Способ получения препарата спирулины, содержащей хром

 

Изобретение относится к области получения препарата биомассы спирулины. Предложен оптимальный способ культивации биомассы спирулины (Spirulina platensis) в присутствии органического соединения трехвалентного хрома, при котором хром интенсивно и эндогенно включается в органические молекулы спирулины при сохранении естественного состояния и белкового состава биомассы. Суспензия готовится из пятидневной культуры спирулины, которая подвергается предварительной гомогенизации, способствующей частичному укорочению нитей спирулины и в дальнейшем - ускорению и стимуляции ее роста, а также интенсивному эндогенному включению хрома в биокомплексы клеток. Способ позволяет получить хромсодержащую биомассу спирулины с такими качественными характеристиками, пригодную для производства диетических и лечебно-профилактических препаратов. 2 ил.

Изобретение относится к способам получения биологически активных препаратов на основе биомассы микроводоросли Spirulina platensis и может быть применено в биотехнологии, микробиологии, медицине, альгологии и пищевой промышленности.

Известен способ [1] использования высоких доз трипиколината хрома (1000-10000 мкг в день) для лечения диабета второго типа - снижения уровня гипергликемии и стабилизации содержания глюкозы в крови человека. Это предложение касается способа лечения и не описывает способа получения препарата. Кроме того, учитывая богатый состав и свойства спирулины, можно ожидать, что для профилактики и лечения диабета на ранних стадиях применение препаратов на основе ее биомассы, содержащей хром в оптимальных дозах, будет эффективнее, чем применение трипиколината хрома.

Известен также способ использования ионов хрома, входящего в состав органического соединения, для обогащения биомассы микроводоросли [2], который можно рассматривать как прототип. Сущность способа заключается в выращивании спирулины на питательной среде в накопительном режиме с последующим внесением в культивируемый раствор водной дисперсии гексагидрата хлористого хрома, выращивании в течение 3-5 суток, отделением биомассы спирулины, промывкой, сушкой и измельчением до получения продукта, содержащего не менее 500 мг/кг хрома в биомассе.

Биомасса спирулины благодаря своим высоким качествам (богатству белками, витаминами и другими ценными веществами) является хорошей основой для создания хромсодержащих препаратов с целью профилактики и лечения диабета и других заболеваний, связанных с дефицитом хрома, на ранних стадиях. Известно, что длительный прием спирулины способствует лечению диабета при одновременном оздоровлении организма.

Из литературы известны примеры биологической активности препаратов на основе биомассы Spirulina platensis [3-8]. Поэтому очень важно, чтобы способ получения хромсодержащего препарата на основе Spirulina platensis обеспечивал эндогенное включение хрома в ее биомассу в концентрациях, соответствующих фармацевтическим нормам и обеспечивал нормальные условия роста клеток, а значит, и естественные свойства биомассы. Хром, являясь жизненно важным элементом для живых организмов, может быть и токсичен в больших концентрациях. Концентрации хрома в питательной среде при получении биомассы спирулины с концентрацией 500 мг хрома/кг в способе [2] настолько велики, что при них рост клеток микроводоросли идет на фоне борьбы за выживание и, конечно, качество биомассы не может быть естественным и ее белковый состав должен меняться.

Целью предлагаемого изобретения является получение биомассы спирулины с оптимальными концентрациями хрома (CrIII), наиболее полезной для организма при сохранении естественных свойств спирулины и ее белкового состава.

Поставленная цель достигается тем, что органическое соединение трехвалентного хрома (CrIII) - уксуснокислый хром (Сr(СН₃СООН)₃) в заданных концентрациях по хрому, а именно 375 мкг/л до 22.5 мг/л, вводят в специально приготовленный раствор суспензии Spirulina platensis в стандартной питательной водно-солевой среде Заруха. Суспензия готовится из пятидневной культуры спирулины, выращенной в питательной среде Заруха. Клетки отделяют от раствора путем центрифугирования. Полученный плотный осадок вручную суспензируют в слабо притертом гомогенизаторе Поттера в растворе среды Заруха с целью частичного укорочения нитей спирулины. Это способствует стимуляции роста клеток спирулины в дальнейшем и интенсивному эндогенному включению хрома в ее органические биокомплексы, а также сохранению естественного состава биомассы. После добавления раствора уксуснокислого хрома в суспензию спирулины, приготовленную вышеописанным способом, клетки культивируются в течение 5 суток при освещении лампами накаливания и температуре 34°С. По окончании культивации полученная биомасса отделяется от раствора общеизвестными методами, а затем в ней определяется содержание хрома. Содержание хрома в биомассе контролируется и выбирается в пределах от 30 до 250 мкг/г. Одновременно ведется микроскопический контроль качества биомассы спирулины и определение ее белкового состава. Полученные результаты показывают, что концентрации хрома в биомассе спирулины удовлетворяют фармакологическим требованиям, а белковый состав остается неизменным.

Полученные результаты демонстрируются следующими графическими материалами:

- на фиг.1 представлена зависимость концентрации хрома в сухой биомассе спирулины от концентрации хрома в питательной среде на 5 сутки от начала культивирования в присутствии уксуснокислого хрома. Результаты получены методом эпитеплового нейтронного активационного анализа на импульсном быстром реакторе ИБР-2 ОИЯИ (г. Дубна). Из полученной кривой видны пределы концентраций CrIII в питательной среде от 375 мкг/л до 22,5 мг/л и соответствующие им концентрации хрома в сухой биомассе спирулины. Концентрации хрома от 30 до 250 мкг/г сухой спирулины, предлагаемые для профилактических и лечебных целей, соответствуют нормальной скорости роста культуры (фиг.2) и при этом сохраняются свойства спирулины и ее белковый состав;

- на фиг.2 показана зависимость выхода биомассы спирулины от концентрации в ней хрома, из которой видно, что для предлагаемых доз хрома сохраняется естественная скорость роста, что также подтверждается одновременным микроскопическим контролем качества культуры и определением белкового состава биомассы методом капиллярного электрофореза.

Пример осуществления способа: питательная водно-солевая среда Заруха готовится из следующих ингредиентов: NaHCO₃ 13,61 г/л, К₂НРO₄·3Н₂O 1,0 г/л, Na₂CO₃ 4,03 г/л, NaNO₃ 2,5 г/л, К₂SO₄ 1,0 г/л, NaCl 1,0 г/л, MgSO₄ 0,2 г/л, СаСl₂·2H₂О 0,04 г/л, FeSO₄·7H₂O 0,01 г/л, Nа₂ЕДТА 0,008 г/л (основной раствор), а также из микроэлементов, добавляемых в объеме 1 мл на 1л основной среды: Н₂ВО₃ 2,86·10^-3 г/л, MgCl₂·4H₂O 1,81·10^-3 г/л, ZnSO₄·7H₂O 0,22·10^-3 г/л, CuSO₄·5H₂O 8·10^-5 г/л, МоО₃ 15·10^-6 г/л, NН₄VО₃ 23·10^-6 г/л, К₂Сr₂(SO₄)₃·2Н₂O 96·10^-6 г/л, NiSO₄·7H₂O 48·10^-6 г/л, Na₂WO₄·2H₂O 18·10^-6 г/л, Ti₂(SO₄)₃ 40·10^-6 г/л, Со(NО₃)₂·6Н₂O 44·10^-6 г/л. Для приготовления суспензии культура спирулины предварительно выращивается в течение 5 дней в питательной среде Заруха по методу, описанному в работе [9]. Это обеспечивает при дальнейшей культивации высокую скорость роста и качество биомассы спирулины. После пятидневной культивации клетки отделяются от раствора путем центрифугирования при 3000 g в течение 10 мин. Полученный плотный осадок вручную суспензируется в слабо притертом гомогенизаторе Поттера в среде Заруха. При этом происходит частичное укорочение нитей спирулины, способствующее в дальнейшем ускорению роста культуры и интенсивному эндогенному включению хрома в ее биокомплексы. Раствор суспензии готовится из расчета 10 г плотного осадка на 1 л питательной среды. Затем в него добавляется 0,1 М раствор уксуснокислого хрома (Сr(СН₃СООН)₃) в концентрациях по хрому от 375 мкг/л до 22,5 мг/л. Последующая культивация спирулины проводится в течение 5 суток при температуре 34°С, освещении двумя лампами накаливания по 150 В каждая, рН 9,5-10,5 и перемешивании 160 об/мин.

Урожай биомассы собирается путем центрифугирования при 3000 g в течение 20 мин при 4°С. Полученный осадок промывается бидистиллированной водой и снова центрифугируется при тех же условиях. Следующая промывка проводится бидистиллированной водой, подкисленной лимонной кислотой (50 г/л Н₂O). После этого проводится центрифугирование при 12000 g в течение 20 мин при 4°С. окончательно полученный плотный осадок лиофильно высушивается и из него готовятся таблетки для анализа.

Содержание хрома в биомассе спирулины определялось методом эпитеплового нейтронного активационного анализа. Зависимость концентрации хрома в биомассе спирулины от его концентрации в питательной среде показана на фиг.1 Как видно из кривой на фиг.1, добавление CrIII в питательную среду от 0,5 мг/л до 15 мг/л приводит к увеличению количества связываемого клетками хрома без выхода на насыщение. Это облегчает задачу определения оптимальных доз CrIII в биомассе спирулины. На фиг.2 показана кинетика роста биомассы Spirulina platensis при культивации в питательной среде с различными концентрациями CrIII. Как видно из полученных кривых, прирост биомассы, а значит и ее естественные свойства в течение 5-6 дней культивации, практически не зависят от концентрации CrIII в питательной среде. Одновременно проводимый микроскопический контроль подтверждает сохранение естественного качества клеток спирулины. Контроль белкового состава биомассы спирулины, выращенной в этом эксперименте методом гель-электрофореза, также свидетельствует о том, что естественный белковый состав остается неизменным.

Таким образом, способ позволяет в накопительном режиме достигнуть включения 30-250 мкг CrIII на 1 г лиофилизованной биомассы спирулины без изменения ее качественных характеристик, что вполне соответствует фармакологическим дозам для изготовления полноценных профилактических и лечебных препаратов на основе матрицы спирулины. Из научно-технической и патентной литературы не известны способы, позволяющие получать хромсодержащую биомассу спирулины с такими качественными характеристиками, пригодную для производства диетических и лечебно-профилактических препаратов.

Литература

1. (21)97120726/14 (22)15.12.97 Высокие дозы трипиколината хрома для лечения диабета второго типа. Мккарти М. (US).

2. RU 2144078, 10.01.2000

3. Fox D. Health Benefits of Spirulina. In: Spirulina, Algae of Life. Bulletin of Institute of Oceanography (Monaco) No. 12, (1993).

4. М.Рисман. Биологически активные пищевые добавки. Арт-Бизнес-Центр, Москва, (1989), 220.

5. A.Belay, Y. Ota, K. Miyakawa, H. Shimamatsu. - Current Knowledge on Potential Health Benefits of Spirulina platensis. J. Appl. Phycol. (1993), No. 5, 235-241.

6. Hirahashi Т., Matsumoto M., Hazeki К., Saeki Y., Ui M., Seya T. Activation of the human innate immune system by Spirulina: augmentation of interferon production and NK cytotoxicity by oral administration of hot water extract of Spirulina platensis. International Immunopharmacology 2, 423-434, (2002).

7. Rangsayatom N., Upatham E.S., Kruatrachue M., Pokethitiyook K.P., Lanza G.R. Phytoremediation potential of Spirulina (Arthrospira) platensis: biosorption and toxicity studies of cadmium. Environmental Pollution, 119, 45-53, (2002).

8. Ortego-Calvo J.J., Maruclos С., Hermosin В., Sair-Juwenez С. Chemical composition of Spirulina and eucaryotic algae food products marketed in Spain. J. of Applied Phycology, 5, 425-435, (1993).

9. M.Г. Владимирова. В.Е. Семененко. Интенсивная культура одноклеточных водорослей. Москва, Мир, (1968).

Формула изобретения

Способ получения препарата спирулины, содержащей хром, включающий культивирование микроводоросли на питательной среде и внесение биологически активного хрома, с последующей инкубацией культуры, отличающийся тем, что в питательную среду с пятидневной культурой спирулины в виде предварительно гомогенизированной суспензии добавляют уксуснокислый хром в концентрации по хрому от 375 мкг/л до 22,5 мг/л и культивируют 5 дней до получения биомассы, содержащей хром от 30 до 250 мкг/г.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2