Способ количественного определения катехоламинов в моче

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения катехоламинов - адреналина (AD) и норадреналина (NAD). Способ обеспечивает снижение трудозатрат и сокращение времени анализа. Проводят электрохимическое концентрирование катехоламинов из мочи на поверхности стеклоуглеродного электрода с последующей регистрацией вольтамперных кривых при скорости развертки потенциала 20 мВ/с и определение концентрации катехоламинов по высоте аналитического сигнала. При этом при определении катехоламина-адреналина концентрирование проводят на стеклоуглеродном электроде в течение (T_э) 60 с, при потенциале (Е_э) 0,1 В на фоне 0,1 н. нитрата аммония, а определение концентрации по высоте аналитического сигнала в диапазоне потенциалов 0,6 - 0,7 В, а при определении катехоламина-норадреналина концентрирование проводят на стеклоуглеродном электроде в течение (T_э) 120 с при потенциале - 0,3 В на фоне 0,2 н. гидрофосфата натрия, а определение концентрации по высоте аналитического сигнала в диапазоне потенциалов 0,2 - 0,3 В. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионно-вольтамперометрическому способу определения катехоламинов: адреналина (AD) и норадреналина (NAD).

Катехоламины - гормоны, вырабатываемые надпочечниками человека. Введение в кровь адреналина и норадреналина сопровождается учащением и усилением сердцебиения, гипергликемией, повышением артериального давления. По содержанию катехоламинов в организме человека можно судить о наличии или отсутствии целого ряда серьезных заболеваний. Своевременное введение адреналина в сердце приводит к восстановлению его работы после остановки сердечной деятельности.

AD и NAD относятся к производным пирокатехина. Адреналин по своему строению представляет метил-амино-этанол-пирокатехин. Норадреналин отличается от адреналина отсутствием метильной группы.

Актуальность и необходимость количественного определения катехоламинов объясняется специфичностью их свойств. То обстоятельство, что продукты глубокого окисления катехоламинов обладают противоположными фармакокинетическими эффектами, требует осторожности при использовании этих активных препаратов и знания количественного их содержания в организме. К этому побуждает также наличие в организме регуляторных процессов, которые в ответ на раздражение адреналином могут дать компенсаторные сдвиги более значительные, чем изменения исходные, вызванные введенным адреналином.

Определение AD и NAD на сегодняшний день представляет большие технические и экономические трудности.

Для количественной оценки катехоламинов используются методы ВЭЖХ [1-2], а также иммунофлюоресцентные и спектрофотометрические методы [3-5]. Недостатками этих методов являются дороговизна аппаратуры и наборов реактивов, несовершенство существующих методов детектирования и трудоемкость из-за необходимости дополнительной пробоподготовки объекта (длительность пробоподготовки может доходить до 8-24 ч). Все предложенные методы не внедрены в широкую практику медицины.

Сведения по определению количественного содержания катехоламинов вольтамперометрическим или инверсионно-вольтамперометрическим методами отсутствуют.

Известен инверсионно-вольтамперометрический способ определения лекарственных веществ [6]. Осадок вещества концентрируют (Т_э=180 с) на фоне 0,01-0,1 М раствора перхлората или 0,05-0,1 М раствора серной кислоты в неводном апротонном растворителе диметилформамида или в водно-спиртовых средах в диапазоне потенциалов 0,35-0,45 В с последующей регистрацией вольтамперных кривых при значениях потенциалов 0,0-0,25 В.

Наиболее близким способом определения является инверсионно-вольтамперометрический способ определения лекарственного вещества, взятый за прототип [7]. Осадок вещества концентрируют в течение (Т_э) 60 с на поверхности стеклоуглеродного электрода на фоне 0,1 М хлорида калия при потенциале электролиза Е_э = -0,1 В с последующей регистрацией вольтамперных кривых относительно хлорсеребряного электрода.

Использование условий, приведенных в способе прототипа, делает невозможным применение данного способа для определения катехоламинов в биологических средах.

Целью изобретения является увеличение чувствительности и экспрессности способа определения AD и NAD методом адсорбционной инверсионной вольтамперометрии. Поставленная цель достигается тем, что проводят электрохимическое накопление AD и NAD на поверхности электрода с последующей регистрацией поляризационных кривых.

Новым в способе является то, что электрохимическое накопление адреналина и норадреналина проводят на поверхности стеклоуглеродного электрода при потенциалах электролиза Е_э 0,1 и -0,3 В соответственно. Фоновым раствором при определении AD является 0,1 н. раствор нитрата аммония, рН 5-6; при определении NAD - 0,2 н. раствор гидрофосфата натрия, рН 6-7. Время накопления (Т_э) составляет соответственно 60 и 120 с с последующей регистрацией поляризационных кривых при линейной скорости развертки потенциала 20 мВ/с. Концентрации веществ определяют по высоте аналитических сигналов в диапазоне потенциалов: 0,6-0,7 В при определении адреналина; 0,3-0,4 В при определении норадреналина.

В предлагаемом способе определения катехоламинов проводят на фоне 0,1 н. раствора нитрата аммония, рН 5-6 (для AD) и 0,2 н. раствора гидрофосфата натрия, рН 6-7 (для NAD), которые ранее применялись для количественного определения веществ электрохимическими методами. Значения концентраций и рН подобраны экспериментально. При указанных рН гормоны устойчивы и определение их концентраций становится достаточно точным.

При значениях рН 3-4 при определении AD наблюдается раздвоение аналитического сигнала, а при рН 6-7 сигнал исчезает вообще. Аналитический сигнал NAD при рН<6 невоспроизводим, а в сильно щелочной среде имеет место размытый пик, что затрудняет дальнейшую обработку вольтамперных кривых.

Другим отличительным признаком являются установленные условия электрохимического накопления: Е_э = 0,1 В для AD и Е_э = -0,3 В для NAD. В прототипе потенциал электролиза -0,1 В, который не позволяет накапливать катехоламины на индикаторном электроде.

Важным для определения катехоламинов методом инверсионной вольтамперометрии является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной экспериментально установленной является 20 мВ/с. Увеличение скорости линейно меняющегося потенциала увеличивает чувствительность, но при этом растет ток заряжения (увеличивается остаточный ток).

Время предварительного электролиза выбирают в зависимости от концентрации определяемого вещества. Оптимальное значение Т_э = 60 с для определения AD и Т_э 120 с для определения NAD, при этом достигается максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности электрода и хорошая воспроизводимость для количественного определения веществ.

В предлагаемом способе в качестве индикаторного электрода использовали стеклоуглеродный электрод (СУ) из-за хорошей воспроизводимости аналитического сигнала, широкой рабочей области и низкого значения остаточного тока.

Установленные условия впервые позволили определять AD путем регистрации вольтамперных кривых при потенциалах 0,6-0,7 В на фоне 0,1 н. нитрата аммония.

Установленные условия впервые позволили определять NAD путем регистрации вольтамперных кривых при потенциалах 0,3-0,4 В на фоне гидрофосфата натрия.

Нижняя граница определяемых концентраций С_н этих соединений равна 1•10^-10 г/мл. Относительное стандартное отклонение (S_r) для диапазона концентраций 1•10^-9-1•10^-5 г/мл не превышает 0,1.

Все условия определения AD и NAD подобраны экспериментально. Приготовления фоновых и стандартных растворов органических соединений в воде являются общепринятыми.

Пример 1. Определение адреналина в моче методом инверсионной вольтамперометрии.

В кварцевый стаканчик емкостью 10 мл наливают 5 мл фонового раствора 0,1 н. нитрата аммония, рН 5-6. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода 0,001% в течение 30 с. Отключают газ и по истечении 10 с успокоения проводят электролиз раствора при условии Е_э = 0,1 В и Т_э = 60 с. Вольтамперограмму фиксируют при скорости развертки потенциала 20 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют N капель объемом 60 мкл пробы мочи, перемешивают раствор и проводят электрохимическое концентрирование осадка при Е_э = 0,1 В, Т_э = 60 с. Аналитический сигнал регистрируют в диапазоне потенциалов 0,6-0,7 В при чувствительности прибора 1•10^-8 А/мм.

Затем делают добавку стандартного раствора адреналина 1•10^-4 г/мл объемом 100 мкл, деаэрируют раствор азотом.

Электрохимическое концентрирование осадка и фиксирование вольтамперограммы проводят в тех же условиях.

Продолжительность единичного анализа не превышает 5 минут.

Пример 2. Определение норадреналина в моче методом инверсионной вольтамперометрии.

В кварцевый стаканчик емкостью 10 мл наливают 5 мл фонового раствора 0,1 н. гидрофосфата натрия, рН 6-7. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода 0,001% в течение 30 с. Отключают газ и по истечении 10 с успокоения проводят электролиз раствора при условии Е_э = -0,3 В и Т_э = 120 с. Вольтамперограмму фиксируют при скорости развертки потенциала 20 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют N капель объемом 100 мкл пробы мочи, перемешивают раствор и проводят электрохимическое концентрирование осадка при Е_э = -0,3 В, Т_э = 120 с. Аналитический сигнал регистрируют в диапазоне потенциалов 0,3-0,4 В при чувствительности прибора 1•10^-8 А/мм.

Затем делают добавку стандартного раствора норадреналина 1•10^-4 г/мл объемом 100 мкл, деаэрируют раствор азотом. Электрохимическое концентрирование осадка и фиксирование вольтамперограммы проводят в тех же условиях.

Продолжительность единичного анализа не превышает 5-7 мин.

Определение адреналина и норадреналина проводилось на автоматическом анализаторе ТА-1. Расчет неизвестных концентраций определяемых веществ осуществлялся с программным обеспечением компьютера, основанного на методе стандартных добавок.

Предварительная пробоподготовка мочи исключается, так как во время ее проведения совместно с белками осаждаются адреналин и норадреналин. В связи с чем сигналы в пробе значительно уменьшаются и размываются. Поэтому пробу суточной мочи готовят простым подкислением серной кислотой до рН 4,5-5,5. Основной состав биологических объектов не влияет на количественное определение.

Установленные экспериментальные условия определения адреналина и норадреналина методом инверсионной вольтамперометрии позволяют определять лекарственные препараты в биологических средах.

Источники информации 1. Boos K., Wilmers В., Saueres R., Schlimme E./ Devement and performance of an automated HPLC-analysor catecholamines.// J. Chromatogrphia.-1987, v.-24.-p.363-366.

2. Parry R. C., Gisch D.J., Wachob G.D./ Plasma sample cleanup for catecholamines analysis using weak cation exchange solid phase extraction.// J.Liquid Chromatogr.- 1987.-v.10.-N 11. -p.2429-2438.

3. Salem F.B./ Spektrophоtometric and fluorimetric determination of catecholamines.// Anall. Lett.-1993.-v.26.-N2.-p.281-294.

4. Berzas Nevdo J.J., Lemus G., Buitrago L./ Spekctrophotometric determination of catecholamines with metaperiodate by flow-injection analysis.// Anal. Chim.acta.-1995.-v.300.-N 1.- 3.-p.293-297.

5. Sankar D. G., Sastry C.S., Reddy M.N./ Spekctrophotometric determination of adrenaline and noradrenaline.// Indian Drugs.-1991.-v.28, N 6.-р. 272-274.

6. A. c. 3002953/18-25. Анисимова Л.С., Катюхин В.Е., Тигнибидина Л.Г., Печенкин А.Г. Инверсионно-волтамперометрический способ определения лекарственных веществ. 1980 г.

7. Ивановская Е.А., Карпов Р.С. / Определение аскорбиновой кислоты в биологических средах методом инверсионной вольтамперометрии.// Журнал аналитической химии. 1997.-Т.52, N 7.-С.773-774.

Формула изобретения

1. Способ количественного определения катехоламинов в моче, отличающийся тем, что проводят электрохимическое концентрирование катехоламинов из мочи на поверхности стеклоуглеродного электрода с последующей регистрацией вольтамперных кривых при скорости развертки потенциала 20 мВ/с и определение концентрации катехоламинов по высоте аналитического сигнала.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрирование проводят на стеклоуглеродном электроде в течение (T_э) 60 с при потенциале (Е_э)0,1 В на фоне 0,1 н нитрата аммония, а определение концентрации по высоте аналитического сигнала в диапазоне потенциалов 0,6 - 0,7 В при определении катехоламина-адреналина.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрирование проводят на стеклоуглеродном электроде в течение (T_э) 120 с, при потенциале - 0,3 В на фоне 0,2 н гидрофосфата натрия, а определение концентрации по высоте аналитического сигнала в диапазоне потенциалов 0,2 - 0,3 В при определении катехоламина - норадреналина.