Усовершенствованные вакцины

 

Изобретение относится к медицине и представляет вакцинные конъюгаты, иммуногенные полипептиды, кодирующие иммуногенные полипептиды молекулы нуклеиновых кислот, клетки-хозяева, содержащие кодирующие иммуногенные полипептиды молекулы нуклеиновых кислот, и методы получения вакцинных конъюгатов и иммуногенных полипептидов так же, как и кодирующих иммуногенные полипептиды молекул нуклеиновых кислот. Кроме того, изобретение представляет IgE-вакцину, которая вызывает ответ на "свой" IgE у млекопитающих. Изобретение обеспечивает уменьшение эффектов IgE антител у млекопитающего путем уменьшения общего и связанного с рецептором количества IgE антител у млекопитающего. 6 с. и 20 з.п.ф-лы, 7 ил.

Изобретение относится к методам и материалам, используемым в лечении различных заболеваний, таких как инфекции и IgE-зависимые заболевания. Более конкретно, изобретение относится к методам и материалам, которые могут быть использованы для вакцинации млекопитающего от "своих" антигенов и "чужих" антигенов. Например, описанные здесь методы и материалы могут быть использованы для уменьшения эффекттов IgE антител у млекопитающего.

Уровень техники Млекопитающие являются восприимчивыми ко многим заболеваниям и расстройствам, включающим бактериальные инфекции, вирусные инфекции и IgE-зависимые заболевания, такие как аллергии. В общем, инфекции характеризуются внедрением и размножением микроорганизмов (например, бактерий, грибков и вирусов) внутри тканей тела. Многие типы инфекций можно лечить и предупреждать с использованием вакцин. Например, вакцина против полиомиелита может предупреждать полиовирусные инфекции. Обычно вакциной является суспензия ослабленных и убитых микроорганизмов.

IgE-зависимые заболевания опосредуются классом иммуноглобулинов, обозначаемых как иммуноглобулин Е (IgE). В действительности, IgE антитела являются основной причиной реакций гиперчувствительности, обнаруживаемых у популяции человека, в отличие от их очень низких концентраций в плазме крови человека (10-400 нг/мл) в норме. Эффекты являются следствием взаимодействия IgE антител с высокоаффинным рецептором к IgE на стволовых клетках и базофильных лейкоцитах. Перекрестное сшивание IgE рецепторов на поверхности этих типов клеток, например, при связывании аллергена инициирует высвобождение некоторого числа физиологически активных субстанций, таких как гистамин, PAF (фактор активации тромбоцитов), гепарин, лейкотриены, простагландины, тромбоксаны и хемотаксические факторы к эозинофильным и нейтрофильным гранулоцитам. По-видимому, эти медиаторы являются причиной прямых симптомов IgE-зависимых аллергических реакций (гиперчувствительность типа I). Болезненные состояния, принадлежащие к этой группе, могут включать астму, аллергии на пух, пыльцевые аллергии, пищевые аллергии и экзему.

Высокоаффинный рецептор к IgE был охарактеризован. Показано, что этот рецептор присутствует на стволовых клетках, базофильных лейкоцитах, эозинофилах, моноцитах и клетках Лангерганса. В дополнение, рецептор является комплексом трех различных субъединиц (α, β и γ-цепей). α-Цепь локализована главным образом внеклеточно и предполагается, что она взаимодействует с молекулой IgE. Предыдущие исследования эпсилон-цепи молекулы IgE навели на мысль, что участок из 76 аминокислот на границе между СН2 и СН3 доменами (СН используется применительно к константным доменам в тяжелых цепях) является важным для взаимодействия между молекулой IgE и ее высокоаффинным рецептором. В дополнение было показано, что соответствующий этому участку пептид ингибирует взаимодействие между нативным IgE и его высокоаффинным рецептором in vitro в молярной пропорции приблизительно 1:1 по сравнению с целым участком СН2-СН3-СН4 (Helm et al., Nature 331, 180-183 (1988)). Также было показано, что этот пептид ингибирует IgE-опосредованную flare реакцию при стимуляции аллергеном. В этом случае, тем не менее, концентрация была примерно в 10 раз больше концентрации, необходимой для проявления такого же ингибирующего эффекта с нативным IgE (Helm et al., Proc. Natl. Acad. Set. USA 86, 9465-9469 (1989)).

Сущность изобретения Изобретение относится к методам и материалам, используемым в лечении различных заболеваний, таких как инфекции и IgE-зависимые заболевания. Более конкретно, изобретение относится к методам и материалам, которые могут быть использованы для вакцинации млекопитающего от "своих" антигенов и "чужих" антигенов. Например, описанные здесь методы и материалы могут быть использованы для уменьшения эффектов IgE антител у млекопитающего путем уменьшения общего и связанного с рецептором количества IgE антител у млекопитающего. Такие методы и материалы могут быть использованы для лечения атопических аллергий у млекопитающих, таких как люди, собаки и свиньи.

Изобретение основано на открытии, что вакцинный конъюгат может быть сконструирован с содержанием по крайней мере двух полипептидов, причем каждый полипептид имеет по крайней мере два сходных аминокислотных участка, таким образом, что введение конъюгата млекопитающему может индуцировать иммунный ответ на по крайней мере часть одного из полипептидов. Такие иммунные ответы могут быть более сильными, чем ответы, индуцированные любыми полипептидами в неконъюгированной форме или любым конъюгатом полипептидов, не содержащих по крайней мере двух похожих аминокислотных участков. Поэтому описанные здесь вакцинные конъюгаты могут быть использованы для предоставления млекопитающим надежной защиты от широкого круга или "своих" антигенов (например, молекул IgE) или "чужих" антигенов (например, вирусных полипептидов).

Изобретение также основано на открытии, что вакцинный конъюгат может быть сконструирован с содержанием полипептида, обладающего такой цитокиновой активностью, что против другого полипептида внутри конъюгата индуцируется мощный иммунный ответ. Такие иммунные ответы могут быть более сильными, чем ответы, индуцированные конъюгатом, не содержащим обладающего цитокиновой активностью полипептида. Не будучи ограниченным каким-либо конкретным механизмом действия, конъюгат, содержащий обладающий цитокиновой активностью полипептид, так же как и иммуногенный полипептид, предположительно сосредотачивает цитокиновую активность в ограниченном участке, содержащем иммуногенный полипептид. Поэтому обладающий цитокиновой активностью полипептид может стимулировать клетки, участвующие в генерации специфического иммунного ответа на иммуногенный полипептид.

В дополнение, изобретение основывается на открытии, что полипептиды, содержащие часть "своих" IgE и часть "чужих" IgE, являются иммуногенными и вызывают ответ на "свои" IgE у млекопитающих. Такие иммуногенные полипептиды могут быть использованы в качестве вакцины для индукции ответа на "свои" IgE, который противодействует гиперчувствительности, индуцированной "своими" IgE антителами. Не будучи ограниченными каким-либо конкретным механизмом действия, описанные здесь иммуногенные полипептиды индуцируют образование "чужих" IgE антител, которые предположительно обладают специфичностью к части той молекулы IgE, которая взаимодействует с высокоаффинным IgE рецептором. После образования "чужие" IgE антитела могут взаимодействовать со "своими" IgE антителами таким образом, что "свои" IgE антитела становятся неспособными к связыванию с высокоаффинным IgE рецептором. Это ингибирование связывания с рецептором предположительно уменьшает гиперчувствительность, индуцированную "своими" IgE антителами. Поэтому степень IgE-индуцированных эффектов может быть уменьшена, если будет образовываться больше "чужих" IgE антител.

В общем, изобретение обрисовывает иммуногенный полипептид, имеющий часть "своих" IgE и часть "чужих" IgE. Иммуногенный полипептид является способным индукцировать ответ на "свои" IgE у млекопитающего (например, человека). "Своя" часть по крайней мере может содержать часть СН3 домена IgE. Полипептид может быть способным димеризоваться с образованием растворимого иммуногенного димера, способного индуцировать ответ на "свои" IgE у млекопитающего. Часть "чужих" IgE может содержать первый участок и второй участок частью "своих" IgE, расположенных между первым и вторым участками части "чужих" IgE. Первый участок может содержать по крайней мере часть СН2 домена IgE, и второй участок может содержать по крайней мере часть СН4 домена IgE. Часть "чужих" IgE может содержать последовательность IgE, присутствующую у неплацентарных млекопитающих (например, опоссума, утконоса, коалы, кенгуру, валлаби или вомбата). В части "своих" IgE может недоставать СН2 домена IgE антител. Иммуногенный полипептид может содержать эукариотическую посттрансляционную модификацию. В дополнение, иммуногенный полипептид может содержать полигистидиновую последовательность. Ответ на "чужие" IgE может быть поликлональным.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, которая кодирует иммуногенный полипептид. Иммуногенный полипептид содержит часть "своих" IgE так же, как и часть "чужих" IgE, и является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Молекула нуклеиновой кислоты может содержать добавочную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая способствует секреции иммуногенного полипептида в эукариотических клетках.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает клетку-хозяина (например, эукариотическую клетку), содержащую молекулу нуклеиновой кислоты с последовательностью, которая кодирует иммуногенный полипептид. Иммуногенный полипептид содержит часть "своих" IgE так же, как и часть "чужих" IgE, и является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает растворимый иммуногенный димер, содержащий два иммуногенных полипептида, способных димеризоваться с образованием растворимого иммуногенного димера. Каждый из двух иммуногенных полипептидов содержит часть "своих" IgE так же, как и часть "чужих" IgE, и растворимый иммуногенный димер является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцину, содержащую иммуногенный полипептид, имеющий часть "своих" IgE и часть "чужих" IgE. Иммуногенный полипептид является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Вакцина может содержать фармацевтически приемлимый носитель.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает метод получения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуногенный полипептид, который является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Метод включает комбинирование первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты с образованием молекулы нуклеиновой кислоты, где первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, представленной у млекопитающего, и где вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, не представленной у млекопитающего.

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает метод получения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуногенный полипептид, который является способным индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Метод включает (а) подбор первой последовательности нуклеиновой кислоты, где первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, представленной у млекопитающего, (b) подбор второй последовательности нуклеиновой кислоты, где вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, не представленной у млекопитающего, и (с) комбинирование первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты с образованием молекулы нуклеиновой кислоты.

В другом аспекте, изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Комплекс содержит первый и второй полипептиды. Каждый из полипептидов содержит по крайней мере две сходные аминокислотные последовательности с по крайней мере пятью аминокислотными остатками в длину. В дополнение, первый и второй полипептиды соединены с образованием комплекса и введение комплекса млекопитающему вызывает иммунный ответ на на по крайней мере часть первого или второго полипептидов. Первый и/или второй полипептиды может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Первый и второй полипептиды могут быть идентичными и могут образовывать димер. Соединение первого и второго полипептидов может включать дисульфидную связь. Соединение первого и второго полипептидов может включать нековалентное взаимодействие. Первый и/или второй полипептид может содержать линкерный сайт (например, полигистидиновую последовательность). Амино- и карбоксильные концы первого и/или второго полипептида могут содержать линкерный сайт. Комплекс может включать связывающую молекулу (например, антитело, такое как антиполигистидиновое антитело). Связывающая молекула может связывать первый и второй полипептиды. Комплекс может содержать третий полипептид, причем третий полипептид обладает цитокиновой активностью. Цитокиновой активностью может быть активность цитокина, такого как интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, и колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов. Связывающая молекула может связывать третий полипептид с первым и вторым полипептидами. Сходные аминокислотные последовательности могут быть более чем около двадцати аминокислотных остатка в длину. Комплекс может содержать блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-CD32 антитело).

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Комплекс содержит первый полипептид, связанный со вторым полипептидом, причем первый полипептид содержит по крайней мере две сходные аминокислотные последовательности с по крайней мере пятью аминокислотными остатками в длину. В дополнение, второй полипептид обладает цитокиновой активностью и введение комплекса млекопитающему вызывает иммунный ответ на по крайней мере часть первого полипептида. Первый полипептид может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Соединение первого и второго полипептидов может включать нековалентное взаимодействие. Первый и/или второй полипептид может содержать линкерный сайт (например, полигистидиновую последовательность). Например, амино- и карбоксильные концы первого полипептида могут содержать линкерный сайт. Комплекс может содержать связывающую молекулу (например, антитело, такое как антиполигистидиновое антитело). Цитокиновой активностью может быть активность цитокина, такого как интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, и колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов. Комплекс может содержать третий полипептид. Первый и третий полипептиды могут быть идентичными и могут образовывать димер. Соединение первого и третьего полипептидов может включать дисульфидную связь. Сходные аминокислотные последовательности могут быть более чем около двадцати аминокислотных остатка в длину. Комплекс может содержать блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-СD32 антитело).

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Комплекс содержит первый, второй и третий полипептиды, где первый, второй и третий полипептиды соединены с образованием комплекса. Первый полипептид обладает первой цитокиновой активностью. Второй полипептид обладает второй цитокиновой активностью. Введение комплекса млекопитающему вызывает иммунный ответ на по крайней мере часть третьего полипептида. Третий полипептид может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Соединения первого, второго и третьего полипептидов могут включать нековалентные взаимодействия. Первый, второй и третий полипептиды могут содержать линкерный сайт. Комплекс может содержать связывающую молекулу. Третий полипептид содержит по крайней мере две сходные аминокислотные последовательности с по крайней мере пятью аминокислотными остатками в длину. Комплекс может содержать блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-СD32 антитело).

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Комплекс содержит первый полипептид, связанный со вторым полипептидом, где первый полипептид является полипептидом, обладающим активностью интерферона-α или интерферона-β, и введение комплекса млекопитающему вызывает иммунный ответ на по крайней мере часть второго полипептида. Второй полипептид может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Соединения первого и второго полипептидов могут включать нековалентные взаимодействия. Первый и/или второй полипептид может содержать линкерный сайт. Комплекс может содержать связывающую молекулу. Второй полипептид содержит по крайней мере две сходные аминокислотные последовательности с по крайней мере пятью аминокислотными остатками в длину. Комплекс может содержать блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-CD32 антитело).

В соответствии с другим осуществлением изобретение обрисовывает вакцинный комплекс для вакцинации млекопитающего (например, человека). Вакцина содержит блокирующую молекулу Fc-гамма рецептора II (например, анти-CD32 антитело) и полипетид, причем введение вакцины млекопитающему вызывает иммунный ответ на по крайней мере часть полипептида. Полипептид может содержать аминокислотную последовательность, экспрессируемую млекопитающим. Блокирующая молекула Fc-гамма рецептора II и полипептид могут быть связаны и соединение может включать нековалентное взаимодействие.

Если не оговорено иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют те же значения, что и однозначно понимается средним специалистом в данной области, к которой относится это изобретение. Хотя методы и материалы, сходные или равноценные описанным здесь, могут быть использованы в практике или тестировании данного изобретения, подходящие методы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие указанные здесь ссылки включены в качестве ссылки во всей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет рассматриваться дополнительно. В дополнение, материалы, методы и примеры служат исключительно для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема притязаний настоящего изобретения.

Другие детали и преимущества изобретения будут выявлены из последующего детального описания и формулы изобретения.

Описание рисунков Фиг. 1 является диаграммой, сравнивающей аминокислотные последовательности СН2-СН3-СН4 доменов IgE человека, крысы и опоссума в верхнем, среднем и нижнем уровнях соответственно. Последовательность опоссума также содержит N-концевую сигнальную последовательность с последующими шестью гистидиновыми остатками.

Фиг. 2А-В содержат диаграммы, сравнивающие аминокислотные последовательности различных полипептидов, содержащих следующие компоненты: CH2 опоссума - СН3 крысы - СН4 опоссума (ORO); СН2 опоссума - N-конец СН3 крысы - С-конец СН3 опоссума - СН4 опоссума (ORO-trunc); CH2 опоссума - СН3 мыши - СН4 опоссума (ОМО); СН2-СН3-СН4 опоссума (OOO); СН2-СН3-СН4 утконоса (РРР); CH2 опоссума - СН3 человека - СН4 опоссума (ОНО); CH2 опоссума - СН3 свиньи - СН4 опоссума (ОРО) и CH2 опоссума - СН3 собаки - СН4 опоссума (ODO). Стрелки показывают края доменов.

Фиг. 3А-С содержат диаграммы, отображающие анализ иммунных ответов на иммуногенный полипептид ORO in a panel of трех различных линий крыс. Уровень IgG анти-IgE антител крысы, нацеленных против нативных IgE крысы, измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Нативные IgE крысы использовали в концентрации 5 μг/мл для покрытия ELISA чашек. Последовательные пятикратные разведения сыворотки крови от каждой из особей крысы тестировали цветной реакцией с помощью ELISA. Из каждой линии шесть вакцинированных крыс анализировали вместе четырьмя контрольными крысами.

Фиг. 4 является диаграммой, отображающей анализ иммунных ответов на иммуногенный полипептид ORO, так же как и на контрольные полипептиды OOO и РРР.

Подробное описание Изобретение представляет методы и материалы для лечения различных заболеваний, таких как инфекции и IgE-зависимые заболевания. Более конкретно, изобретение представляет методы и материалы, которые могут быть использованы для вакцинации млекопитающего от "своих" антигенов и "чужих" антигенов. Например, описанные здесь методы и материалы могут быть использованы для уменьшения эффектов IgE антител у млекопитающего путем уменьшения общего и связанного с рецептором количества IgE антител у млекопитающего.

1. Вакцинные конъюгаты Изобретение представляет вакцинные конъюгаты, которые содержат по крайней мере два полипептида, каждый из которых имеет по крайней мере два сходных аминокислотных участка. Используемый здесь термин "конъюгат" используется применительно к любой композиции, содержащей по крайней мере два полипептида, которые прямо или опосредованно соединены через одну или более ковалентную или нековалентную связи. Например, конъюгат может содержать десять последовательно связанных полипептидов (например, номер один связан с номером два, номер два связан с номером три, номер три связан с номером четыре и т.д.). Используемый здесь по отношению к полипептидам термин "связанный" используется применительно к любому типу ковалентной или нековалентной связи, включая, без ограничения, одинарные связи, двойные связи, тройные связи, дисульфидные связи, водородные связи, гидрофобные взаимодействия, Вандер-Ваальсовы взаимодействия и их любые комбинации. Например, дисульфидная связь может соединять полипептид номер один с полипептидом номер два. Альтернативно, антитело может соединять полипептиды номер один и два. В этом случае каждый из полипептидов один и два может содержать эпитоп, распознающийся антителом таким образом, что получающийся конъюгат содержит полипептид номер один, нековалентно связанный с антителом, которое нековалентно связано с полипептидом номер два. Отмечено, что полипептид номер один или два в этом примере может иметь идентичную аминокислотную последовательность.

Используемый здесь термин "аминокислотные участки" используется применительно к смежным участкам аминокислотной последовательности полипептида. Например, аминокислотная последовательность от 30 до 40 остатков внутри содержащего 100 аминокислот полипептида может считаться аминокислотным участком. Для целей данного изобретения аминокислотный участок может быть любой длины, большей чем пять аминокислотных остатков (например, более чем шесть, семь, восемь, девять, десять, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150 или 200 аминокислотных остатков). Поэтому аминокислотный участок может быть целым СН3 доменом IgE антитела.

Используемый здесь по отношению к по крайней мере двум аминокислотным участкам термин "сходный" означает, что участки являются по крайней мере на 50 процентов идентичными в аминокислотной последовательности. Например, сходные аминокислотные участки могут быть на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100 процентов идентичными. Для целей данного изобретения процент идентичности аминокислотной последовательности между одним аминокислотным участком и другим расчитывался следующим образом. Во-первых, аминокислотные последовательности двух аминокислотных участков выравнивали с использованием програмного обеспечения по выравниванию последовательности MEGALIGN® (DNASTAR, Madison, WI, 1997), следующего алгоритму Jotun Heim с опциями по умолчанию. Во-вторых, определяется число совпадающих позиций между двумя выравненными аминокислотными последовательностями. Совпадающая позиция используется применительно к позиции, в которой идентичные остатки появляются в тех же самых позициях, что и выравненные с использованием программного обеспечения по выравниванию последовательности MEGALIGN®. В-третьих, число совпадающих позиций делили на общее число позиций и полученное значение умножали на 100 с получением процента идентичности.

Итак, вакцинный конъюгат содержит по крайней мере два полипептида, каждый из которых имеет по крайней мере два сходных аминокислотных участка. Поэтому вакцинный конъюгат может содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 15, 20, 25 или 30 полипептидов, каждый из которых имеет по крайней мере два сходных аминокислотных участка. Отмечено, что полипептид, содержащий по крайней мере два сходных аминокислотных участка, может содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более сходных аминокислотных участков. В дополнение к полипептидам, содержащим по крайней мере два сходных аминокислотных участка, вакцинный конъюгат изобретения может содержать любое число полипептидов, неимеющих по крайней мере два сходных аминокислотных участка. Например, вакцинный конъюгат может содержать четыре полипептида, каждый из которых имеет участок в 30 аминокислотных остатков, повторяющийся три раза так же, как и два полипептида, в каждом из которых недостает сходных аминокислотных участков.

Обычно вакцинный конъюгат содержит действующий в качестве антигена полипептид, на который вызывается иммунный ответ. Поэтому вакцинный конъюгат в рамках изобретения может содержать любой тип полипептида, включая, без ограничения, бактериальные полипептиды, грибковые полипептиды, вирусные полипептиды и полипептиды млекопитающих. Например, вакцинный конъюгат может содержать пять вирусных полипептидов гепатита С. Отмечено, что каждый полипептид конъюгата может иметь идентичные аминокислотные последовательности. В дополнение, полипептид вакцинного конъюгата обычно содержит сходные аминокислотные участки, каждый из которых может действовать в качестве определенной антигенной единицы, на которую вызывается иммунный ответ. Поэтому полипептид вакцинного конъюгата может содержать сходные аминокислотные участки, которые соответствуют любому участку полипептида, включая, без ограничения, участки связывания рецептора, участки связывания лиганда, активные участки ферментов, участки высвобождения полипептидных субстратов ферментов, участки связывания антигена антител и эпитопы, распознающиеся антителами. Например, полипептид вакцинного конъюгата может содержать три сходных аминокислотных участка, каждый из которых соответствует активному участку фермента X. Отмечено, что сходные аминокислотные участки могут быть расположены друг за другом или рассеяны по всему протяжению полипептида. Обычно введение вакцинного конъюгата вызывает образование антител, имеющих специфичность по отношению к эпитопу, образованному по крайней мере частью сходных аминокислотных участков внутри одного из полипептидов вакцинного конъюгата.

Любой метод может быть использован для получения полипептидов вакцинного конъюгата, включая, без ограничения, прокариотические системы экспрессии, эукариотические системы экспрессии и методы химического синтеза. В дополнение, полипептид вакцинного конъюгата может быть получен из естественных источников тканей. Например, гликополипептид головного мозга может быть получен из ткани головного мозга. Обычно каждый отдельный полипептид конъюгата делают независимо или выделяют независимо и затем используют для образования конъюгата. Отмечено, что полипептиды могут быть очищены перед тем, как будут использованы для образования конъюгата. Любой метод может быть использован для очистки полипептидов, включая, без ограничений, фракционирование, центрифугирование и хроматографию. Например, содержащие полигистидиновую последовательность полипептиды могут быть очищены с использованием аффинной хроматографии. Будучи полученными, полипептиды могут быть соединены с использованием любого метода. Например, образец полипептида может быть инкубирован со связывающей молекулой таким образом, что отдельные полипептиды формируют конъюгаты. Связывающая молекула является любой молекулой, которая соединяет два полипептида. Обычно связывающей молекулой является молекула с двумя реактивными группами или сайтами, с которыми способны взаимодействовать с образованием связи между аминокислотными остатками два полипептида. Связывающей молекулой может быть специфическая связывающая молекула, такая как антитело, или неспецифическая связывающая молекула, такая как химический реагент (например, глутаральдегид или формальдегид).

Любое антитело может быть использовано в качестве связывающей молекулы. Например, антиполигистидиновое антитело или антитело против эпитопной метки, такое как антитело против FLAG®-эпитопа или антитело против гемагглютининовой (НА) метки, могут быть использованы для соединения полипептидов. FLAG®-эпитопы описаны в Патентах США 4,703,004 и 4,782,137. Отмечено, что для связывания со специфической связывающей молекулой полипептиды должны содержать специфический участок, распозноваемый связывающей молекулой. Например, для связывания двух полипептидов с антиполигистидиновым антителом каждый полипептид должен содержать полигистидиновый эпитоп, распозноваемый этим антителом. Для целей данного изобретения специфический участок, распознаваемый специфической связывающей молекулой, такой как антитело, называется линкерным участком. Любой метод может быть использован для получения содержащего линкерный участок полипептида таким образом, что указанное антитело может быть использовано в качестве связывающей молекулы. Например, традиционные методы молекулярного клонирования могут быть использованы для введения нуклеиновой кислоты, которая кодирует FLAG®-эпитопную метку, в нуклеиновую кислоту, которая кодирует специфический полипептид. Отмечено, что линкерный участок может быть локализован в любой позиции. Например, полигистидиновая последовательность может быть в N-концевом участке, С-концевом участке или во внутренней части полипептида. В дополнение, полипептид может содержать более чем один линкерный участок. Например, полипептид может иметь полигистидиновую последовательность во внутренней части так же, как и в С-концевом участке. Более того, полипептид может содержать различные линкерные участки. Например, полипептид может иметь полигистидиновую последовательность во внутренней части FLAG-эпитопной метки в С-концевом участке.

В некоторых случаях два или более полипептидов могут быть получены таким образом, что они соединены через ковалентную связь. Например, два полипептида могут быть получены в качестве слитого белка таким образом, что они соединены пептидной связью. Альтернативно, полипептид может быть получен в клеточной линии, которая способствует образованию дисульфидных связей между, например, двумя идентичными полипептидами. В этом случае конъюгат является гомодимером. Отмечено, что любой полипептид может быть получен с содержанием одного или более цистеиновых остатков таким образом, что полипептиды формируют конъюгаты через цистеиновые мостики. Например, полипептид может быть получен с содержанием N-концевых и С-концевых цистеиновых остатков таким образом, что конъюгаты различной величины образуются внутриклеточно.

В дополнение, взаимодействие между биотином и авидином может быть использовано для образования конъюгатов. Например, полипептиды могут быть сконструированы или химически обработаны с получением молекул биотина в С-концевых и N-концевых участках. Эти биотинсодержащие полипептиды могут быть инкубированы с молекулами авидина, которые способны одновременно взаимодействовать с двумя или более молекулами биотина. В этом случае одна молекула авидина может связывать два биотинсодержащих полипептида с образованием конъюгата. Затем хелатирующие молекулы, которые могут одновременно связывать два или более ионов (например, Ni++, Cu++, Co++ и Zn++), могут быть использованы для формирования конъюгатов. Например, хелатирующая медь молекула, которая может взаимодействовать с двумя ионами меди, может быть использована для связывания двух полипептидов, содержащих полигистидиновую последовательность. В этом случае один ион меди может взаимодействовать с каждой полигистидиновой последовательностью, в то время как одна хелатирующая медь молекула связывает два полипептида с формированием конъюгата. Отмечено, что иммунностимулирующие комплексы (iscoms) могут быть использованы для формирования конъюгатов. Например, iscom может быть сконструирован с содержанием ионов меди таким образом, что содержащие полигистидиновую последовательность полипептиды могут быть конъюгированы.

Обычно молекула нуклеиновой кислоты сконструирована таким образом, что специфический полипептид является экспрессированным. Например, молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована для кодирования полипептида, имеющего три сходных аминокислотных участка, так же как и полигистидиновую последовательность в его С-конце. Будучи сконструированной, молекула нуклеиновой кислоты может быть интродуцирована в клетку-хозяина таким образом, что вырабатывается полипептид. Может быть использована любая клетка-хозяин, включая, без ограничений, прокариотические клетки (например, бактерии) и эукариотические клетки (например, клетки человека). Будучи произведенным, полипептид может быть очищен и использован для получения требуемого вакцинного конъюгата.

Используемый здесь термин "нуклеиновая кислота" заключает в себе РНК и ДНК, включая кДНК, геномную ДНК и синтетическую (например, химически синтезированную) ДНК. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечная или одноцепочечная. Одноцепочечная нуклеиновая кислота может быть смысловой цепью или антисмысловой цепью. В дополнение, нуклеиновая кислота может быть кольцевой или линейной.

Нуклеиновая кислота может быть получена с использованием традиционных процедур и методов молекулярного клонирования и химического синтеза нуклеиновых кислот, включая PCR. PCR используется применительно к процедуре или методу, в котором нуклеиновая кислота-мишень амплифицируется способом, сходным с описанным в Патенте США 4,683,195 и описанными в нем последующими модификациями процедуры. В общем, информация конца последовательности интересующего участка или beyond используется для конструирования олигонуклеотидной затравки, которая является идентичной или сходной с последовательностью противоположных цепей потенциальной матрицы, которую амплифицируют. Используя PCR, последовательность нуклеиновой кислоты может быть амплифицирована с РНК или ДНК. Например, последовательность нуклеиновой кислоты может быть изолирована путем PCR-амплификации с общей клеточной РНК, общей геномной ДНК и кДНК так же, как и с последовательностями бактериофага, плазмидными последовательностями, вирусными последовательностями и подобными. Когда в качестве источника матрицы используется РНК, для синтеза комплеметарных цепей ДНК может быть использована обратная транскриптаза.

Для интродукции нуклеиновой кислоты в клетку может быть использован любой метод. Фактически, для каждого опытного в этой области специалиста известно множество методов введения нуклеиновой кислоты в клетки как in vivo, так и in vitro. Например, осаждение фосфатом кальция, электропорация, температурный шок, липофекция, микроинъекции и вирусопосредованный перенос нуклеиновой кислоты являются традиционными методами введения нуклеиновой кислоты в клетки. В дополнение, депротеинизированная ДНК может быть доставлена прямо в клетку in vivo, как описано (Патент США 5,580,859 и Патент США 5,589,466, включая их продолжения). Далее, нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетки путем выведения трансгенных животных. Отмечено, что трансгенные животные, такие как кролики, козы, овцы и коровы, могут быть сконструированы таким образом, что большие количества полипептида секретируются в их молоко.

Трансгенными животными могут быть водные животные (такие как рыба, акулы, дельфин и подобные), сельскохозяйственные животные (такие как свиньи, козы, овцы, коровы, лошади, кролики и подобные), грызуны (такие как крысы, морские свинки и мыши), приматы, кроме человека (такие как бабуины, мартышки и шимпанзе), и домашние животные (такие как собаки и кошки). В этой области известны несколько методов, которые могут быть использованы для интрадукции нуклеиновой кислоты животным для производства стволовых линий трансгенных животных. Такие методы включают, но не ограничиваются, пронуклеарную микроинъекцию (Патент США 4,873,191); ретровирусопосредованный перенос гена в зародышевые линии (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-6152 (1985)); трансфекцию гена в эмбриональные стволовые клетки (Gossler A. et аl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:9065-9069 (1986)); нацеливание гена в эмбриональные стволовые клетки (Thompson et al., Cell, 56: 313-321 (1989)); нуклеарный перенос соматических ядер (Schnieke AE. et al., Science, 278:2130-2133 (1997)) и электропорацию эмбрионов.

Для обзора методов, которые могут быть использованы для производства и исследования трансгенных животных, опытные спецалисты могут использовать Gordon (Intl. Rev. Cytol. , 115:171-229 (1989)) и могут получить дополнительные руководства из, например: Hogan et al. "Manipulating the Mouse Embryo" Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1986); Krimpenfort et al., Bio/Technology, 9:844-847 (1991); Palmiter et al., Cell, 41:343-345 (1985); Kraemer et al., "Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo" Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1985); Hammer et al., Nature, 315: 680-683 (1985); Purscel et al., Science, 244:1281-1288 (1986); Wagner et al. , Патент США 5,175,385 и Krimpenfort et al., Патент США 5,175,384.

В дополнение, нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид, может содержаться в клетке в любой форме. Например, нуклеиновая кислота может быть интегрирована в геном клетки или содержаться в эписомальном состоянии. Другими словами, клетка может быть стабильной или временным трансформантом.

Далее, любой метод может быть использован для управления экспрессией специфического полипептида. Такие методы включают, без ограничения, конструирование нуклеиновой кислоты таким образом, что регуляторный элемент способствует экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. Обычно регуляторные элементы являются последовательностями ДНК, которые регулируют экспрессию другой последовательности ДНК на уровне транскрипции. Таким образом, регуляторные элементы включают, без ограничения, промотеры, энхансеры и тому подобное.

В соответствии с осуществлением конъюгат для вакцинации крыс может быть сконструирован с содержанием полипептидов, имеющих N-концевую полигистидиновую последовательность с последующими СН2 доменом IgE опоссума, СН3 доменом IgE крысы, СН2 доменом IgE опоссума, СН3 доменом IgE крысы, СН4 доменом IgE опоссума и С-концевой полигистидиновой последовательностью. Альтернативно, за первым СН2 доменом IgE опоссума могут следовать три СН3 домена IgE крысы в противоположность только одному СН3 домену IgE крысы. В любом случае, два полипептида могут быть соединены через дисульфидные связи таким образом, что формируются димеры. Отмечено, что для очистки содержащих полигистидиновую последовательность полипептидов может быть использована аффинная хроматография. В дополнение, для соединения некоторого числа отдельных полипептидов или димеров через N-концевые и С-концевые полигистидиновые последовательности в качестве связывающей молекулы может быть использовано антиполигистидиновое антитело. Например, три димера могут быть последовательно связаны через два антиполигистидиновых антитела (т.е. димер один соединяется с димером два антителом один, и димер два соединяется с димером три антителом два). Отмечено, что смешивание полипептидов со связывающей молекулой может приводить к образованию вакцины, которая содержит вакцинные конъюгаты различных размеров и с различными комбинациями полипептидов. Например, вакцина может содержать значительное количество вакцинных конъюгатов, имеющих менее четырех полипептидов, вместе с несколькими, имеющими более четырех полипептидов. Также отмечено, что общая конфигурация полипептидов в вакцинном конъюгате может быть адаптирована для вакцинации млекопитающих, отличных от крыс. Например, для вакцинации человека домены IgE крысы могут быть замещены доменами IgE человека.

2. Вакцинные конъюгаты и цитокины Изобретение представляет вакцинные конъюгаты, которые содержат обладающий цитокиновой активностью полипептид таким образом, что на другой полипептид конъюгата индуцируется мощный иммунный ответ. Такие иммунные ответы могут быть более мощными, чем ответы, индуцированные конъюгатом с отсутствием обладающего цитокиновой активностью полипептида. Не будучи ограниченным каким-либо конкретным механизмом действия, вакцинный конъюгат, содержащий полипептид Х и обладающий цитокиновой активностью полипептид, предположительно сосредотачивает цитокиновую активность в ограниченной зоне, содержащей полипептид X. Поэтому вакцинный конъюгат, содержащий обладающий цитокиновой активностью полипептид, может стимулировать клетки, которые принимают участие в генерации специфического иммунного ответа на другие полипептиды вакцинного конъюгата.

Обладающий цитокиновой активностью полипептид может иметь любой тип цитокиновой активности. Например, полипептид может обладать активностью интерферона-α, интерферона-β, интерферона-γ, TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18 и колониестимулирующим фактором гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF). Важно отметить, что обладающий цитокиновой активностью полипептид может быть полипептидом, который является природным или неприродным. Природным полипептидом является любой полипептид, имеющий обнаруженную в природе аминокислотную последовательность, включая полипептиды дикого типа и полиморфные полипептиды. Такие природные полипептиды могут быть получены из любых видов, включая, без ограничений, человека, шимпанзе, бабуина, крыс или мышей. Например, интерферон-α человека может быть использован в вакцинном конъюгате. Неприродным полипептидом является любой полипептид, имеющий не обнаруженную в природе аминокислотную последовательность. Поэтому неприродный полипептид может быть мутацией природного полипептида или сконструированным полипептидом. Например, неприродный полипептид, обладающий активностью интерферона-α, может быть мутантной формой природного, обладающего активностью интерферона-α полипептида, который сохраняет по крайней мере некоторую активность интерферона-α. Полипептид может быть изменен путем, например, добавлений последовательностей, делеций последовательностей и/или замещений с использованием стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез соответственной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность.

Конъюгат может содержать любое количество обладающих цитокиновой активностью полипептидов. Например, конъюгат может содержать два обладающих цитокиновой активностью полипептида. В дополнение, конъюгат может содержать полипептиды, обладающие разной цитокиновой активностью. Например, конъюгат может содержать один полипептид, обладающий активностью интерферона-α, и другой, обладающий активностью GM-CSF. Отмечено, что обладающие цитокиновой активностью полипептиды могут быть получены с использованием любого метода. Например, обладающий цитокиновой активностью полипептид может быть сконстуирован с содержанием полигистидиновой последовательности таким образом, что для очистки полипептида может быть использована аффинная хроматография. В дополнение, для формирования конъюгата может быть использован любой метод. Например, обладающий цитокиновой активностью полипептид может быть сконстуирован с содержанием участка линкера таким образом, что связывающая молекула может связывать этот полипептид с другим полипептидом, как и с любым из описанных здесь полипептидов.

В соответствии с осуществлением конъюгат для вакцинации крыс может быть сконструирован с содержанием обладающих цитокиновой активностью полипептидов, так же как и полипептидов, имеющих N-концевую полигистидиновую последовательность с последующими СН2 доменом IgE опоссума, СН3 доменом IgE крысы, СН2 доменом IgE опоссума, СН3 доменом IgE крысы, СН4 доменом IgE опоссума и С-концевой полигистидиновой последовательностью. В этом случае, обладающие цитокиновой активностью полипептиды могут содержать N-концевую полигистидиновую последовательность таким образом, что для очистки может быть использована аффинная хроматография. В дополнение, для соединения некоторого количества полипептидов через полигистидиновые последовательности в качестве связывающей молекулы может быть использовано антиполигистидиновое антитело. Например, конъюгат может содержать полипептид интерферона-α с последующими тремя содержащими IgE домены полипепгидами, за которыми следует полипептид интерферона-β, причем каждое соединение осуществляется через антиполигистидиновое антитело. Отмечено, что смешивание полипептидов со связывающей молекулой может приводить к образованию вакцины, которая содержит вакцинные конъюгаты различных размеров и с различными комбинациями полипептидов. Например, вакцина может содержать значительное количество вакцинных конъюгатов, имеющих полипептиды с активностью интерферона-α, вместе с несколькими, имеющими как полипептиды с активностью интерферона-α, так и полипептиды с активностью интерферона-β. Также отмечено, что общая конфигурация полипептидов в вакцинном конъюгате может быть адаптирована для вакцинации млекопитающих, отличных от крыс. Например, для вакцинации человека домены IgE крысы могут быть замещены доменами IgE человека.

3. Иммуногенные полипептиды и IgE-вакцины Для успешной вакцинации IgE представляется важным получить сильный иммунный ответ, который преимущественно реагирует с нативными молекулами IgE (например, поверхностными эпитопами IgE). Это требуется для достижения эффективной конкуренции с IgE-рецептором за свободный IgE, так как взаимодействие между IgE антителом и его специфическим IgE-рецептором является очень сильным (2.6•10-10; Froese A, CRC Crit. Rev. Immunol. 1:79-132 (1980)). Как здесь описано, введение иммуногенного полипептида линиям крыс вызвало образование высокого уровня антител, имеющих специфичность к "своим" IgE антителам. Использовали несколько различных линий крыс, включая низких, средних и высоких IgE-респондеров.

Как описано выше, иммуногенный полипептид является полипептидом, который эффективно вызывает иммунный ответ у млекопитающих. Например, иммуногенный полипептид может являться полипептидом, который эффективно вызывает ответ на "чужие" IgE у млекопитающего. Обычно иммуногенные полипептиды содержат по крайней мере одну аминокислотную последовательность (например, отдельную аминокислотную замену), которая может считаться чужеродной у указанного млекопитающего. Например, иммуногенные полипептиды, которые индуцируют ответы на "чужие" IgE, могут содержать две компоненты: часть "своих" IgE и часть "чужих" IgE. Часть "своих" IgE может отвечать за наделение ответа на "чужие" IgE специфичностью и часть "чужих" IgE может служить промотером и стабилизатором иммуногенного полипептида таким образом, что индуцируется специфический ответ на "чужие" IgE. Обычно часть "своих" IgE иммуногенного полипептида является частью IgE антитела, которая или прямо взаимодействует с IgE-рецептором, или опосредованно влияет на взаимодействие IgE антитела с IgE-рецептором.

Кратко, участок связывания IgE человека с высокоаффинным IgE-рецептором на стволовых клетках и базофилах расположен не в месте слияния СН2 и СН3 доменов IgE, как предполагалось раньше, а расположен в N-концевом участке СН3 домена. Исходя из укладки, этот участок расположен в месте слияния СН3 и СН4 доменов нативного полипептида. Поэтому использование целого СН2-СН3 домена в качестве части "своих" IgE потенциально может индуцировать ответ на "чужие" IgE, а при взаимодействии антител с уже связанными с поверхностью стволовых клеток "своими" IgE антителами возникают анафилактические реакции. Для уменьшения риска возникновения анафилактической реакции часть "своих" IgE иммуногенного полипептида может быть полным СН3 доменом вместо СН2 домена. Альтернативно, часть "своих" IgE может быть N-концевым участком СН3 домена. Например, при вакцинировании крысы часть "своих" IgE может быть N-концевой половиной СН3 домена крысы на фоне того, что часть "чужих" IgE содержит полный СН2 домен IgE опоссума, С-концевую половину СН3 домена IgE опоссума и полный СН4 домен IgE опоссума. Такой иммуногенный полипептид может быть обозначен как ORO-trunc (фиг.2).

Обычно часть "чужих" IgE иммуногенного полипептида стабилизирует функциональное строение части "своих" IgE. Например, в том случае, если часть "своих" IgE является СН3 доменом, то часть "чужих" IgE должна быть СН2 доменом, СН4 доменом или СН2 и СН4 доменом со "своим" СН3 доменом, расположенным между СН2 и СН4 доменами. Более конкретно, при вакцинации крысы часть "своих" IgE может быть СН3 доменом крысы на фоне части "чужих" IgE от, например, опоссума. В этом случае СН3 домен крысы может располагаться между СН2 и СН4 доменами опоссума. Такой иммуногенный полипептид может быть обозначен как ORO (фиг.2). Подобно, при вакцинации мыши часть "своих" IgE может быть СН3 доменом мыши на фоне части "чужих" IgE от, например, опоссума. Такой иммуногенный полипептид может быть обозначен как ОМО (фиг.2).

Иммуногенные полипептиды изобретения могут быть получены с использованием эукариотических систем экспрессии, таких как клеточная система экспрессии млекопитающих. В этих случаях иммуногенный полипептид является растворимым, тщательно уложенным и тщательно модифицирован таким образом, что в ответ на его введение млекопитающим вызывается ответ на "чужие" IgE. Например, иммуногенные полипептиды, имеющие одну (или более) эукариотическую посттрансляционную модификацию, могут вызывать ответ на "чужие" IgE, который является значительно выше, чем у сходных полипептидов с отсутствием эукариотической посттрансляционной модификации (например, произведенный бактериями полипептид). Эукариотические посттрансляционные модификации включают, без ограничения, гликозилирование, ацилирование, ограниченный протеолиз, фосфорилирование и изопренилирование. Затем растворимые, тщательно уложенные и тщательно модифицированные иммуногенные полипептиды могут индуцировать ответ на "чужие" IgE у млекопитающих с высокими концентрациями IgE в плазме крови, так называемых сильных IgE-респондеров. Произведенные бактериями полипептиды, тем не менее, неспособны вызывать такой сильный ответ на "чужие" IgE у сильных IgE-респондеров. Поэтому иммуногенные полипептиды, имеющие высокую растворимость, тщательно уложенные и тщательно модифицированные, могут быть получены и использованы, как описано здесь, для индукции ответов на "чужие" IgE у млекопитающих. Более того, описанные здесь иммуногенные полипептиды могут быть использованы для лечения млекопитающих, включая людей, имеющих высокие концентрации IgE в сыворотке крови. Отмечено, что высокий процент пациентов с тяжелыми формами аллергии в популяции людей принадлежит к этой категории пациентов.

СН3 домен IgE (или часть СН3 домена IgE), полученный от вакцинируемого организма, такого как человек, может быть внедрен в структурную связь отдаленно родственной молекулы IgE, такой как молекула IgE неплацентарного млекопитающего (например, опоссума, утконоса, коалы, кенгуру, валлаби и вомбата). IgE антитела сумчатого серого короткохвостого опоссума показывают около 25-процентную идентичность последовательности с IgE антителами человека, крысы, свиньи и собаки. Поэтому участки IgE антитела опоссума могут быть использованы в качестве части "чужих" IgE иммуногенного полипептида таким образом, что у человека, крысы, свиньи и собаки индуцируется мощный ответ на "чужие" IgE.

Молекула нуклеиновой кислоты для экспрессии иммуногенного полипептида может быть получена путем сплайсинга первой нуклеиновой кислоты, которая кодирует часть IgE антитела вакцинируемого организма, во вторую нуклеиновую кислоту, которая кодирует часть IgE антитела млекопитающего, отдаленно родственного с вакцинируемым организмом. Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуногенный полипептид, содержащий СН3 домен IgE крысы, человека, свиньи или собаки, может быть превращена путем сплайсинга в нуклеиновую кислоту, содержащую СН2 и СН4 домены IgE опоссума. Такие химерные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы с использованием традиционных методов молекулярного клонирования. В общем, конструирование нуклеиновых кислот таким образом, что СН3 домен антитела IgE из одного организма размещен между СН2 и СН4 доменами антитела IgE другого организма, приводит к образованию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей химерную молекулу IgE, которая имеет в структурной связи СН3 домен и очень сходна со своим нативным положением внутри нативных антител IgE.

При вакцинации крысы, человека, свиньи или собаки СН2 и СН4 домены опоссума могут служить в качестве части "чужих" IgE иммуногенного полипептида, если между СН2 и СН4 доменами опоссума и соответствующими доменами IgE крысы, человека, собаки и свиньи существует около 30 процентов аминокислотной идентичности (фиг.1). Такие иммуногенные полипептиды могут производиться млекопитающим-реципиентом. В дополнение, получающиеся иммуногенные полипептиды могут секретироваться продуцирующими клетками млекопитающих в тщательно уложенной и тщательно гликозилированной форме. Например, анализ с использованием моноклональных антител, действующих против СН3 домена IgE человека в системе Biacore, показали, что эти моноклональные антитела могут крепко связываться с иммуногенными полипептидами изобретения, показывая, что полный СН3 может быть тщательно уложен.

Важно отметить, что описанные здесь иммуногенные полипептиды могут быть такими, что вредные побочные эффекты не проявляются даже у млекопитающих, имеющих предшествующие вакцинации сильно повышенные титры IgE. В дополнение, вакцинация иммуногенными полипептидами, как здесь описано, может индуцировать ответ на "чужие" IgE, направленный против целого свободного пула IgE. Такой ответ не ограничивается специфическим аллергеном. Поэтому эти методы и материалы могут быть использованы для лечения аллергий человека, имеющих большое разнообразие различных атопических аллергий.

4. Дополнительные компоненты и способы введения Описанные здесь вакцины, вакцинные конъюгаты и иммуногенные полипептиды могут вводиться по отдельности или в комбинации с другими компонентами. Например, вакцинный конъюгат может содержать блокирующую молекулу, которая ингибирует взаимодействие между антителом (например, антителом IgG) и Fc-гамма рецептором II (например, CD32). Такие блокирующие молекулы (т.е. блокирующие молекулы Fc-гамма рецептора II) могут включать, без ограничения, анти-CD32 антитела. Анти-СD32 антитела могут быть получены с использованием традиционных методов получения и скрининга антител. Отмечено, что блокирующие молекулы Fc-гамма рецептора II могут быть использованы в комбинации с любым иммуногенным полипептидом таким образом, что иммунный ответ на иммуногенный полипептид усиливается. Например, смесь, содержащая анти-СD32 антитело и конъюгированный или нет иммуногенный полипептид, может вводиться млекопитающим с индукцией мощного иммунного ответа на иммуногенный полипептид.

Для вакцинирования млекопитающих эффективное количество описанных здесь вакцины, вакцинного конъюгата или иммуногенного полипептида может быть введено реципиенту. Эффективное количество применительно к любому количеству, которое индуцирует желаемый иммунный ответ, при этом не являясь в значительной мере токсичным для реципиента. Такое количество может быть определено путем исследования иммунного ответа реципиента после введения фиксированного количества определенного вещества (например, иммунизирующего полипептида). В дополнение, уровень токсичности, если таковой имеется, может быть определен путем исследования клинических симптомов реципиента до и после введения фиксированного количества определенного вещества. Отмечено, что эффективное количество определенного вещества, введенного реципиенту, может быть установлено исходя из желаемых результатов так же, как и из ответа реципиента и уровня токсичности. Значимая токсичность может варьировать для каждого отдельного реципиента и зависит от множества факторов, включая, без ограничений, состояние болезни реципиента, возраст и толерантность к боли.

В дополнение, любые из описанных здесь материалов могут вводиться в любую часть тела реципиента, включая, без ограничений, суставы, кровоток, легкие, кишечник, ткани, кожу и брюшную полость. Поэтому вакцинный конъюгат может вводиться путем внутривенных, внутрибрюшинных, внутримышечных, подкожных, внутриоболочечных и внутрикожных инъекций, перорально, путем ингаляций или путем перфузии по градиенту во времени. Например, аэрозольный препарат, содержащий иммуногенный полипептид, может даваться реципиенту путем ингаляций. Отмечено, что продолжительность вакцинации любыми из описанных здесь материалов может быть любой по продолжительности во времени - от короткого, как один день, до длительного, как время жизни (например, многие годы). Например, иммуногенный полипептид может вводиться один раз в год на протяжении нескольких лет. Также отмечено, что частота лечения может варьировать. Например, имммуногенный полипептид может может вводиться один раз (или дважды, трижды и т.д.) в сутки, в неделю, в месяц или в год.

Препараты для введения могут содержать стерильные водные и неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных растворителей включают, без ограничения, пропиленгликоль, пропиэтиленгликоль, растительные масла и пригодные для инъекции органические эфиры. Водные носители включают, без ограничения, воду, так же как и спиртовые, солевые и буферные растворы. Консерванты, отдушки и другие добавки, такие как, например, антимикробные вещества, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и тому подобное, также могут присутствовать. Было бы предпочтительно, если бы любые из описанных здесь вводимых млекопитающим материалов могли содержать один или несколько общеизвестных фармацевтически приемлемых носителей.

Любой метод может быть использован для определения того, специфичен ли вызываемый иммунный ответ. Например, ответы антител на специфические антигены могут определяться с использованием иммунологических методов (например, ELISA). В дополнение, клинические методы, которые могут оценить степень специфического состояния болезни, могут использоваться для определения того, желаем ли вызываемый иммунный ответ.

Изобретение будет в дальнейшем описано на следующих примерах, которые не ограничены рамками изобретения, описанными в формуле изобретения.

Примеры
Пример 1 - Иммуногенные полипептиды
Молекулы нуклеиновых кислот конструировали для кодирования иммуногенных полипептидов, содержащих части и "своих", и "чужих" IgE. Эти молекулы нуклеиновых кислот затем использовали для синтеза растворимых иммуногенных полипептидов в клетках млекопитающих. При введении млекопитающему такие иммуногенные полипептиды эффективно индуцировали поликлональный ответ на "чужие" IgE. В дополнение, предполагается, что иммуногенные полипептиды уложены и гликозилированы таким образом, что делают возможным иммуногенным полипептидам продуцировать мощный и специфичный ответ на "чужие" IgE, который был более мощным, чем на продуцированные бактериями полипептиды с отсутствующей частью "чужих" IgE. Поэтому описанные здесь иммуногенные полипептиды содержат большинство поверхностных эпитопов в той же конформации, что и нативный плазматический IgE. Более того, содержащие часть "своих" IgE иммуногенные полипептиды, ограниченные или целым СН3 доменом, или фрагментом СН3 домена (например, N-концевым участком СН3), уменьшали потенциал продукции анафилактических антител у млекопитающего.

Пример 2 - Продукция и очистка иммуногенного полипептида
PCR фрагмент А-330 пар оснований, кодирующий СН3 домен IgE крысы (Hellman L. et al. , Nucleic Acids Res. 10:6041-6049 (1982)) соединяли со сходными по размеру фрагментами, кодирующими СН2 и СН4 домены IgE опоссума (Aveskogh M. and Hellman L., Eur. J. Immunol., 28:2738-2750 (1998)) путем сшивания в модифицированную версию вектора экспрессии рСЕР4, pCEP-Pu2 (Margolskee RF et al. , Mol. Cell Biol. 8:2837-2847 (1988)). Этот вектор содержит промотер-энхансер CMV, располагающийся прямо 5' интересующего участка кодирования и делает возможной экспрессию в клетках млекопитающих. Этот вектор также содержит участки кодирования устойчивости к пуромицину и EBV EBNA1 ген. EBNA1 ген обеспечивает поддержку стабильным репликативным эписомальным копиям вектора в клеточных линиях собаки и человека.

Молекула нуклеиновой кислоты, содержащей последовательности нуклеиновой кислоты СН2 IgE опоссума, СН3 IgE крысы и СН4 IgE опоссума, также содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует сигнальную последовательность и шесть гистидиновых остатков в N-концевом участке. Участок, содержащий сигнальную последовательность и шесть гистидиновых остатков, облегчает секрецию кодированного полипептида клетками-производителями и делает возможной очистку полипептида с помощью хелатирующих Ni++ колонок. После трансфекции вектора экспрессии в клетки 293 человека иммуногенный полипептид СН2 IgE опоссума /СН3 IgE крысы/, СН4 IgE опоссума (ORO) очищали из кондиционированной клеточной среды 293 на хелатирующей никель колонке до приблизительно 100-процентной чистоты. После элюции иммуногенного полипептида ORO раствором, содержащим 20 мМ Трис-буфера (рН 8,0), 0,1 М NaCl и 100 мМ имидазола, элюат подвергали диализу против PBS (рН 75) в течение ночи при 4^oС. Иммуногенный полипептид ORO затем сконцентрировали до 2 мг/мл с использованием центрифуги Amicon. Аликвоту этого препарата, содержащего иммуногенный полипептид ORO, сепарировали на SDS-PAGE с получением приблизительно 100-процентной чистоты. Этот очищенный препарат иммуногенного полипептида ORO использовали в качестве активного компонента вакцины от "чужих" IgE для воздействия на крыс.

Пример 3 - Процедура сенсибилизации
Каждую крысу сенсибилизировали к овальбумину следующим образом. Десять (10) μг овальбумина в PBS вводили каждой крысе внутрибрюшинно. Через три недели после этой инициирующей внутрибрюшинной инъекции овальбумина крысы еженедельно получали внутрибрюшинные инъекции 1 μг овальбумина в течение четырех недель. В течение этих четырех недель крысы становились сенсибилизированными к овальбумину, получая общий IgE и овальбумин-специфический IgE ответ, который был сильным и устойчивым. После этих четырех недель начинали программу вакцинации крыс. Во время полной программы вакцинации внутрибрюшинные инъекции овальбумина продолжали проводить следующим образом. Во время первых двух недель вакцинации крысы получали внутрибрюшинные инъекции 1 μг овальбумина еженедельно. После первых двух недель вакцинации крысы получали внутрибрюшинные инъекции 1 μг овальбумина каждую следующую неделю.

Пример 4 - Измерение ответа на "чужие" IgE с помощью метода ELISA
Тридцать шесть крыс (двенадцать крыс линии Lewis, двенадцать крыс линии Louvain и двенадцать крыс линии Brown Norway) делили на две равные по размеру группы, инъецировали внутрибрюшинно или иммуногенным полипептидом ORO или BSA в качестве отрицательного контроля. В отрицательном контроле BSA использовали в той же концентрации полипептида, что и иммуногенный полипептид ORO. В этом исследовании каждая крыса получала в виде внутрибрюшинных инъекций около 250 μг антигена (или иммуногенного полипептида ORO или BSA), диспергированного в 0,2 мл раствора полного адъюванта Фрейнда и PBS в соотношении 50: 50. Через три недели крысам делали инъекцию повторной иммунизации, содержащую около 100 μг антигена, диспергированного в 0,1 мл раствора полного адъюванта Фрейнда и PBS в соотношении 50:50. Через шесть недель крысам делали дополнительную инъекцию повторной иммунизации, идентичную первой инъекции повторной иммунизации. Через неделю после этой третьей иммунизации забирали образцы крови и измеряли их с помощью метода ELISA следующим образом.

Уровень IgG anti-IgE антител, выработанных на "свои" IgE крысы, измеряли с помощью метода ELISA. Нативные IgE крысы использовали в концентрации 5 μг/мл для покрытия ELISA-чашек. Последовательные пятикратные разведения сыворотки крови от каждой крысы в отдельности тестировали с помощью цветной реакции с помощью метода ELISA. Присутствие IgG антител крысы, имеющих специфичность к IgE антителам крысы, определяли с использованием двух биотинилированных моноклональных антител мыши - одно со специфичностью к IgG2a/b крысы и одно к IgG1 крысы. Связанный со щелочной фосфатазой стрепавидин использовали для обнаружения этих биотинилированных моноклональных антител мыши.

Пример 5 - Индукция ответа на "чужие" IgE у млекопитающего
Эффект иммуногенного полипептида ORO в качестве IgE-вакцины in vivo исследовали с использованием трех различных линий крыс (Lewis, Louvain и Brown Norway). Крысы линии Lewis являются слабыми IgE-респондерами, крысы линии Louvain являются средними IgE-респондерами и крысы линии Brown Norway являются сильными IgE-респондерами. После сенсибилизирования к овальбумину каждую крысу вакцинировали или иммуногенным полипептидом ORO, или BSA, как описано в примере 3. После отбора проб крови сыворотки крови разводили пятикратно, как показано (фиг.3). Очищенный моноклональный IgE крысы (IR 162) использовали для покрытия ELISA чашек (5 μг/мл) и IgG anti-IgE антитела крысы определяли с использованием двух биотинилированных моноклональных антител мыши. После второй инъекции повторной иммунизации высокие анти-IgE титры определяли у являющихся слабыми, средними и сильными IgE-респондерами крыс, которые получали вакцину, содержащую иммуногенный полипептид ORO. Анти-IgE титры не обнаруживали у крыс, на которых воздействовали контрольным BSA. Поэтому иммуногенный полипептид ORO был способен индуцировать ответ на "чужие" IgE у крыс с низкими, средними и высокими количествами антител IgE.

Между различными линиями наблюдалось различие в уровнях ответа на "чужие" IgE. Линия слабых респондеров, линия Lewis, показывала очень высокие титры "чужого" IgE. Измерения с помощью метода ELISA показали, что значительного уменьшения значений OD можно было достичь разбавлением сывороток крови более чем в 3000 раз (фиг.3). В линии сильных респондеров, линии Brown Norway, тем не менее, значения OD у трех из шести животных начинали падать при разбавлении в 25 раз или больше (фиг.3).

В другом эксперименте использовали крыс линии Wistar. Крысы линии Wistar являются средними IgE-респондерами. Ответ на "чужие" IgE у крыс линии Wistar был сходным с ответом, наблюдавшимся у крыс линии Lewis.

Пример 6 - Анализ перекрестной реактивности
Оценивалась перекрестная реактивность между антителами крысы, вырабатываемыми против СН2 или СН4 домена IgE опоссума с соответствующими доменами IgE антител крысы. Эта перекрестная реактивность могла являться результатом низкой гомологичности первичной аминокислотной последовательности или близким структурным сходством между СН2 и СН4 доменами IgE опоссума и IgE крысы. Индукция anti-rat IgE ответа, обладающего специфичностью к СН2 или СН4 доменам крысы, может приводить к активации стволовых клеток.

Линии Wistar делали инъекцию содержащего СН2-СН3-СН4 домены опоссума рекомбинантного полипептида (ООО). После второй инъекции повторной иммунизации сыворотки крови от этих крыс собирали и тестировали на наличие антител, имеющих специфичность к IgE крысы. У крыс, на которых воздействовали полипептидом ООО anti-rat IgE антитела не обнаруживали (фиг.4). В дополнение, крысы линии Wistar, на которых воздействовали иммуногенным полипептидом ООО, давали ответ на "чужие" IgE, сходный с наблюдаемым у крыс линии Lewis. Затем крысы линии Wistar, на которых воздействовали содержащим СН2-СН3-СН4 домены утконоса рекомбинантным полипептидом (РРР), не давали anti-rat IgE ответа. Поэтому при введении крысам СН2, СН3 и СН4 доменов IgE антител опоссума и утконоса не вызывают образования антител крыс, имеющих специфичность к IgE антителам крысы.

Изучали взаимодействие между антителами крыс, индуцированными иммуногенным полипептидом ORO (IgG "чужих" IgE антител крысы) и IgE антител человека. В некоторых случаях наблюдалась небольшая перекрестная реактивность. Эта небольшая перекрестная реактивность, обнаруженная у некоторых крыс, скорее всего была обусловлена взаимодействием между IgG anti-rat СН3 IgE антител крысы и СН3 доменом IgE человека. В связи с тем, что СН3 домены IgE крысы и человека являются гораздо более близкородственными, чем IgE человека и опоссума или утконоса, считается, что содержащие компоненты опоссума или утконоса вакцины могут быть высокобезопасными, дающими минимальный риск образования перекрестно-реагирующих антител.

Пример 7 - Полипептиды для вакцинных конъюгатов
Для получения двух полипептидов, каждый из которых обладает несколькими идентичными "своими" эпитопами, использовали конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую описанный в примере 2 иммуногенный полипептид ORO. Один полипептид содержал два идентичных кластера "своих" эпитопов (полный СН3 домен крысы), в то время как другой полипептид содержал четыре таких кластера. Во-первых, путем включения нуклеотидной последовательности для шести гистидиновых остатков в 3' PCR праймер к С-концевому участку СН4 домена опоссума добавляли нуклеиновую кислоту, кодирующую шесть гистидиновых остатков. Поэтому каждый содержащий полигистидиновую последовательность в N-концевом и С-концевом участках полипептид может образовывать конъюгаты. Во-вторых, фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий СН2 домен опоссума и СН3 домен крысы, оригинальной конструкции был получен путем PCR-амплификации. Этот фрагмент был впоследствии связан в конструкцию, кодирующую иммуногенный полипептид ORO. Получающаяся конструкция кодирует полипептид, обозначенный ORORO. Этот полипептид ORORO содержит два СН3 домена крысы, два СН2 домена опоссума и один СН4 домен опоссума в следующем порядке: СН2 опоссума, СН3 крысы, СН2 опоссума, СН3 крысы и СН4 опоссума. Поэтому этот полипептид имеет два идентичных СН3 домена, каждый с множественными "своими" эпитопами.

Конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую ORORO, использовали в качестве начального материала для получения второго иммуногенного полипептида. Этот полипептид содержал два дополнительных СН3 домена крысы, которые добавляли в позицию 3' первого СН3 домена крысы первого полипептида ORORO. Получающийся полипептид имеет полигистидиновую метку, за которой следуют СН2 домен опоссума, три идентичных СН3 домена крысы, один СН2 домен опоссума, один СН3 домен крысы, СН4 домен опоссума, С-концевая полигистидиновая метка (6his-ORRRORO-6his).

Каждый рекомбинантный полипептид получали в рСЕР4 векторной системе. В дополнение, полипептиды очищали с использованием хелатирующих Ni++ колонок исходя из описанного в примере 2 метода. Сходные вакцинные конструкции получали с использованием СН3 домена IgE собаки или человека вместо СН3 домена IgE крысы.

Пример 8 - Вакцинные конъюгаты
Для определения наилучшей комбинации полипептида с моноклональным антителом очищенные полипептиды примера 7 смешивали с моноклональным антиполигистидиновым антителом в различных комбинациях с колеблющимся отношением от 1/1 до 10/1 (отношение полипептида к моноклональному антителу). Эта смесь приводила к образованию длинных многомерных конъюгатов с большим количеством идентичных "своих" эпитопов друг за другом. Биологическую активность различных комбинаций исследовали на крысах, как описано здесь. Для изучения иммунных ответов неконъюгированный иммуногенный полипептид ORO использовали в качестве эталона.

Пример 9 - Обладающие цитокиновой активностью полипептиды
PCR-праймеры сконструированы таким образом, что молекулы кДНК, кодирующие цитокины крысы, собаки и человека (например, интерферон-α, интерферон-β и GM-CSF), могут быть изолированы из общей мРНК селезенки. Кодирующую шесть гистидиновых остатков нуклеотидную последовательность помещали в каждые 5' PCR-праймера таким образом, что цитокины могли быть очищены с помощью аффинной хроматографии и могли быть нековалентно конъюгированы с описанными здесь полипептидами через антиполигистидиновое антитело. Рекомбинантные цитокины получали с использованием одной из трех следующих систем экспрессии: бактерий, дрожжей (например, Pichia pastoris) и клеток млекопитающих (например, 293-EBNA клетки, использующие рСЕР-4 систему экспрессии).

Пример 10 - Вакцинные конъюгаты, имеющие полипептид с цитокиновой активностью
Образующиеся в соответствии с примером 9 цитокины использовали для получения вакцинных конъюгатов. Смесь трех различных цитокинов (например, интерферон-α мыши, интерферон-γ крысы и GM-CSF крысы) получали и испытывали в комбинации с полипептидом ORORO и антиполигистидиновым антителом.

Сначала тестировали смесь в соотношении 1/10 (соотношение цитокина к иммуногенному полипептиду). В случае с тремя цитокинами это соотношение приводило к смеси, содержащей в мольном отношении 30% цитокина и 70% иммуногенного полипептида. В дополнение, эта смесь содержала антиполигистидиновое антитело в соотношении 1/10 (соотношение иммуногенного полипептида и моноклонального антитела). Оценивали большое число комбинаций соотношений таким образом, что определили оптимальное соотношение цитокина к иммуногенному полипептиду так же, как и оптимальное соотношение моноклонального антитела к иммуногенному полипептиду. В дополнение, исследовали полипептиды, обладающие цитокиновой активностью различных частиц для определения оптимальной комбинации для указанных частиц.

Другие осуществления
Необходимо понимать, хотя изобретение было описано вместе с его детальным описанием, предстоящее описание служит исключительно для иллюстративных целей, которые не ограничены рамками изобретения, описанными в приложенной формуле изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в приложенной формуле изобретения.

Формула изобретения

1. Иммуногенный полипептид, содержащий "свою" часть IgE и "чужую" часть IgE, причем указанная "чужая" часть IgE содержит первый участок и второй участок, причем указанная "своя" часть IgE располагается между указанными первым и вторым участками указанной "чужой" части IgE, и указанный иммуногенный полипептид способен индуцировать ответ на "свой" IgE у млекопитающего.

2. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанное млекопитающее является человеком.

3. Иммуногенный полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанная "своя" часть содержит по крайней мере часть СНЗ домена IgE.

4. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид способен димеризоваться с образованием растворимого иммуногенного димера, способного индуцировать указанный ответ на "свой" IgE у указанного млекопитающего.

5. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный первый участок содержит по крайней мере часть СН2 домена IgE.

6. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный второй участок содержит по крайней мере часть СН4 домена IgE.

7. Иммуногенный полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанная "чужая" часть IgE содержит последовательность IgE, присутствующую у неплацентарного млекопитающего.

8. Иммуногенный полипептид по п.7, отличающийся тем, что указанное неплацентарное млекопитающее выбрано из группы, состоящей из опоссума, утконоса, коалы, кенгуру, малого кенгуру и вомбата.

9. Иммуногенный полипептид по п.3, отличающийся тем, что в указанной "своей" части IgE отсутствует СН2 домен IgE антитела.

10. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный иммуногенный полипептид содержит эукариотическую посттрансляционную модификацию.

11. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный иммуногенный полипептид содержит полигистидиновую последовательность.

12. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный ответ на "свой" IgE является поликлональным ответом.

13. Иммуногенный полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанная "своя" часть IgE в основном состоит из СН2 домена IgE и СН4 домен IgE.

14. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что в указанном иммуногенном полипептиде отсутствует СН1 домен IgE.

15. Иммуногенный полипептид по п. 1, отличающийся тем, что указанная "чужая" часть IgE в основном состоит из N-концевой части СНЗ домена IgE.

16. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид не связан с легкой цепью иммуноглобулина.

17. Иммуногенный полипептид по любому из пп.1-16, используемый для производства лекарственного средства для лечения аллергий.

18. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуногенный полипептид, причем указанный иммуногенный полипептид содержит "свою" часть IgE и "чужую" часть IgE, причем указанный иммуногенный полипептид способен индуцировать ответ на "свой" IgE у млекопитающего.

19. Молекула нуклеиновой кислоты по п.18, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит дополнительную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая способствует секреции указанного иммуногенного полипептида эукариотическими клетками.

20. Молекула нуклеиновой кислоты по п.18, используемая для встраивания в клетку-хозяин.

21. Молекула нуклеиновой кислоты по п.19, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.

22. Растворимый иммуногенный димер, содержащий два иммуногенных полипептида, которые способны к димеризации с образованием указанного растворимого иммуногенного димера, причем каждый из двух указанных иммуногенных полипептидов содержит "свою" часть IgE и "чужую" часть IgE, причем указанный растворимый иммуногенный димер способен индуцировать ответ на "свой" IgE у млекопитающего.

23. Вакцина, включающая иммуногенный полипептид, причем указанный иммуногенный полипептид содержит "свою" часть IgE и "чужую" часть IgE, причем указанный иммуногенный полипептид способен индуцировать ответ на "свой" IgE у млекопитающего.

24. Вакцина по п.23, отличающаяся тем, что указанная вакцина дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

25. Способ получения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуногенный полипептид, способный индуцировать ответ на "свой" IgE у млекопитающего, включающий комбинирование первой и второй последовательности нуклеиновой кислоты с образованием указанной молекулы нуклеиновой кислоты, причем указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, которая присутствует у указанного млекопитающего, и указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, которая не присутствует у указанного млекопитающего.

26. Способ получения молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуногенный полипептид, способный индуцировать ответ на "свой" IgE у млекопитающего, включающий следующие стадии: a) отбор первой последовательности нуклеиновой кислоты, причем указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, которая присутствует у указанного млекопитающего, b) отбор второй последовательности нуклеиновой кислоты, причем указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по крайней мере часть молекулы IgE, которая не присутствует у указанного млекопитающего, c) комбинирование указанных первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты с образованием указанной молекулы нуклеиновой кислоты.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7