Иммунотоксин против спида

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для лечения СПИДа. Обладающий цитотоксическим действием на ВИЧ-инфицированные клетки иммунотоксин представляет собой химический конъюгат токсина, такого как гелонин, рицин, арабин и другие противовирусные белки, с моноклональным антителом против обратной транскриптазы вируса ВИЧ. Для конъюгации используют соединения, образующие поперечные сшивки, например альфа-иминотиолан-гидрохлорид, метил-3-меркаптопропионимидат и др. Иммунотоксин используют для приготовления фармацевтической композиции, обладающей цитотоксическим действием на ВИЧ-инфицированные клетки. Последнюю используют для лечения СПИДа и ВИЧ-инфицированных людей. 4 с. и 3 з.п.ф-лы, 9 ил., 4 табл.

Данное изобретение вообще относится к области молекулярной иммунологии и терапии синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Более конкретно данное изобретение относится к новым иммунотоксинам для лечения СПИД.

Так как более шести миллионов человек во всем мире инфицированы вирусом ВИЧ, имеется острая необходимость в эффективной терапии этого заболевания. Проводятся активные исследования по разработке вакцин, но в силу природы данного вируса, это исключительно трудная, долговременная задача. Кроме того, для каждого из имеющихся случаев СПИД применимо особое лечение. В настоящее время лишь одно лекарство азидотимидин (AZT) зарегистрировано для широкого применения в США. Однако имеются проблемы в случае штаммов ВИЧ, приобретающих устойчивость к AZT. По мере появления мутантных форм вируса степень устойчивости увеличивается. Согласно существующей теории устойчивости вируса этот вирус мутирует с такой высокой скоростью, что более устойчивые формы появляются довольно быстро. Однако недавние исследования показали, что эта устойчивость не является результатом гипермутабильности, а возможно является следствием высокого уровня репликации вируса.

Безотносительно к механизму устойчивости AZT становится неэффективным по истечении длительного периода времени. Это лечение является также крайне дорогостоящим и сопровождается рядом побочных эффектов, например тошнотой, пароксизмами, нарушениями функции печени и подавлением костного мозга. Другие химические варианты AZT, например DDC и DDI, вселяют надежды на стадии клинических испытаний, но они имеют ограниченную эффективность. Хотя используется ряд других лекарств и режимов лечения, ясно, что имеется настоятельная необходимость в других лекарствах и новых подходах к лечению этого заболевания.

Появляются некоторые надежды на подходы к лечению СПИД с помощью экспериментальной иммунотерапии, но большинство из них обнаруживают очень широкую вариабельность эффективности, главным образом вследствие высокой вариабельности природы молекул-мишеней. Эти молекулы-мишени, например белки оболочки ВИЧ, изменяются от штамма к штамму и от пациента к пациенту.

Однако терапия с помощью иммунотоксина обнаруживает очень высокую эффективность против ряда других заболеваний, когда имеется абсолютно специфическая мишень для антитела в составе конъюгата антитело-токсин. Например, экзотоксин из Pseudomonas соединили с моноклональным антителом против раковых опухолей яичника. Он эффективно подавлял рост раковых клеток яичника человека в мышиной модели (Willingham, М.С. et al., 1987). Что необходимо для иммунотерапии СПИД - это высокоспецифическая и неизменяющаяся мишень.

Фермент обратная транскриптаза (RT) ВИЧ является абсолютно критически важной для репликации вируса. Этот фермент играет основную роль в катализе образования копий ДНК генетического материала вируса (РНК). ДНК затем используется или непосредственно для генерации большего числа копий вируса, или для интеграции в геном пациента с последующей экспрессией при заболевании. Эта критическая роль обратной транскриптазы, по-видимому, является причиной ее высококонсервативной структуры. Кроме того, недавно было показано, что в процессе инфекции клеток вирусом ВИЧ копии обратной транскриптазы (или ее частей) прикрепляются к внешней поверхности клетки. Экспрессия обратной транскриптазы на поверхности клеток заметно больше, чем даже экспрессия белков оболочки вируса.

Предыдущий опыт в данной области имеет пробелы в эффективных средствах лечения синдрома приобретенного иммунодефицита. Данное изобретение восполняет эту давно существующую необходимость и потребность в указанной области.

В одном из разделов данного изобретения дается необходимый состав, включающий иммунотоксин, причем указанный иммунотоксин включает токсин, химически конъюгированный с моноклональным антителом против обратной транскриптазы вируса.

В другом разделе данного изобретения дается фармацевтический состав, включающий иммунотоксин, причем указанный иммунотоксин включает токсин, химически конъюгированный с моноклональным антителом против обратной транскриптазы вируса, и фармацевтически приемлемый носитель.

В еще одном разделе данного изобретения дается метод лечения синдрома приобретенного иммунодефицита, включающий стадию введения человеку, имеющему указанный синдром, фармакологически эффективной дозы нового состава данного изобретения.

В другом разделе данного изобретения дается метод лечения индивидуума, инфицированного вирусом иммунодефицита человека, включающий стадию введения указанному индивидууму фармакологически эффективной дозы нового состава данного изобретения.

Другие и дополнительные аспекты, особенности и преимущества данного изобретения будут видны из последующего описания предпочтительных в настоящее время разделов изобретения, приведенных с целью объяснения открытия.

Для того чтобы вопросы, касающиеся особенностей, преимуществ и объектов этого изобретения, а также другие вопросы, которые станут очевидными позже, приобрели ясность и могли быть понятными в деталях, могут потребоваться более конкретные описания изобретения, кратко суммированного выше, с помощью ссылки на определенные разделы изобретения, которые иллюстрируются в прилагаемых чертежах. Эти чертежи образуют часть спецификации. Однако необходимо отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют предпочтительные разделы этого изобретения и поэтому их совокупность не следует рассматривать в ограничительном смысле.

На фигуре 1 показана общая схема синтеза иммунотоксина (фигуры 1А, 1В, 1С, 1D).

На фигуре 2 показан иммунотоксин моноклональное антитело к транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская, направленный против штамма ВИЧ (HIV-AC-1), инфицирующего клетки Н9, при обработке клеток иммунотоксином в течение 24 или 48 часов.

На фигуре 3 показаны эффекты иммунотоксина моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская на ВИЧ-клеточную линию Н-9 и штамм ВИЧ РМ-213 после обработки клеток иммунотоксином в течение 24, 48 или 72 часов.

На фигуре 4 показана дозовая зависимость цитотоксичности иммунотоксина конструкции данного изобретения моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская после инкубации в течение 1 дня.

На фигуре 5 иллюстрируется дозовая зависимость цитотоксичности иммунотоксина данного изобретения моноклональное антитело к обратной транскриптазе-гелонин.

На фигуре 6 показано действие иммунотоксина моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская на клетки Н9 + HIV - 111В.

На фигуре 7 показан эффект обработки клеток Н9 + MN в течение 3 дней иммунотоксином данного изобретения моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская.

На фигуре 8 иллюстрируется действие иммунотоксина с гелонином данного изобретения на клетки Н9 плюс HIV - 111В при инкубации свыше 3 дней.

На фигуре 9 иллюстрируется действие иммунотоксина с гелонином данного изобретения на клетки Н9 плюс HIV - MN.

В данном изобретении предлагается разработка нового подхода к терапии синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) с помощью иммунотоксина. Схема терапевтического пути основана на адресной доставке предельно мощных токсинов, специфических для клеток, инфицированных вирусами СПИД, путем прицельного нахождения инфицированных клеток-мишеней с помощью моноклональных антител против обратной транскриптазы вируса. Очень высокий процент ВИЧ-инфицированных клеток экспрессирует на поверхности обратную транскриптазу вируса. Структура обратной транскриптазы ВИЧ очень мало меняется от штамма к штамму и от изолята к изоляту. Это отличает ее от большинства белков вируса ВИЧ, которые исключительно вариабельны. В данном изобретении найдены иммунотоксины, пригодные при использовании различных моноклональных антител против обратной транскриптазы ВИЧ-1 и разнообразных как одноцепочечных, так и двухцепочечных каталитических токсинов, инактивирующих рибосому, включая противовирусный белок из фитолакка американская, гелонин, А-цепь рицина, модецин и додекандрин.

Эффективность иммунотоксина зависит как от антитела, так и от токсина. Факторы, управляющие связыванием с клеткой, интернализацией, переносом с поверхности внутрь клетки и суммарной цитотоксичностью, усложнены и часто непредсказуемы. Поэтому очень трудно определить, какое моноклональное антитело следует конъюгировать с определенным токсином.

В данном изобретении устанавливается оптимальная дозовая кривая реакции для иммуноконъюгатов МАb-РАР (противовирусный белок из фитолакка американская) и МАd-Гелонин. Эти дозовые кривые реакции облегчают сравнение с другими типами препаратов иммуноконъюгата. В данном изобретении предложены также препараты иммуноконъюгатов, приготовленных с использованием тех же моноклональных антител, но содержащих токсины: рицин, А-цепь рицина и додекандрин ввиду их цитотоксичной эффективности против клеток, инфицированных ВИЧ.

В данном изобретении найдены другие моноклональные антитела против обратной транскриптазы ВИЧ-1. Каждое из этих моноклональных антител соединяли с РАР (противовирусный белок из фитолакка американская), гелонином, рицином, А-цепью рицина или додекандрином и подвергали испытанию на цитотоксичность.

В данном изобретении описывается необходимый состав, включающий иммунотоксин, причем в указанный иммунотоксин входит токсин, химически конъюгированный с моноклональным антителом против обратной транскриптазы вируса. Была приготовлена панель из более 70 мышиных моноклональные антител против обратной транскриптазы ВИЧ-1. Они различаются по принадлежности к 1gG и 1gМ классам и субтипу. В число характерных примеров моноклональных антител со специфичностью для обратной транскриптазы ВИЧ входят: HIVRT 10-1-а, HIVRT 2-2-F8, HIVRT 11-1-b, HIVRT 6-1-а, HIVRT 12-1-с, HIVRT 6-9, HIVRT 15-3, HIVRT 16-4, HIVRT 14-1-d, HIVRT 18-1, HIVRT 2-3-b, HIVRT 10-1-b u HIVRT 10-4.

В данном изобретении также дается метод лечения синдрома приобретенного иммунодефицита, включающий стадию введения человеку, имеющему указанный синдром, фармакологически эффективной дозы состава формулы изобретения 4.

В данном изобретении дается также метод лечения индивидуума, инфицированного вирусом иммунодефицита человека, включающий стадию введения указанному индивидууму фармакологически эффективной дозы состава данного изобретения.

Специально тщательно продумано, чтобы фармацевтические составы можно было приготовить с использованием новых иммунотоксинов данного изобретения. В таком случае фармацевтический состав включает новые иммунотоксины данного изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Специалист, имеющий обычную квалификацию в этой области, способен легко определить без излишней подготовки соответствующие дозы и способы введения различных иммунотоксинов, найденных в данном изобретении.

Дается также фармацевтический состав, включающий новые иммунотоксины данного изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические составы данного изобретения пригодны для использования в различных системах доставки лекарства. Краткий обзор современных методов доставки лекарства см. Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). Методы приготовления вводимых соединений уже известны или очевидны для специалистов в этой области и детально описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Faston, PA (1988).

При любом режиме лечения иммунотоксины данного изобретения могут быть введены пациенту или по одному, или в коктейле, содержащем два или более иммунотоксина, другие терапевтические средства, составы и т.п., включая, но не в ограничительном смысле, иммуносупрессанты; средства, индуцирующие толерантность; потенцирующие средства и средства, ослабляющие побочный эффект. Особенно предпочтительны иммуносупрессанты, пригодные для подавления аллергических реакций хозяина. Предпочтительными иммуносупрессантами являются преднизон, преднизолон, ДЕКАДРОН, циклофосфамид, циклоспорин, метотрексат и азатиоприн. Предпочтительными потенцирующими средствами являются монензин, хлористый аммоний, пергексилин, верапамил и амантадин. Все эти средства вводятся в общепринятых эффективных дозах, хорошо известных в этой области. Кроме того, если пациенты проявили иммунную реакцию на конкретный иммуноконъюгат, то в следующий раз могут быть использованы другие иммуноконъюгаты, отличающиеся от первого, или только по одному из компонентов, или как по моноклональному антителу, так и по токсину.

Иммунотоксины данного изобретения могут быть введены в виде препаратов для инъекции. Парентеральные формы лекарственных средств известны и удобны для применения в этом изобретении, например при внутримышечном или внутривенном введении. Формы лекарственных средств, содержащие терапевтически эффективные количества иммунотоксинов, представляют собой либо стерильные жидкие растворы, жидкие суспензии, или лиофильно высушенные препараты, и оптимально содержат стабилизаторы и наполнители. Лиофилизированные составы воспроизводятся с помощью соответствующих растворирителей, например водой для инъекции, солевым раствором, 0,3% глицином и т.п. в дозах приблизительно от 0,01 мг/кг веса тела хозяина до 10 мг/кг, где биологическая активность меньше или равна 20 нг/мл по измерениям в тесте с лизатами ретикулоцитов. В типичной схеме фармацевтический состав, содержащий иммунотоксины данного изобретения, вводится пациенту в количествах приблизительно от 0,01 мг/кг до 5 мг/кг веса пациента в течение времени от нескольких дней до приблизительно двух недель путем ежедневного внутривенного вливания. Точная концентрация, которую следует использовать в среде для лекарства, является предметом определения в умеренном экспериментальном манипулировании с целью оптимизации терапевтической реакции.

Иммунотоксины данного изобретения могут быть введены с помощью аэрозоля для достижения локализованной доставки в легкие. Это осуществляется путем приготовления водного аэрозоля, липосомным препаратом или твердыми частицами, содержащими иммунотоксин. Обычно водный раствор делается путем приготовления водного раствора или суспензии иммунотоксина вместе с приемлемыми носителями и стабилизаторами. Носители и стабилизаторы применяются в зависимости от требований для конкретного иммунотоксина, но к типичным относятся: неионные сурфактанты, нетоксичные белки, например альбумин, сложные эфиры сорбитана, лектин, аминокислоты, например глицин, и буферы, соли, сахара или сахарные спирты.

В других вариантах иммунотоксины данного изобретения могут быть введены орально с помощью такой системы доставки, как белковое инкапсулирование, как это описано Steiner, et al., U.S. Patent N 4925673. Типичные терапевтически эффективные оральные дозы иммунотоксина данного изобретения лежат в области от приблизительно 0,01 мг/кг веса тела до 50 мг/кг веса тела в день. Предпочтительные эффективные дозы находятся в области от приблизительно 0,05 мг/кг веса тела до приблизительно 5 мг/кг веса тела в день.

Иммунотоксины данного изобретения могут быть введены в растворе, рН раствора должна быть в области от рН 5 до 9,5, предпочтительно от рН 6,5 до 7,5. Иммунотоксин или его производные должны находиться в растворе, имеющем соответствующий фармацевтически приемлемый буфер, например фосфатный буфер, Трис(гидроксиметил) аминометан-НСl, или цитратный буфер, или им подобные. Концентрации буфера должны быть в области от 1 до 100 мМ. Раствор иммунотоксина может содержать также соль, например хлористый натрий в концентрации 50-150 мМ. В раствор можно также включить эффективное количество стабилизирующих средств, например альбумин, глобулин, желатин, протамин или соль протамина.

В данном изобретении дается также метод лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) у человека, включающий стадию введения человеку фармакологически эффективной дозы иммунотоксина данного изобретения, предназначенного для подавления репликации вируса ВИЧ.

Нижеследующие примеры даются с целью иллюстрации различных разделов данного изобретения, но ими ни коим образом не ограничивается содержание данного изобретения.

ПРИМЕР 1 Приготовление токсинов Каждый из токсинов, предназначенных для использования в качестве части иммунотоксина, может быть очищен с помощью стандартных опубликованных процедур. Процедуры, использованные для очистки белков, инактивирующих рибосомы, из экстрактов сходны для всех этих белков. Белки по их заряду преимущественно являются основными и не связываются с анионообменными смолами, например ДЭАЭ-целлюлозой. Типичные методологии очистки противовирусного белка из фитолакка американская даются в: Irvin, J.D., Arch. Biochem. Biophys., 169, 522-528 (1975); Irvin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 200, 418-425 (1980); Barbieri, et al., Biochem. J., 203, 55-59 (1982); Метод для гелонина дается в: Lambert, J. et al. in "Immunotoxins" рg 177 (1988) Stirpe, et al., J. Biol. Chem. 255, 6947-6953 (1980) и для додекандрина в Ready, et al., J. D. Biochim. Biophys. Acta 791, 314-319 (1984). Для достижения ультравысокой чистоты, как это требуется для возможных клинических испытаний, для РАР была разработана колонка с антителами для аффинной хроматографии. Эту технологию можно легко приспособить для других токсинов.

ПРИМЕР 2 Приготовление обратной транскриптазы ВИЧ Обратную транскриптазу ВИЧ можно приготовить по методу Konlstaedt and Steitz, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:1259 (1989). В схеме очистки обратной транскриптазы использовался клон экспрессии обратной транскриптазы, описанный Саммерсом и Д'Аквила (1989). Он был получен из AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Reagent Number pKRT2, Catalog Number 393, вложенный в банк др. Ричардом Д'Аквила и др. Уильямом С. Саммерсом.

ПРИМЕР 3 Приготовление моноклональных антител Типичный протокол для получения клеточных линий гибридом был следующим. У двух самцов (RT1 и RT11) и двух самок (RT111 и КТ1V) мышей balb/c шестинедельного возраста предварительно взяли кровь для негативного контроля и затем каждому животному путем инъекции ввели 10 микрограмм рекомбинантной обратной транскриптазы ВИЧ-1. Чистота этого белка была проверена на SDS-геле. Каждую мышь повторно иммунизировали обратной транскриптазой 3 раза по 2 микрограмма/иммунизацию. Образцы крови из каждой мыши затем экстрагировали и обнаружили, что они имеют титры от 60 000 до 80 000 (методологию см. ниже). Забили двух самок и у них взяли селезенки. Клетки, выделенные из иммунизированных селезенок, слили с клетками мышной миеломы. Эти слитые клетки выращивали в селективной среде (1 х HAT), в которой не могут расти сливаемые миеломные клетки. Эта среда содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Слитые миеломные и селезеночные клетки являются гибридомами. Каждая родительская гибридома была протестирована с помощью метода ЕLISA (см. ниже непрямой метод ELISA). Гибридомы, которые давали положительный тест, были проанализированы второй раз. Если гибридома при втором анализе имела положительный тест, часть этого родительского клона подращивали (размножали) и затем замораживали; вторую часть клона субклонировали. Эти первые субклоны также тестировали с помощью метода ELISA. Первые субклоны, которые давали положительный тест, выращивали и замораживали и часть субклонировали снова. Вторые субклоны, которые давали положительный тест, также выращивали и замораживали. Супернатанты от этих вторых субклонов с положительным тестом содержали моноклональные антитела, которые можно экстрагировать и очистить.

ПРИМЕР 4 Определение титра антител сыворотки мыши с помощью непрямого метода ELISA Антиген обратную транскриптазу разводили так, чтобы каждая лунка 96-луночной плоскодонной микроплаты для титрования (NUNC Immunoplate, Thomas Scientific) содержала 50 нанограмм антигена. Антиген инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации антиген вытряхивали и лунки блокировали 100 мкл блокирующего буфера/ячейку (0,1 М фосфорнокислый калий, 0,5% Твин 20, 1% бычий сывороточный альбумин, рН 7,0) при комнатной температуре 30 минут. Плату промывали три раза (промывочный буфер - 0,1 М фосфорнокислый калий, 0,5% Твин, рН 7,0) и добавляли разведенные образцы сыворотки. Инкубировали в течение ночи при 4^oС. Степень разведения была от 1: 250 до 1:80 000. На следующий день все переносили в комнатную температуру, плату промывали и готовили 1:1000 разведение Пероксидазы, конъюгированной с аффинночистыми анти-lgG мыши (AffiniPure Donkey Antimouse IgG) (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Inc). Конъюгат добавляли в каждую лунку и плату инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Плату снова промывали и на 20 минут добавили по 100 микролитров на лунку раствор субстрата (0,7 мг/мл 2,2'-азино-бис/3-этилбенз-тиазолил-6-сульфокислота/диаммониевая соль [ABTS] (Moss, Inc.). Затем реакцию остановили путем добавления 100 микролитров щавелевой кислоты/лунку. Поглощение измеряли при 414 нм с помощью сканера ELISA (Bio Rad model 2550). Результат считали положительным, если оптическая плотность (ОП) превышала 0,500. По этой шкале титры у всех четырех мышей были равны 1:80 000.

ПРИМЕР 5
Скрининг позитивных гибридом
Процедуру скрининга для обнаружения позитивных гибридом с помощью анализа клеточных супернатантов проводили согласно такому же протоколу, как для непрямого метода ELISA. Образцы клеточных супернатанта разводили 1:1 100 микролитрами промывающего буфера (0,1 М фосфорнокислый калий, 0,05% Твин-20, 1 мг/мл бычий сывороточный альбумин, рН 7). Используемым антигеном служила очищенная обратная транскриптаза. Ее вносили по 50 нанограмм на лунку. Все позитивные первые субклоны были протестированы повторно. Если они снова давали позитивные результаты, их субклонировали второй раз. Вторые субклоны также тестировали с помощью метода ELISA. Если второй субклон был позитивным во втором тесте, его размножали и замораживали для последующего использования в продукции моноклональных антител.

ПРИМЕР 6
Получение моноклональных антител из асцитной жидкости
Для получения асцитной жидкости использовали самок мышей balb/c двухнедельного возраста. Для увеличения продукции антител им сначала путем первой инъекции вводили пристан. Двенадцати мышам путем инъекции вводили гибридому HIVRT-10-l-a. Через 10 дней в брюшинной полости мыши появлялось заметное вздутие. Это указывало на наличие мягкой заполненной жидкостью опухоли, которую можно отсосать с помощью шприца с прецезионной гладкой иглой калибра 20 1/2 для удаления асцитной жидкости. Иглу вводили в перитонеальную полость вблизи верхней части голени. Каждый день место укола меняли, чтобы по возможности смягчить дискомфорт. Количество асцита, собранного от одной мыши, было от 0,2 мл до 3,0 мл. Асцитную жидкость, собранную в один день от одной и той же группы мышей, объединяли. Асцитную жидкость затем центрифугировали в центрифуге Sorvall Superspeed РС2-В, используя ротор Sorvall GSA при 3000g в стерильных уравновешенных пробирках объемом 15 мл в течение 15 минут. Слой жира сверху удаляли и асцитную жидкость отделяли от осадка клеточных обломков на дне пробирки. Сбор прекращали, когда мягкая наполненная жидкостью опухоль становилась твердой и асцитная жидкость больше не откачивалась из полости. К этому моменту мышь забивали. Асцитную жидкость для каждой линии гибридом объединяли. Асцитную жидкость хранили при 4^oС в стерильной пробирке.

ПРИМЕР 7
Очистка моноклональных антител с помощью G белка
Мышиную асцитную жидкость для линии гибридомы HIVRT -10-1-а очищали на колонке с G белком. G белок - Сефарозу получали от Sigma, продукт номер 54Н0145. Все процедуры с G белком выполняли при 4^oС согласно протоколу фирмы-производителя. Для оценки концентрации белка во фракциях моноклональных антител использовали тест Бредфорда (Bradford, M., 1976). Использовали микровариант этого теста, который был куплен у фирмы Bio-Rad (номер 500-0006)(Bio, Rad, 1984). Чистоту полученных антител проверяли с помощью электрофореза в SDS полиакриламидном геле. Обнаружено, что она была выше 95%.

ПРИМЕР 8
Схема синтеза иммунотоксина
Синтез иммунотоксина выполняли с помощью общепринятой постадийной процедуры: (1) Присоединение токсина к линкеру (фигура 1А); (2) Присоединение моноклонального антитела к линкеру (фигура 1В); (3) Восстановление комплекса токсин + линкер (фигура 1С; и (4) Соединение токсина с моноклональным антителом (фигура 1D). Использованная типичная процедура иллюстрируется на Фигуре 1. Чтобы весь синтез в целом дал удовлетворительный результат, каждая вышеприведенная стадия должна быть выполнена с высоким выходом и с очисткой продуктов. В данном примере растительные токсины сшивали с моноклональными антителами дисульфидной связью с помощью N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)-пропионата (SPDP). Получили среднее отношение токсина к антителу в интервале 1-2:1. Установлено, что эта технология воспроизводима и эффективна для получения единообразных конъюгированных иммунотоксинов. Детальная методология получения конъюгата моноклональное антитело - противовирусный белок из фитолакка американская описана ниже.

ПРИМЕР 9
Приготовление 2-пиридилтиопропионил-РАР (PDP-PAP)
PDP-PAP получили в реакции 0,16 мМ РАР с 0,48 мМ SPDP в конечном объеме 0,200 мл, забуференном 40 мМ фосфорнокислым натрием, рН 7,0. После инкубации в течение одного часа при 37^oС смесь разделяли на HPLC с белком Рак 300 SW, уравновешенном 50 мМ фосфорнокислым калием, рН 6,0. Фракции объемом 1 мл собирали в течение 25 минут. Фракции из пика сконцентрировали с помощью Speedvac. Пробу из этой концентрированной фракции проверяли на чистоту с помощью электрофореза в геле.

ПРИМЕР 10
Приготовление РDР - антитело
Моноклональные антитела инкубировали с трехкратным молярным избытком SPDP в течение 1 часа при 37^oС в 40 мМ фосфорнокислым калием, рН 7,0. Затем образец фракционировали с помощью HPLC хроматографии по исключенному размеру на колонке, уравновешенной 50 мМ фосфорнокислым калием, рН 6,0. Собрали двадцать пять фракций объемом 1 мл в течение 25 минут. Фракции из пика сконцентрировали с помощью Speedvas Небольшие образцы РDP-Mab проверили на чистоту с помощью SDS гель-электрофореза.

ПРИМЕР 11
Приготовление PDP - антитело
Моноклональные антитела инкубировали с трехкратным молярным избытком SРDP в течение 1 часа при 37^oС в 40 мМ фосфорнокислом натрие, рН 7,0. Затем образцы фракционировали с помощью HPLС хроматографии по исключенному размеру на колонке, уравновешенной 50 мМ фосфорнокислым калием, рН 6,0. Собрали двадцать пять фракций объемом 1 мл в течение 25 минут. Фракции из пика сконцентрировали с помощью Speedvac. Небольшие образцы PDP-MAb проверили на чистоту с помощью SDS гель-электрофореза.

В методах, описанных в данном изобретении, для химической сшивки моноклональных антител с токсином могут быть использованы самые различные поперечно сшивающие вещества. Характерными представителями пригодных поперечно сшивающих веществ являются сложный эфир m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBS), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP), альфа-иминотиолан гидрохлорид, метил 3-меркаптопропионимидат, Сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексам-1-карбоксилат (SМСС), 4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)-толуол (SMPT), N-сукцинимидил(4-иодоацетил)аминобензоат (S1AB) и сульфосукцинимидил 4-(р-малеимидофенил) бутират (SMPB).

С описанными здесь антителами могут быть химически сшиты самые различные токсины. Характерными примерами пригодных токсинов являются противовирусный белок из фитолакка американская, гелонин, рицин, абрин, модецин, додекандрин, сапорин, волкензин и викумин.

В другом варианте иммуноконъюгатами данного изобретения могут быть слитые белки, полученные с помощью методов генной инженерии, известных специалистам в этой области. Такой слитый белок должен содержать сайт распознавания антигена молекулы антитела и цитотоксическую составляющую токсина.

ПРИМЕР 12
Цитотоксичность иммуноконъюгатов
Эффективность конъюгатов в специфическом поражении инфицированных клеток по сравнению с неинфицированными клетками была продемонстрирована на различных линиях клеток in vitro. Различные концентрации иммунотоксинов добавляли к одной или более культур неинфицированных клеток и, соответственно, хронически инфицированных клеток, при этом последние излечивались от любых цитопатических эффектов вирусной инфекции. Жизнеспособность и рост клеток контролировали ежедневно с помощью теста на исключение пропидиумиодида и светорассеяния по профилю в проточном цитометре EPICS.

Были выполнены три отдельные серии испытаний на цитотоксичность с применением дисульфидносшитых иммуноконъюгатов противовирусного белка из фитолакка американская и гелонина, полученных как описано выше и протестированных против различных клеточных линий и/или различных штаммов ВИЧ. Характерные примеры этих цитотоксических тестов приведены ниже.

На фигуре 2 и в таблице I показаны результаты тестирования различных количеств иммунотоксина моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская, направленного против клеток Н9, инфицированных штаммом ВИЧ (HIV-AC-1) при обработке клеток иммунотоксином в течение 24 или 48 часов. После 24 часов инкубации иммунотоксин моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская убивал около 65% ВИЧ-инфицированных клеток и только 15% неинфицированных клеток (контроль). После 48 часов инкубации иммунотоксин моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская убивал около 95% ВИЧ-инфицированных клеток и только около 20% неинфицированных клеток (контроль). Видно, что имеется высокая специфичность иммунотоксина по отношению к ВИЧ-инфицированным клеткам.

На фигуре 3 и в таблице II показаны эффекты иммунотоксина моноклональное антитело к обратной транскриптазе противовирусный белок из фитолакка американская на HIV-клеточную линию Н9 и штамм ВИЧ, РМ-213. После обработки клеток иммунотоксином в течение 24, 48 или 72 часов. После 72 часов инкубации иммунотоксин моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская убивал фактически 100% ВИЧ-инфицированных клеток и только 20% неинфицированных клеток (контроль).

Линия клеток Н9, использованная в этих исследованиях, происходит из единичного клона Т-клеток, полученных из особой линии клеток НUТ 78 и отселектирована на высокий пермиссивный рост с вирусом ВИЧ-1. Дополнительную информацию об этой линии можно найти в каталоге National Institutes of Health AIDS Reference Research Reagent Catalog (January 1995). Моноклональные антитела, использованные для получения иммунотоксина, который взят для испытаний, приведенных на фигуре 2 и 3, получены от Др. Сармгадхарана. Клетки выращивали и поддерживали в инкубаторе с СО₂ при 37^oС.

Вторую серию испытаний выполняли с применением иммуноконъюгатов, содержащих противовирусный белок из фитолакка американская (РАР) и гелонин. Использованные в этом случае моноклональные антитела (HIVRT 10-1-а) были получены в Техасском университете в Остине, как описано выше. Как и выше, использовали линию клеток Н9 и штамм РМ213. Тест на цитотоксичность выполняли таким же образом, как выше. На фигуре 4 показана дозовая зависимость цитотоксичности иммунотоксина моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская данного изобретения после 1 дня инкубации. Обнаружено, что при увеличении концентрации иммунотоксина увеличивалась цитотоксичность в отношении ВИЧ-инфицированных клеток. Дозовая зависимость цитотоксичности для иммунотоксина моноклональное антитело к обратной транскриптазе - гелонин данного изобретения иллюстрируется на фигуре 5. Наблюдали, что иммунотоксины, содержащие РАР и гелонин, избирательно убивают ВИЧ-инфицированные клетки.

Третью и более широкую серию испытаний выполняли, используя такие же конструкции, содержащие РАР и гелонин. Методы тестирования цитотоксичности были такими же, какие использовали во второй серии испытаний. В серии этих экспериментов использованы штаммы ВИЧ HIV-111B и HIV-MN в линии клеток Н-9. Инкубацию проводили в течение 3 дней. Линии, содержащие вирус HIV-111B и MN, описаны в каталоге National Institutes of Health AIDS Reference Research Reagent Catalog (January 1995).

На фигуре 6 и в таблице III показано действие иммунотоксина моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская на клетки Н9 + HIV-111B. При дозе 1 нанограмм/мл иммунотоксин с противовирусным белком из фитолакка американская приводил к гибели 77% клеток после 3 дней инкубации. Приблизительно 90% клеток убивалось при дозе 10 нанограмм/мл. Небольшая токсичность проявлялась против неинфицированных клеток.

Н9 является неинфицированной линией клеток. Доза иммунотоксина дана в мкг/мл.

На фигуре 7 и в таблице III показан эффект обработки клеток Н9+MN в течение 3 дней иммунотоксином данного изобретения моноклональное антитело к обратной транскриптазе - противовирусный белок из фитолакка американская. При дозе 1 нанограмм/мл иммунотоксин РАР приводил к гибели около 50% клеток после 3 дней инкубации. Приблизительно 68% клеток убивалось при дозе 10 нанограмм/мл за такой же период времени инкубации. Как и выше, наблюдалась небольшая токсичность против неинфицированных клеток.

На фигуре 8 и в таблице IV иллюстрируется действие иммунотоксина с гелонином данного изобретения на клетки Н9 плюс HIV-111B при инкубации выше 3 дней. За 3 дня инкубации при дозе 1 нанограмм/мл иммунотоксин с гелонином приводил к гибели приблизительно 80% клеток. При дозе этого иммунотоксина 3,4 нанограмм/мл погибало приблизительно 90% клеток.

На фигуре 9 и в таблице IV иллюстрируется действие иммунотоксина с гелонином данного изобретения на клетки Н9+HIV-MN. При дозе 1 нанограмм/мл за 3 дня инкубации иммунотоксин с гелонином убивал приблизительно 80% клеток. При дозе иммунотоксина с гелонином 10 нанограмм/мл погибало приблизительно 93% клеток.

Н9 является линией неинфицированных клеток. Дозы иммунотоксина даны в мкг/мл.

В итоге, эти эксперименты по цитотоксичности прямо показывают, что различные моноклональные антитела против обратной транскриптазы ВИЧ можно комбинировать с различными типами растительных токсинов, что позволяет избирательно убивать клетки, инфицированные рядом различных штаммов ВИЧ. Эти результаты иллюстрируют возможность использования самых различных моноклональных антител против обратной транскриптазы ВИЧ и различных токсинов, объединенных в иммуноконъюгаты, для избирательной инактивации ВИЧ-инфицированных клеток.

Все патенты и публикации, упомянутые в этом описании, приводятся для иллюстрации уровня знаний в тех областях, к которым имеет отношение это изобретение. Все патенты и публикации включались в описание в виде ссылок в зависимости от того, в какой степени каждая отдельная публикация конкретна и характерна, чтобы на нее сделать ссылку.

С точки зрения специалистов в данной области легко понять, что данное изобретение может быть применено для достижения конечных целей и получения результатов и преимуществ, упомянутых выше, а также скрытых здесь в неявной форме. Приведенные примеры, касающиеся методов, процедур, обработок, молекул и специальных соединений, описанных здесь, являются типичными из числа предпочтительных вариантов и служат в качестве иллюстраций, но ими не ограничивается содержание изобретения в целом. Изменения в них и другие применения могут быть осуществлены специалистами в данной области, которым по профилю близко данное изобретение в том виде, как оно формулируется совокупностью формул изобретения.

Формула изобретения

1. Иммунотоксин, обладающий цитотоксическим действием на ВИЧ-инфицированные клетки, представляющий собой токсин, выбранный из группы противовирусных белков, химически конъюгированный с моноклональным антителом против обратной транскриптазы вируса ВИЧ.

2. Иммунотоксин по п.1, отличающийся тем, что указанные противовирусные белки выбирают из группы, состоящей из противовирусного белка фитолакки американской, гелонина, рицина, абрина, модецина, додекандрина, сапорина, волкензина и викумина.

3. Иммунотоксин по п. 1, отличающийся тем, что указанный иммунотоксин является химически конъюгированным с помощью соединений, образующих поперечные сшивки, выбираемых из группы, включающей сложный эфир m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (МВS). N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP), альфа-иминотиолан-гидрохлорид, метил 3-меркаптопропионимидат, сукцинимидил 4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), 4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридидитио)-толуол (SMPT), N-сукцинимидил(4-иодоацетил)аминобензоат (SIAB) и сульфосунцинимидил-4-(р-малеимидофенил)бутират (SMPB).

4. Иммунотоксин по п.2, отличающийся тем, что токсин является гелонином.

5. Фармацевтическая композиция, обладающая цитотоксическим действием на ВИЧ-инфицированные клетки, отличающаяся тем, что она содержит эффективное количество иммунотоксина по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Способ лечения синдрома приобретенного иммунодефицита, отличающийся тем, что он включает стадию введения человеку терапевтически эффективной дозы композиции по п.5.

7. Способ лечения индивидуума, инфицированного вирусом иммунодефицита человека, отличающийся тем, что он включает стадию введения человеку терапевтически эффективной дозы композиции по п.5.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13