Способ сорбции иммунной сыворотки крови

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве специфических, высокоактивных диагностических сывороток. Иммуносорбцию неспецифических антител осуществляют водорастворимыми гетерологичными антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, в качестве которого используют алюмосиликат с магнитными свойствами, модифицированный полиглюкином и активированный вторичным алкилсульфатом натрия, а процесс сорбции проводят однократно. Технический результат изобретения заключается в упрощении процесса сорбции при сохранении активности иммунных сывороток.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве специфических, высокоактивных диагностических сывороток.

Сыворотки крови, полученные иммунизацией животных, как правило, недостаточно специфичны, поэтому необходима сорбция неспецифических антител, дающих перекрестные реакции с гетерологичными антигенами.

Известно использование в качестве адсорбентов корпускулярных антигенов [Производство бактериальных препаратов и диагностика особо опасных инфекций (Сб. науч. раб. противочумных учреждений). Саратов, 1966, с. 143-169].

Для получения специфической сыворотки против V-, W-антигенов чумного микроба используют γ-глобулиновую фракцию лошадиной чумной агглютинирующей сыворотки, адсорбированной ацетонвысушенными клетками штамма Оттена 556 и фракцией 1. Чувствительность полученной сыворотки при выявлении V- и W-антигенов методом преципитации составляет 1,5-3•10⁹ м.к./мл.

Противочумные агглютинируюшие сыворотки от лошадей, иммунизированных штаммом ЕВ, имеют титры к Y.pestis EV 1:320 -1:640, к микробам псевдотуберкулеза грызунов - 1:5120, к штаммам семейства Enterobacteriacea 1:80 - 1: 1280. Для получения противочумных люминесцирующих антител проводят адсорбцию исходной сыворотки. В качестве адсорбентов используют высушенные ацетоном микробы шероховатых штаммов дизентерии Зонне и псевдотуберкулеза грызунов, выращенные при 28^oС.

Адсорбцию нативной сыворотки проводят последовательно под контролем реакции агглютинации. Проводят 1-2 насыщения 5-10 мл сухих микробных тел на 1 мл сыворотки. После первой адсорбции титр сыворотки, агглютинировавшей микробы дизентерии Зонне, снижается с 1:1280 до 1:320, после второй - до 1:40. Титр сыворотки к штамму ЕВ почти не изменяется.

Культурой псевдотуберкулеза сыворотку адсорбируют 2-3 раза в количестве 100 мг/мл для одного насыщения. Смесь выдерживают 2 ч при 37^oС и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 45 мин. После адсорбции противочумная сыворотка агглютинирует культуру EV, выращенную при 37^oС в прежнем титре 1:320, в то время как титр к микробам EV, выращенным при 28^oС, снижается до 1:80-1: 160, а к микробам псевдотуберкулеза грызунов - до 1:40.

Процесс адсорбции нативной сыворотки корпускулярными гетерологичными антигенами очень трудоемок, требует приготовления культуры микробов и приводит к потере активности истощенной сыворотки.

Известен способ сорбции диагностических поливалентных сывороток для идентификации жгутикового антигена Escherichia coli [А.с. СССР N 1338153, А 61 К 39/02, от 23.09.91, БИ 35].

По этому способу сыворотки освобождают адсорбцией от гетерологичных антител с помощью штаммов той же серогруппы, которую использовали для иммунизации животных.

Преимуществом способа является получение адсорбента для одновременного удаления соматических и гетерологичных Н-антител.

Тем не менее, способ трудоемок, не исключается и процесс адсорбции гомологичных антител.

Наиболее близким к заявляемому является способ иммуносорбции сибиреязвенных сывороток [Профилактика чумы и других природно-очаговых инфекций (тезисы докладов Всесоюзной научной конференции) т.2, Ставрополь, 1983, с. 81-82].

Согласно этому способу повышение специфичности антиспоровых сибиреязвенных сывороток осуществляют иммуносорбцией неспецифических антител водорастворимыми гетерологичными антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе.

В качестве иммуносорбента используют полиакриламидный гель с иммобилизованными термостабильными споровыми антигенами аэробных спорообразующих сапрофитов. Иммобилизацию осуществляют полимеризацией концентрированного раствора антигена в полиакриламидном геле, с последующим измельчением и отмывкой.

В эксперименте по иммуносорбции используют иммуноглобулины с концентрацией белка 25 мг/мл. Иммуносорбцию проводят дважды. Специфичность адсорбированных иммуноглобулинов проверяют иммунофлуоресцентным методом.

В эксперименте было исследовано 18 штаммов сапрофитов. Результаты исследования показали, что нативные иммуноглобулины проявляли неспецифические свойства с 12 штаммами сапрофитов. После первой иммуносорбции неспецифические результаты выявлялись в 3-4 случаях. Повторная иммуносорбция позволила полностью избавиться от неспецифических результатов.

После каждой иммуносорбции исследуемого препарата иммуносорбент регенерируют отмывкой 10-кратным объемом 3 М роданида калия и 0,9% раствором хлористого натрия. Регенерированный иммуносорбент используют в экспериментах не менее 10-12 раз без существенного снижения сорбционной емкости.

Достоинства способа-прототипа заключаются в возможности регенерации и повторного использования иммуносорбентов.

Недостатками способа-прототипа является сложность подготовки иммуносорбентов, использование дорогостоящих импортных, канцерогенных реактивов, недостаточная сорбционная емкость, что вызывает необходимость 2-кратной сорбции препарата.

Технический результат изобретения заключается в упрощении процесса сорбции иммунных сывороток за счет подготовки иммуносорбента: сокращение этапов сорбции и процесса выделения жидкой фазы при сохранении активности нативной сыворотки.

Технический результат изобретения достигается тем, что иммуносорбцию неспецифических антител осуществляют водорастворимыми гетерологичными антигенами, иммобилизованными на твердофазных носителях, в качестве которых используют алюмосиликат с магнитными свойствами, модифицированный полиглюкином, активированный вторичным алкилсульфатом натрия, процесс сорбции проводят однократно.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа по отношению к прототипу являются использование в качестве твердофазного носителя алюмосиликата с магнитными свойствами, модифицированного полиглюкином, активированного вторичным алкилсульфатом натрия, однократное проведение иммуносорбции.

Известен способ получения иммуносорбента на основе смеси алюмосиликата с магнитным порошком, модифицированной полиглюкином, активированной вторичным алкилсульфатом натрия с иммобилизованными лигандами [Патент РФ 2138813, G 01 N 33/543, А 61 К 39/385 // G 01 N 33/531, 33/551, 33/569, С 12 N 11/14, от 27.09.99, БИ 27].

Алюмосиликат является мелкодисперсным наполнителем, представляющим собой комплексные анионы алюминия и кремния с избыточным отрицательным зарядом, который компенсирован щелочноземельными металлами. Носитель обладает повышенными адгезионными свойствами по сравнению с полиакриламидом и силохромами, что позволяет смешивать его с магнитным порошком без предварительной подготовки последнего.

Модифицирование носителя полиглюкином обеспечивает повышение интенсивности последующей активации носителя вторичным алкилсульфатом натрия, увеличение специфической емкости сорбента и его чувствительности.

В процессе сорбции иммунной сыворотки использование этого иммуносорбента позволяет не только освободить препарат от неспецифических антител на одном этапе, но и сохранить первоначальную активность нативной сыворотки.

Магнитные свойства иммуносорбента позволяют упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования.

Используемые иммуносорбенты, так же как и в прототипе, возможно регенерировать и использовать 10-12 раз.

Таким образом, использование доступных отечественных материалов, простота технологии, сохранение активности иммунных сывороток обуславливают возможность использования заявляемого способа в массовым производстве высокоспецифичных, активных диагностических сывороток.

Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. Исследовали иммунную сыворотку от кроликов, иммунизированных комплексным водорастворимым антигеном возбудителя бруцеллеза. В иммунофлуоресцентном анализе нативные иммуноглобулины при активности 1:800 проявляли неспецифическую активность со штаммом Fr.tularensis Schu. Были подготовлены магноиммунносорбенты: к 2,5 г алюмосиликатного носителя добавляли 25 мл дистиллированной воды, 15 мл 6%-ного раствора полиглюкина и 0,5 г магнитного порошка. Перемешивали и проводили гелеобразование в течение 1 ч при температуре 22-26^oС. Прокаливали в течение 20-30 мин при температуре 110-130^oС, измельчали и методом рассева выделяли фракции с размером частиц 80-120 микрон.

Для химического активирования данных магносорбентов нами разработано модифицирование твердофазных носителей вторичным алкилсульфатом натрия, для чего к 0,2 г магносорбента добавляли 1,5 мл 0,1 М ФСБ рН 7,2-7,4 и 0,1 мл вторичного алкилсульфата натрия, инкубировали 1 ч в термостате. Иммобилизацию антигенов на поверхности магносорбентов проводили следующим образом: к активированному сорбенту добавляли по 1 мл туляремийных водорастворимых антигенов с концентрацией белка 3,5 мг/мл, инкубировали в течение 1-2 ч, при температуре 37^oС. Промывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия до "0" экстинции на спектрофотометре и исследовали в иммуноферментном анализе (ИФА). Иммуносорбцию проводили, приливая 10 мл сыворотки бруцеллезной к 1 г соответствующего сорбента, инкубировали в термостате при температуре (37±1)^oС в течение 16 ч и в холодильнике при температуре 4-5^oС. После инкубации, придерживая постоянным магнитом, сливали сыворотку и исследовали в РНИФ. До сорбции бруцеллезная сыворотка давала перекрест со штаммом Fr.tulsrensis Schu, после сорбциии сыворотка была специфична без потери активности. Сорбент регенерировали 3 М раствором калия роданистого и отмывали 0,1 М раствором фосфатно-солевого буфера рН 7,4.

Пример 2. Выполняли аналогично примеру 1, за исключением того, что исследовали иммунную сыворотку от баранов, иммунизированных водорастворимым антигеном возбудителя сибирской язвы 34 F₂ Sterne. Магноиммуносорбенты готовили с гетерологичными водорастворимыми антигенами B.cereus 8, 104, 111, 250. Было исследовано 20 штаммов-сапрофитов. Нативная сыворотка в рабочем разведении (1: 3200) проявляла неспецифические свойства с 6 штаммами B.cereus, с 3 штаммами B-subtilis и 3 штаммами В.mеgаtеrium. Иммуносорбция позволила избавиться от неспецифических компонентов при сохранении активности.

Пример 3. Выполняли аналогично примеру 1, за исключением того, что исследовали иммунную сыворотку от кроликов, иммунизированных водорастворимым антигеном возбудителя туляремии. В реакции непрямой геммаглютинации (РНГА) нативные иммуноглобулины при активности 1:320 проявляли неспецифическую активность со штаммом Bг.abortus 19.

Магноиммуносорбенты готовили с комплексными гетерологичными водорастворимыми антигенами Br.abortus, адсорбировали аналогично вышеописанному, после сорбции сыворотка была специфична без потери активности.

Адсорбированные сыворотки были использованы для получения эритроцитарных, иммуноферментных и иммунофлуоресцентных диагностических препаратов.

Таким образом, преимущества заявляемого способа, перед способом прототипа проявляются в значительном упрощении процесса иммуносорбции нативных иммунных сывороток при достижении необходимой специфичности и сохранении активности.

Формула изобретения

Способ сорбции иммунной сыворотки крови, включающий иммунносорбцию неспецифических антител водорастворимыми гетерологичными антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, отличающийся тем, что в качестве твердофазного носителя используют алюмосиликат с магнитными свойствами, модифицированный полиглюкином и активированный вторичным алкилсульфатом натрия, а иммунносорбцию проводят однократно.