, а результаты их весьма подвержены воздействию большого числа внешних факторов.

Известен иммунодиагностикум на основе коллоидного золота для анализа на нитроцеллюлозных фильтрах. Частицы коллоидного золота с размерами в диапазоне от 5 до 50 нм сорбционно связываются с иммунореагентами (антигенами или антителами) и после очистки нагруженных частиц от избытка иммунореагента используются для выявления нанесенного на нитроцеллюлозную мембрану определяемого вещества. При связывании золотого иммунозоля с определяемым веществом он накапливается на поверхности мембраны и обуславливает визуально определяемый цветовой сигнал. Достоинствами, объясняющими широкое применение золота в иммуноанализе, являются возможность получения на его основе стандартных монодисперсных золей с частицами правильной сферической формы и химическая инертность материала. А хорошая контрастирующая способность, позволяющая визуально выявлять очень небольшие по массе количества золя, определяет высокую чувствительность анализа, только незначительно уступающую чувствительности ИФА. Постановка иммунотеста с использованием золотых иммунозолей проста и не требует квалификации исполнителя, а время анализа обычно не превышает 1 - 1,5 часов.

Недостатками этого метода, кроме высокой стоимости маркера (золота), являются относительно сложная процедура получения стабильного коллоида и необходимость использования ультрацентрифуги для очистки полученного иммунозоля. Кроме того, для эффективного связывания частиц золота с иммунореагентом необходимо знать изоэлектрическую точку этого белка [1].

Известен набор для тестирования на основе золотого золя, иммобилизованного на твердом носителе [2].

Недостатком этого метода также является высокая стоимость маркера, что не позволяет использовать его в широкой практике.

Наиболее близкой к предлагаемому решению является иммунодиагностикум на основе газовой сажи, модифицированной с помощью декстрана, в качестве маркера для иммуноанализа [3, прототип]. Однако вследствие того что поверхность частиц сажи представлена в основном базисной структурой графита и слабо удерживает белковые молекулы, авторы вынуждены предварительно модифицировать эту поверхность с помощью декстрана, а затем ковалентно связывать с ним иммунореагент, что значительно усложняет и удорожает процедуру получения диагностикума.

Если сорбция стандартно приготовленных иммуноглобулинов при рН 8,5 - 9,0 не представляет трудностей, то связывание различных антигенов, полученных из разных источников и с использованием разнообразных методик, может быть гораздо сложнее. В таких случаях необходимо либо определять изоэлектрическую точку антигена сложной и дорогостоящей методикой изоэлектрического фокусирования, либо действовать методом проб и ошибок, ставя громоздкие эксперименты по подбору условий сорбции.

Задачей изобретения является создание более простого в приготовлении и дешевого по сравнению с аналогом диагностикума, обеспечивающего наряду с высокой чувствительностью простоту постановки и бесприборный учет результатов анализа.

Поставленная задача решается тем, что в иммунодиагностикуме, содержащем водную взвесь частиц маркера, сорбционно связанного с одним из иммунореагентов, в качестве которого используют антигены, или иммуноглобулины; или стафилококковые протеины А и G, стабилизированные высокомолекулярными полимерами, согласно изобретению в качестве маркера используют активированный уголь в виде частиц с размерами менее 10 мкм, взятого в соотношении по массе иммунореагент: маркер = 1:1000 - 1:10000, а в качестве иммунореагентов берутся антигены вируса паротита, сифилиса и антивидовой иммуноглобулин G в конечном соотношении по объему раствора иммунореагента к взвеси маркера 1:1 - 1:10.

Сущность изобретения: иммунодиагностикум представляет собой водную смесь частиц маркера - активированного угля с размерами менее 10 мкм, сорбционно связанных с одним из специфических иммунореагентов антигенами или антивидовыми антителами или стафилококковыми протеинами А или G при соотношении по массе маркера к иммунореагену в диапазоне от 1000:1 до 10000:1 и стабилизированных высокомолекулярными полимерами. Изобретение позволяет с низкими материальными энерго- и трудозатратами получать широкий спектр диагностикумов для выявления сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа с чувствительностью немного уступающей ИФА, пригодных для проведения одиночных и серийных исследований в малооснащенных учреждениях, а также для самодиагностики.

Способ приготовления иммунодиагностикума включает следующие этапы: 1) подготовка маркера; 2) получение водной взвеси маркера; 3) связывание частиц маркера с иммунореагентом; 4) стабилизация полученной иммуносуспензии; 5) очистка иммунодиагностикума.

(1) Термином маркер в настоящем описании обозначены различные сорта и марки активированных углей, выпускаемых отечественной и зарубежной промышленностью. Подготовка угля включает в себя окисление поверхности угля пероксидом водорода с целью удаления следов органики и активных радикалов; прогревание окисленного угля при 200 - 300^oС с целью максимального удаления влаги и остатков пероксида водорода, а также измельчение его любым доступным механическим способом. Высокодисперсные марки угля, например норит и т.п., могут быть использованы без дополнительного измельчения.

(2) Для получения водной взвеси маркера навеску угля увлажняют небольшим количеством этанола или ацетона и смешивают с дистиллированной водой или буферным раствором с минимальной ионной силой в соотношении по массе сухого угля к воде 1: 100 - 1: 200.

(3) Иммунореагент (антиген, антитела или др.) растворяют в дистиллированной воде или нейтральном буферном растворе с минимальной ионной силой до концентрации 0,01 - 0,1 мг/мл. При интенсивном перемешивании раствора иммунореагента в него за три приема равными долями с интервалами по 10 - 15 мин вносят взвесь маркера в конечном соотношении по объему раствора иммунореагента к взвеси маркера 1:1 - 1:10. После внесения последней дозы маркера скорость мешалки снижают до 150 - 200 об/мин и перемешивают смесь в течение 1 - 2 ч при комнатной температуре.

(4) С целью блокирования свободных участков на поверхности угля и стабилизации суспензии в нее при перемешивании добавляют концентрированный (10 - 20%) раствор высокомолекулярного полимера (альбумина, ПЭГ, желатина и т.п. ) до конечной концентрации 1,5 - 2%. Чтобы избежать значительной конкуренции с иммунореагентом за сайты сорбции на поверхности маркера, блокирующий полимер подбирают с молекулярной массой, меньшей, чем молекулярная масса иммунореагента. Инкубируют суспензию на мешалке в течение 0,5 - 2 ч. Обрабатывают суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе при частоте 22 кГц и максимальной мощности в течение 0,5 - 1 мин. Центрифугируют суспензию 5 мин при 3000 g для осаждения крупных агрегатов маркера.

(5) Очистка диагностикума от несвязавшегося с маркером иммунореагента и избытка блокирующего полимера достигается двукратным центрифугированием при 10 - 15000 g в течение 10 - 15 мин или фильтрацией через фильтры с диаметром пор около 0,5 мкм. Первый раз осадок ресуспендируют пипетированием или краткой 10 - 15 с обработкой на ультразвуковом дезинтеграторе в исходном объеме 0,02 М фосфатного или трис-НСl буферного раствора рН 7,4 с 0,15 М NaCl и 0,05% блокирующего полимера. Второй раз суспендирование проводят пипетированием в 1/10 - 1/100 части исходного объема того же буфера так, чтобы конечная концентрация суспензии по углю составляла около 10 - 20 мг/мл. Добавляют в суспензию раствор азида натрия до конечной концентрации 0,02%. При использовании диагностикум разводят в 10 - 20 раз в 0,1 М фосфатном или трис-НСl буферном растворе рН 7,2 - 7,4 с 0,15 М NaCl.

Удешевление диагностикума достигается применением доступного и недорогого маркера - активированного угля, а также упрощением технологии и, соответственно, снижением энерго- и трудозатрат при приготовлении диагностикума.

Простота приготовления достигается применением в качестве маркера активированного угля, обладающего универсальными сорбционными свойствами в отношении разнообразных белков при физиологических значениях рН, а также использованием относительно крупных частиц маркера, облегчающих процедуру очистки диагностикума от избытка белков методом центрифугирования или фильтрации.

Высокая чувствительность и бесприборный учет результатов анализа обусловлены высокой контрастностью маркера, обеспечивающего четко различимое темное пятно на белей матрице при минимальном накоплении на ее поверхности угольных частиц.

Новыми по сравнению с прототипом являются следующие признаки иммунодиагностикума: - используемый маркер представляет собой водную взвесь измельченного активированного угля; - предпочтительные размеры частиц маркера - менее 10 мкм; - сорбционная связь иммунореагента на частицах маркера установлена соотношением по массе иммунореагента к маркеру в диапазоне от 1:1000 до 1:10000.

ПРИМЕР 1. Приготовление иммунодиагностикума на основе активированного угля марки БАУ-М, связанного с антигеном вируса паротита.

Активированный уголь марки БАУ-М смешивают с 16%-ным раствором пероксида водорода в соотношении 1:2 по объему, перемешивают и выдерживают в течение 12 ч. Отделяют окисленный уголь от жидкой части фильтрацией, и прогревают его в течение 4 ч при температуре 200^oС. Измельчают уголь в планетарной или шаровой мельнице. Измельченный БАУ увлажняют этанолом и смешивают с дистиллированной водой в соотношении по массе 1:100. Обрабатывают суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при частоте 22 кГц и максимальной мощности в течение 10 мин, после чего немедленно разливают ее в центрифужные стаканы и центрифугируют 5 мин при 1000 g. Осадок удаляют, а концентрацию взвешенных частиц определяют методом фильтрации и взвешивания.

Для получения иммунодиагностикума используют антиген вируса паротита (АТСС, штамм Эндерс, 14D, VR-106, 92.02), полученный культивированием на культуре клеток Vero, сконцентрированный ультрафильтрацией, очищенный ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы и инактивированный прогреванием 30 мин при 60^oС. К 5 мл антигена с концентрацией 0,01 мг/мл дробно в три приема с интервалами по 10 мин при интенсивном перемешивании добавляют 5, 3 и 2 мл взвеси БАУ (5 мг/мл) в дистиллированной воде. Спустя 10 - 15 мин после внесения последней дозы угля в суспензию добавляют 3 мл 10%-ного раствора БСА (Sigma, США) на дистиллированной воде, обороты мешалки уменьшают и при слабом перемешивании смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Очищают иммунодиагностикум двукратным центрифугированием при 14000 g в течение 15 мин. После первого центрифугирования осадок ресуспендируют в 15 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,4 с 0,15 М NaCl и 0,05% БСА, озвучивая суспензию 10 с при максимальной мощности на УЗДН-2Т. Второе центрифугирование проводят с применением подушки из 50%-ного глицерина (1/10 объема суспензии), ресуспендируют осадок пипетированием в 3 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,4 с 0,15 М NaCl, 0,05% БСА и 0,02% азида натрия.

Готовят серии двукратных разведений: сыворотки кролика, иммунизированного паротитным антигеном; сыворотки реконвалесцента; нормальных кроличьих и человеческих сывороток на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 с 0,l5 M NaCl (ФСР). Аликвотами по 5 мкл каждое разведение сывороток наносят на стрип из нитроцеллюлозы (Milli-роrе, США) с диаметром пор 0,45 мкм, высушивают 10 мин на воздухе и помещают стрип на 20 - 30 мин в 2%-ный раствор БСА на ФСР. Иммунодиагностикум разводят 1:10 на ФСР с 0,5% БСА, тщательно взбалтывают и помещают стрипы в полученную иммуносуспензию на 30 мин при комнатной температуре, после чего стрипы ополаскивают дистиллированной водой и учитывают результаты визуально по отчетливо различимым темным пятнам в местах нанесения аликвот сывороток. Параллельно с теми же разведениями сывороток проводят РТГА и ИФА в стандартной постановке. Сравнительные результаты чувствительности определения паротитных антител тремя тестами приведены в таблице.

ПРИМЕР 2. Приготовление иммунодиагностикума на основе норита, связанного с синтетическим сифилитическим антигеном.

Навеску 0,1 г Норита A (Serwa, Германия) с дисперсностью 4 - 7 мкм увлажняют этанолом, суспендируют в 10 мл дистиллированной воды озвучивая взвесь 10 мин при максимальной мощности на УЗДН-2Т и дробно, как описано в примере 1, вносят в 1 мл раствора сифилитического антигена с концентрацией 0,1 мг/мл. В качестве антигена используют смесь равных концентраций четырех химерных белков, содержащих аминокислотные последовательности полипептидов Tr. palludum с м.м. 15, 17, 42 и 47 кДа. Очистку диагностикума и постановку дот-иммуноанализа с сифилитическими сыворотками проводят так же, как описано в примере 1.

При качественном исследовании панели из 30 сифилитических сывороток получено полное совпадение результатов дот-иммуноанализа и ИФА. По чувствительности определения титров сифилитических антител дот-иммуноанализ уступал ИФА на 1 - 2 двукратных разведения.

ПРИМЕР 3. Приготовление иммунодиагностикума на основе активированного угля, связанного с антивидовыми IgG.

10 мл взвеси измельченного БАУ-М с концентрацией 5 мг/мл, полученной, как списано в примере 1; дробно вносят в 1 мл раствора иммуноглобулинов против IgG человека (Sigrna, США) с концентрацией 0,01 мг/мл. Нагрузку и очистку диагностикума проводят так же, как в примере 1. На нитроцеллюлозные стрипы наносят аликвотами по 5 мкл разведения IgG человека (Sigma, США) в ФСР, высушивают на воздухе, блокируют в 2%-ном растворе БСА, инкубируют 30 мин в суспензии иммунодиагностикума (1:10 на ФСР с 0,5% БСА), ополаскивают водой и визуально учитывают результаты, как в примере 1. В аналогичной постановке проводят дот-иммуноанализа с золем золота (10 нм), связанным с антителами против IgG человека (Sigma, США). Параллельно те же разведения сывороток в объеме 100 мкл сортируют в ячейках микротитровальных планшетов и выявляют антивидовыми IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma, США). ИФА проводят по общепринятой схеме. Чувствительность выявления IgG угольным и золотым иммунодиагностикумом была одинакова и составила около 20 нг/мл, а в ИФА - 2 нг/мл.

Предлагаемые иммунодиагностикумы за счет высокой контрастности применяемого маркера позволяют достигнуть чувствительности иммуноанализа только немного уступающей чувствительности ИФА, а универсальная адсорбирующая способность маркера позволяет легко получать широкий спектр диагностикумов на основе разнообразных антивидовых иммуноглобулинов, антигенов и других иммунореагентов. При этом способ применения таких диагностикумов быстр, прост, не требует квалификации оператора и регистрирующей аппаратуры, удобен для постановки как серийных, так и одиночных анализов, что делает его пригодным для использования в малооснащенных медицинских учреждениях, для постановки диагноза у постели больного, а также для самодиагностики. Низкая стоимость маркера, экономное использование иммунореагентов, а также малые энерго- и трудозатраты при производстве диагностикума экономически выгодно отличают его от существующих аналогов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Raska I. Electron microscopic immunocytochemistry with colloidal gold. - Laboratory manual of the practical course orgaized by the Institute of Experimental Medicine, Czechoslovak Academy of Sciences in collaboration with the Czechoslovak Biochemical Society of the Czechoslovak Academy of Sciences. Prague, May 23 th - Jine 3 rd, 1988.

2. Международная заявка 89/06801. Способ и набор для тестирования. Опубликовано во РЖ ИСМ 108 - 04 - 90.

3. Патент США 5252496. Иммунохимическая метка газовой сажи. Опубликовано в РЖ ИСМ 84 - 08 - 95.

Формула изобретения

1. Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах, содержащий водную взвесь частиц маркера, сорбционно связанных с одним из иммунореагентов, в качестве которых используют антигены, или иммуноглобулины, или стафилококковые протеины А и G, стабилизированные высокомолекулярными полимерами, отличающийся тем, что в качестве маркера используют активированный уголь в виде частиц с размерами менее 10 мкм.

2. Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах по п.1, отличающийся тем, что соотношение по массе иммунореагента и маркера составляет 1:1000 - 1:10000 соответственно.

3. Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах по п.1, отличающийся тем, что в качестве иммунореагента содержит антиген вируса паротита в конечном соотношении по объему раствора иммунореагента и взвеси маркера 1: 1 - 1:10.

4. Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах по п.1, отличающийся тем, что в качестве иммунореагента содержит синтетический сифилитический антиген в конечном соотношении по объему раствора иммунореагента и взвеси маркера 1:1 - 1:10.

5. Иммунодиагностикум для определения сывороточных антител к инфекционным агентам методом дот-иммуноанализа на пористых стрипах по п.1, отличающийся тем, что в качестве иммунореагента содержит антивидовой иммуноглобулин G в конечном соотношении по объему раствора иммунореагента и взвеси маркера 1:1 - 1:10.

РИСУНКИ

Рисунок 1