Лиофилизированная антигерпетическая вакцина

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к получению вакцины против вирусов простого герпеса 1 и 2 типов. Вакцина содержит взвесь штаммов ВПГ1 и ВПГ2, выращенных на стандартизированной линии клеток Vero B. Вакцина найдет применение в научно-исследовательских учреждениях и в клинической практике здравоохранения.

Предполагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к получению вакцины против вирусов простого герпеса 1 и 2 типов.

Хроническая герпетическая инфекция относится к наиболее распространенным в мире иммунодефицитам с пожизненной персистенцией вируса в нервных ганглиях и периодическим обострением заболевания с локализацией, как правило, "lokus minoris" на коже, на слизистой гениталиев, в глазах и т.д.

Общее количество больных хроническими формами герпетической инфекции в России более 20 млн. человек. По данным Московского противогерпетического центра, инфицированность населения Москвы и Московской области около 90%. Согласно данным ВОЗ, смертность от герпетических энцефалитов и диссеминированных форм болезни составляет 15,8%, занимая второе место после гриппа (35,8%), как причина смерти от вирусных инфекций.

В связи с изложенным, становится очевидным актуальность проблемы получения высокоэффективных препаратов против вирусов простого герпеса 1 (ВПГ1) и 2 типов (ВПГ2).

Известна антигерпетическая вакцина, включающая ВПГ1 и ВПГ2, выращенных на фибробластах куриных эмбрионов, и остаточный формалин (1).

Известна также антигерпетическая вакцина, представляющая собой лекарственную форму в виде свечей, содержащая суспензию вакцины (20 мл суспензии с 10⁸ БОЕ), 1,5-2 г L-аскорбиновой кислоты, 1-2 г гиалуроновой кислоты, 1-2 г L-токоферола, (3-5)10⁶ международных единиц L₂-интерферона. Каждая свеча массой 1,5-2 г, содержащая <500 мкг/г белка, имеет остаточную влажность <2,5% и физиологическое значение рН 7,5+0,2 (2). Ее готовят следующим образом: вирусы ВПГ1 и ВПГ2 выращивали на перевиваемой линии клеток Vero (почка зеленой мартышки), очистку и концентрирование проводили методом фильтрации через пористые мембраны, а вирусы в фильтрате инактивировали гамма-излучением (2).

В задачу наших исследований входило получить лиофилизированную антигерпетическую вакцину, обеспечивающую создание и поддержание в организме человека длительного напряженного иммунитета против вируса герпеса 1 и 2 типов, сохраняющую стабильность своих свойств на протяжении своего срока хранения и не вызывающую аллергических реакций.

Предложенная вакцина представляет собой, об.%: Взвесь штаммов ВПГ1 и ВПГ2, выращенных на стандартизированной линии клеток Vero В (почка зеленой мартышки) на 179-190 пассажах с активностью 10^8,0-10^8,5 lg ТЦД_50/мл и 40% официнальный р-р формалина до конечной концентрации 0,014% - 91,5 - 92 70-75% Р-р сахарозы - 7,0 - 7,5 10% Официнальный р-р желатозы - 1,0 Способ изготовления вакцины состоит в следующем: в среде поддержки (среда Игла без добавления сыворотки эмбриона коровы и донорского человеческого альбумина) на монослое перевиваемых линий клеток Vero В с посевной концентрацией клеток (0,5-1,0)•10⁵ клеток/мл культивируем вирусы простого герпеса ВПГ1 и ВПГ2; высвобождение вирусов из клеток проводили методом замораживания и оттаивания, а затем обрабатывали в ультразвуковом дезинтеграторе; инактивацию вирусов проводили формалином с последующей деформализацией; очистку от разрушенных клеток (детритов) проводили центрифугированием при 2000-2500 об/мин в течение 30-60 мин, затем вакцину лиофилизировали.

Конкретные примеры осуществления заключаются в следующем: Пример 1 Для приготовления 1 л вакцины брали монослойную культуру клеток Vero В с концентрацией 0,7•10 ⁵, выращивали монослойно при 37^oС в течение 48 ч до образования плотного монослоя клеток. Затем вносили вируссодержащий материал в дозе 0,03 ТЦД₅₀/мл, проводили адсорбцию вирусов в течение 30 мин и инкубировали в течение 24 ч (ВПГ1) и 48 ч (ВПГ2) до полного разрушения монослоя, после чего матрасы с содержимым подвергали однократному замораживанию при температуре минус 40-45^oС и оттаиванию при комнатной температуре с последующей обработкой в ультразвуковом дезинтеграторе до полного высвобождения вирусов из клеток с концентрацией вирусов 10^8,0 ТЦД₅₀/мл. В вируссодержащую жидкость вносили формалин (1:1800) и на магнитной мешалке выдерживали 3 дня при температуре 37^oС. Деформализацию проводили в течение 10 дней при температуре +4^oС до конечного содержания формалина 170 мкг/мл. Центрифугированием при 2000 об/мин в течение 60 мин отделяли клетки Vero В и их остатки. Полученную суспензию лиофилизировали. Предложенной вакциной иммунизировали 10 самцов белых крыс массой (110±10) г трехкратно (внутрибрюшинно, подкожно, внутрибрюшинно) по 1,0 мл вакцины; интервалы между инъекциями 3 суток. Вакцина индуцировала синтез нейтрализующих вирусы антител с индексом нейтрализации для ВПГ1- 2,7 IgTЦД₅₀/мл; для ВПГ2 - 2,5 lgТЦД₅₀/мл.

Пример 2 Для приготовления 1 л вакцины брали монослойную культуру клеток Vero В с концентрацией 0,8•10⁵ клеток/мл, а выращивание, адсорбцию вирусов, разрушение монослоя проводили аналогично примеру 1, титр вируса получили 10^8,0lgTЦД₅₀/мл. Формалин вносили в разведении 1: 1900 и деформализацию проводили до конечного содержания формалина 160 мкг/мл. Центрифугированием при 2500 об/мин в течение 30 мин отделяли клетки Vero В и их остатки.

Полученную суспензию лиофилизировали.

В опыте исследовали 10 самцов белых крыс массой (110±10) г, проиммунизированных трехкратно (внутрибрюшинно, подкожно, внутрибрюшинно) по 1,0 мл вакцины; интервалы между инъекциями 3 суток. Вакцина индуцирует синтез нейтрализующих вирусы антител с индексом нейтрализации для ВПГ1-3,0 lgTЦД, ₅₀/мл; для ВПГ 2-2,7 lgTЦД₅₀/мл.

Пример 3 Для приготовления 1 л вакцины берут монослойную культуру клеток Vero В с концентрацией 0,1•10⁵ клеток/мл, а выращивание, адсорбцию вирусов, разрушение монослоя проводили аналогично примеру 1, титр вируса получили 10^8,5 lgTЦД₅₀/мл. Формалин вносили в разведении 1:1800 и деформализацию до конечного содержания формалина 150 мкг/мл. Центрифугированием при 2000 об/мин в течение 60 мин отделяли клетки Vero В и их остатки. Полученную суспензию лиофилизировали.

В опыт брали 10 самцов белых крыс массой (110±10) г, иммунизировали трехкратно (внутрибрюшинно, подкожно, внутрибрюшинно) по 1,0 мл вакцины; интервалы между инъекциями 3 суток. Вакцина индуцировала синтез нейтрализующих вирусы антител с индексом нейтрализации для ВПГ1 1-3,0 lgTЦД₅₀/мл; для ВПГ2-3,0 lgTЦД₅₀/мл.

Предложенную вакцину "Витагерпавак" также можно использовать в виде свечей (суппозиториев). При этом в нее дополнительно вводят наполнитель - жир кондитерский в количестве 97-98%.

В предложенной вакцине благодаря:
- исключению из среды поддержки сыворотки эмбриона коровы и донорского человеческого альбумина позволило снизить содержание чужеродных белков до 100-200 мкг/мл (вызывающих аллергические реакции при введении человеку), при этом сохраняя объем вируссодержащей биомассы и активность вирусов;
- применению методов замораживания и оттаивания клеток Vero В с последующей обработкой в ультразвуковом дезинтеграторе, позволило увеличить титр вирусов до 10^8,0 - 10^8,5lgTЦД₅₀/мл;
- последующей обработке формалином вируссодержащей жидкости позволило полностью инактивировать вирус герпеса, а также способствует полной изомеризации остаточной ДНК перевиваемой линии клеток Vero В и денатурации клеточных белков, что исключает риск туморогенности данной вакцины.

Предложенная вакцина апробирована в полном объеме в рамках государственных доклинических испытаний под руководством Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Минздрава РФ в 2001-2002 гг. с положительным результатом:
- вакцина "Витагерпавак" обладает высокой иммуногенностью, обеспечивает в организме создание и поддержание длительного напряженного иммунитета;
- не токсична;
- не вызывает аллергических реакций;
- не туморогенна.

- в лиофилизированном виде сохраняет антигенность и стабильность препарата при всем сроке хранения.

Вакцина "Витагерпавак" найдет применение в научно-исследовательских учреждениях и в клинической практике здравоохранения РФ.

Просим Вас сохранить в названии вакцины термин "Витагерпавак", согласно документации на нее, утвержденной Минздравом РФ.

Источники информации.

1. Патент РФ 2014084, кл. А 61 К 39/245, 1994 г.

2. Патент РФ 2142816, кл. А 61 К 39/12, 1997 г.

Формула изобретения

Лиофилизированная антигерпетическая вакцина, содержащая взвесь штаммов вируса простого герпеса ВПГ1 и ВПГ2, полученная путем культивирования этих штаммов на стандартизированной линии клеток Vero В с последующей обработкой культуральной среды 40%-ным раствором формалина и лиофилизацией с добавлением сахарозно-желатозной защитной среды.