Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки человека (варианты), бессывороточная культуральная среда, способ иммортализации, способ идентификации мутагенного, токсичного или благоприятного действия агента, диагностический набор

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения линии иммортализованных клеток эпителия толстой кишки человека. Линия клеток не экспрессирует опухолевые маркеры и экспрессирует метаболические маркеры, специфичные для неиммортализованных клеток эпителия человека, и маркеры метаболической дифференциации, специфичные для неиммортализованных эпителиальных клеток толстой кишки человека. Способна прикреплять in vitro штамм CNCM-1225 молочнокислой бактерии. Бессывороточная культуральная среда включает микроэлементы, витамины, состоящие из витамина С и ретиноевой кислоты, и гормоны, состоящие из трииодтиронина, дексаметазона, гидрокортизона, экстракта бычьего гипофиза, инсулина, эпидермальный фактор роста (ЭФР) и трансферрин. Иммортализацию эпителиальных клеток толстой кишки человека осуществляют путем получения культуры первичных эпителиальных клеток, выделенных из толстой кишки человека, и инфицирования рекомбинантным вирусом. Изобретение позволяет идентифицировать мутагенный, токсический или благоприятный эффект агента на метаболизм клеток кишечного тракта. 10 с. и 6 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 ил.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Формула изобретения

1. Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки человека DSM ACC2258, инфицированная рекомбинантным вирусом SV-40, содержащим Т-антиген, предназначенная для изучения заболеваний толстой кишки человека.

2. Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки С, инфицированная рекомбинантным вирусом SV-40, содержащим Т-антиген, предназначенная для изучения заболеваний толстой кишки человека.

3. Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки Q, инфицированная рекомбинантным вирусом SV-40, содержащим Т-антиген, предназначенная для изучения заболеваний толстой кишки человека.

4. Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки D, инфицированная рекомбинантным вирусом SV-40, содержащим Т-антиген, предназначенная для изучения заболеваний толстой кишки человека.

5. Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки Н, инфицированная рекомбинантным вирусом SV-40, содержащим Т-антиген, предназначенная для изучения заболеваний толстой кишки человека.

6. Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки Р, инфицированная рекомбинантным вирусом SV-40, содержащим Т-антиген, предназначенная для изучения заболеваний толстой кишки человека.

7. Бессывороточная культуральная среда, приспособленная для культивирования и иммортализации эпителиальных клеток толстой кишки человека, содержащая неорганические соли, глюкозу, пируват натрия, аминокислоты, бычий сывороточный альбумин (БСА), этаноламин, фосфорилэтаноламин, витамины и гормоны, отличающаяся тем, что среда дополнительно включает 1-100 нМ микроэлементов, 10-1000 нМ ретиноевой кислоты, 10-1000 нМ трииодтиронина, 0,1-50 нМ дексаметазона, 1-100 нМ гидрокортизона, 1-100 мкг/мл витамина С, 1-100 мкг/мл экстракта бычьего гипофиза, 0,1-50 мкг/мл инсулина, 0,1-50 нг/мл ЭФР и 0,1-100 мкг/мл трансферрина.

8. Культуральная среда по п.7, отличающаяся тем, что неорганические соли выбраны из группы, образованной хлоратом натрия, хлоратом калия, сульфатом калия, хлоратом кальция, двухосновным фосфатом натрия, бикарбонатом натрия, нитритом трехвалентного железа, метеванадата аммония, молибдата аммония, сульфата меди, хлората магния, хлората марганца, сульфата никеля, ацетата натрия, пирувата натрия, селенита натрия, силиката натрия, хлората олова и сульфата цинка.

9. Культуральная среда по п.7, которая дополнительно содержит витамины, выбранные из группы, образованной кальций D-пантотенатом, холин хлоратом, фолиевой кислотой, инозитолом, никотинамидом, пиридоксином, рибофлавином, тиамином, биотином и цианкобаламином.

10. Культуральная среда по п.7, отличающаяся тем, что среда включает менее 80 мкМ кальция.

11. Культуральная среда по п.7, отличающаяся тем, что она имеет состав В50, включающий:

NaCl 6,400 г/л

КСl 0,400 г/л

МgSO₄·7Н₂О 0,200 г/л

СаСl₂ 0,200 г/л

NaH₂РО₄·Н₂О 0,13 г/л

NaНСО₃ 3,7 г/л

Fe(NO₃)₂·9Н₂О 0,0001 г/л

Глюкоза 4,50 г/л

НЕPES 20 мМ

Фенол красный 0,010 г/л

Пируват натрия 0,110 г/л

БСА 0,3%

РЕ (фосфорилэтаноламин и этаноламин) 0,5 мкМ

L-Аргинин-HCl 0,0840 г/л

L-Цистин 0,0480 г/л

L-Глютамин 2 мМ

Глицин 0,0300 г/л

L-Гистидин-НСl-Н₂О 0,0420 г/л

L-Изолейцин 0,1048 г/л

L-Лейцин 0,1048 г/л

L-Лизин-НСl 0,1462 г/л

L-Метионин 0,0300 г/л

L-Фенилаланин 0,0660 г/л

L-Серин 0,0420 г/л

L-Треонин 0,0952 г/л

L-Триптофан 0,0160 г/л

L-Тирозин 0,0720 г/л

L-Валин 0,0936 г/л

D-Са-Пантотенат 0,004 г/л

Холин хлорид 0,004 г/л

Фолиевая кислота 0,004 г/л

Инозитол 0,008 г/л

Никотинамид 0,004 г/л

Пиридоксин-НСl 0,004 г/л

Рибофлавин 0,0004 г/л

Тиамин-НСl 0,004 г/л

Витамин С 0,030 г/л

Ретиноевая кислота 100 нМ

Микроэлементы 10 нМ

Инсулин 0,005 г/л

ЭФР 1 нг/мл

Трансферрин 0,005 г/л

ТЗ 100 нМ

Дексаметазон 1 нМ

Гидрокортизон 10 нМ

Экстракт бычьего гипофиза 0,038 г/л

Фунгизон 0,25 мкг/мл

Пенициллин 2,5 Ед/мл

Стрептомицин 5 мкг/мл

Гентамицин 10 мкг/мл

12. Способ иммортализации эпителиальных клеток толстой кишки человека, при котором получают культуру первичных эпителиальных клеток, выделенных из толстой кишки человека, культуру инфицируют рекомбинантным вирусом SV-40, содержащим Т-антиген, и иммортализованные клетки культивируют в бессывороточной культуральной среде по любому из пп.7-11.

13. Способ по п.12, в котором первичные эпителиальные клетки культивируют в бессывороточной среде по любому из пп.7-11.

14. Способ по п.12, в котором культуру инфицируют рекомбинантным вирусом SV40 T-Ag, содержащим часть ретровируса MuLV.

15. Способ идентификации мутагенного, токсического или благоприятного эффекта действия агента на метаболизм клеток кишечного тракта, включающий контактирование агента с культурой, содержащей линию клеток по любому из пп.1-6, и определение действия агента на линию клеток.

16. Диагностический набор для идентификации мутагенного, токсического или благоприятного эффекта действия агента на метаболизм клеток кишечного тракта, включающий иммортализованные эпителиальные клетки толстой кишки человека по любому из пп.1-6, культуральную среду по любому из пп.7-11 и реактивы для определения метаболической реакции указанных клеток на мутагенные, токсические или благоприятные агенты.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39