Хладоограждающий раствор для замораживания тромбоцитов при умеренно-низкой температуре

 

Изобретение относится к медицине, а именно к криоконсервированию клеток крови. Хладоограждающий раствор для замораживания тромбоцитов имеет следующий состав, мас.%: гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина - 10,0, фумарат натрия 1,5-2,3, лимонная кислота - 0,9-1,1, вода для инъекций - остальное. Раствор обеспечивает сохранение высокого процента физиологически полноценных тромбоцитов при криоконсервировании при умереннонизкой температуре. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к криоконсервированию клеток крови.

В качестве прототипа нами использована работа Е.П.Сведенцова и соавт. “Водный раствор для криоконсервирования тромбоцитов” при -196°С (1).

Существенными недостатками прототипа являются: 1) отсутствие в составе криозащитного раствора антигипоксанта, способствующего быстрому восстановлению энергетических процессов в клетке после ее выхода из холодового анабиоза; 2) наличие в прототипе умеренно токсичного антиагреганта - ЭДТА Na₂; 3) обязательное использование ультранизкой температуры (-196°С) при замораживании биообъекта, что сопряжено с высокой дороговизной криогенного оборудования, большой затратностью применяемого жидкого азота и необходимостью обслуживания высококвалифицированным техническим персоналом.

Для устранения вышеуказанных недостатков в известный раствор вводят компонент - фумарат натрия с целью восстановления и усиления энергетического потенциала клетки после ее оттаивания, т.к. фумаровая кислота участвует в цикле Кребса, обеспечивающего жизнедеятельность клетки, из состава же раствора исключен компонент - ЭДТА Na₂. Кроме того устранена высокозатратная жидкоазотная технология криоконсервирования, т.к. новый состав раствора позволяет применять доступный, экономичный метод замораживания тромбоцитов до -40°С по экспоненциальной программе в электроморозильниках.

Таким образом, предлагаемый хладоограждающий раствор содержит следующие ингредиенты, мас.%:

1) криопротектор - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (ее аббревиатура - ГМБТОЭМ), имеющую наименьшую токсичность из всех эффективных криофилактиков: ее ЛД₅₀ составляет 15,5±0,6 г/кг массы мыши (Сведенцов Е.П. и др. (2);

2) антигипоксант - фумарат натрия;

3) антикоагулянт - лимонную кислоту;

4) воду для инъекций.

Все ингредиенты, входящие в хладоограждающий раствор, производятся в РФ.

Пример использования средства: хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ в концентрации 10%, фумарат натрия 1,9%, лимонную кислоту 1%, воду для инъекций до 100 мл, имеющий рН 5,5-6,5, смешивают с тромбоцитным концентратом в полимерном контейнере “Компопласт”. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин; замораживают по экспоненциальной программе в электрическом морозильнике в 4-литровой ванне с этиловым спиртом, охлажденном до -28°С, выдерживая в нем 15 мин. Затем контейнер с тромбоцитами переносят в электроморозильник для замораживания до -40°С и оставляют в нем для хранения. Термограмму записывают по датчику, установленному в аналогичном контейнере “Компопласт” с данным хладоограждающим раствором. Размораживание осуществляют в 20-литровой ванне при +38°С в течение 35-45 с при покачивании контейнера 3-4 раза в секунду. Определяют морфологическую сохранность размороженных тромбоцитов (подсчет в камере Горяева), их функциональную активность (адгезию к стеклу, индуцированную агрегацию и реакцию на гипотонический шок). Расчет производится в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.

Экспериментальные исследования выполнены в лаборатории консервирования крови и тканей ГУ Кировского НИИ гематологии и переливания крови. Изучены три варианта хладоограждающих растворов для замораживания тромбоцитного концентрата, различающихся по процентному содержанию входящих в него ингредиентов. Состав растворов представлен в табл. 1.

При смешивании с тромбоцитами донорской крови в соотношении 1:1 конечная концентрация веществ (табл. 2), входящих в состав растворов 1, 2, 3, уменьшалась в 2 раза по сравнению с исходной, рН среды оставалась в пределах 5,5-6,5, оптимальной для тромбоцитов.

Замораживание происходило по двухступенчатой экспоненциальной программе: на первом этапе погружали контейнер с подготовленной смесью хладоограждающего раствора с тромбоцитным концентратом в 4-литровую спиртовую ванну, охлажденную до -28°С, через 15 мин контейнер с тромбоцитами вынимали из ванны и помещали в электроморозильник для замораживания при умеренно низкой температуре до -40°С, на это затрачивалось 8 мин. Контроль за охлаждением проводили по термограмме, записываемой по датчику, введенному в контейнер с хладоограждающим раствором с конечной концентрацией его ингредиентов.

Размораживание производили через 1-28 суток в 20-литровой водяной ванне при +38°С в течение 35-40 с.

Отогревали до +2°С. Выполняли исследования тромбоцитов на морфологическую сохранность и функциональную полноценность (табл.3); показатели даны в процентах к исходным (до замораживания).

Получены выраженные положительные результаты после замораживания и отогрева тромбоцитов с различными вариантами предложенного хладоограждающего раствора: сохранилось морфологически 76,6±0,7% - 81,7±0,4% к исходному числу клеток (до замораживания), функциональная активность по разным тестам равнялась от 60,1±0,8% до 82,4±0,8%, а реакция на гипотонический шок (РГШ) составила от 44,6±1,2% до 51,5±0,3% к исходным показателям. Надо отметить, что РГШ является наиболее важным тестом для тромбоцитов, т.к. прямо коррелирует с их состоянием после трансфузии тромбоцитного концентрата в сосудистое русло.

Разработанный нами хладоограждающий раствор прозрачен, со слабым желтоватым оттенком, без запаха, рН 5,5-6,5. Он хорошо смешивается с тромбоцитным концентратом, предотвращает агрегацию клеток, обеспечивает морфологическую и функциональную сохранность при положительной температуре и высокий процент физиологически полноценных тромбоцитов после замораживания-оттаивания. Это дает возможность применять его для консервирования замораживанием тромбоцитов при умеренно низкой температуре в лечебных учреждениях и учреждениях службы крови, которые имеют электроморозильники на -40°С и отделения длительного хранения крови.

Литература

1. Сведенцов Е.П., Селезнева О.М., Симкин Д.С., Новосадов В.М. Водный раствор для криоконсервирования тромбоцитов. Патент №1561227 (Роспатент). Регистр. 12.04.93.

2. Сведенцов Е.П., Селезнева О.М., Костяев А.А. О токсичности нового криоконсерванта для тромбоцитов. - В кн.: Вопросы трансфузиологии и клинической медицины. Киров, 1992 - С.7-8.

Формула изобретения

Хладоограждающий раствор для замораживания тромбоцитов, включающий гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину, лимонную кислоту и воду для инъекций, отличающийся тем, что раствор дополнительно содержит фумарат натрия при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина 10,0

Фумарат натрия 1,5 - 2,3

Лимонная кислота 0,9 - 1,1

Вода для инъекций Остальное

при этом раствор используют для замораживания при умеренно низкой температуре.