Способ диагностики внутриутробной инфекции новорожденных

 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам исследований. Сущность способа: в сыворотке пуповинной крови новорожденного определяют уровень гликозаминогликанов (ГАГ) и уроновых кислот (УК) и при их значениях 225,1-286,1 мкмоль/л и 282,0 -518,6 мкмоль/л соответственно ребенка признают инфицированным, а при значении ГАГ ниже 225,1 мкмоль/л и УК ниже 282,0 мкмоль/л ребенка признают больным. Способ прост в исполнении, доступен в клинических условиях, информативен на этапе доклинической диагностики.

Изобретение относится к области медицины, а именно к биологической химии, и может быть использовано в неонатологии для выявления группы риска новорожденных по реализации внутриутробной инфекции (ВУИ).

Известны методы диагностики ВУИ, которые основываются на традиционных вирусологических, бактериологических методах исследования [4, 5]. В настоящее время все больше распространяется выявление перинатальных патогенов иммунологическими методами: флюоресцирующих антител, выявление специфических противовирусных IgG, IgM в крови, спиномозговой жидкости новорожденного иммуноферментным методом - ИФА [1], латекс-агглютинации в различных биологических средах, а также определение иммунного статуса ребенка при рождении [6, 8]. Установление факта инфицирования проводят и путем трансабдоминального амниоцентеза с последующей идентификацией инфекционного агента в околоплодных водах [9, 11, 12].

За последние годы стремительно повысилась популярность серологического метода исследования инфекции - метода полимеразной цепной реакции [7, 10, 14], взятого за прототип. Метод основан на амплификации нуклеиновых кислот полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Выделение геномов инфекционных агентов с использованием ПЦР является одним из наиболее достоверных методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. Основным достоинством метода является чрезвычайно высокая чувствительность анализа - до 1 копии геномной ДНК возбудителя инфекции в исследуемой пробе в "nested"- варианте ПЦР (с "внутренней" и "внешней" парами олигонуклеотидов-праймеров). ПЦР с одной парой праймеров составляет обычно 30-100 копий генома в исследуемой пробе [7].

Возможности, заложенные в методе ПЦР, позволяют достигать максимальной специфичности анализа, то есть отсутствия перекрестных реакций со сходными микроорганизмами, способности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование.

Однако для использования указанных методов диагностики ВУИ в повседневной практике врачи-неонатологи испытывают ряд трудностей, а именно:

- методы полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа сложны, трудоемки и являются дорогостоящими. Проведение их возможно только в перинатальных центрах и родильных отделениях, входящих в состав многопрофильных клиник, которые имеют в своем арсенале современные диагностические центры, специальные лаборатории, оснащенные необходимой аппаратурой и реактивами;

- результаты методов ИФА и ПЦР могут быть как ложноположительными (за счет существования антигенных перекрестов между белками различных вирусов и между вирусными и клеточными белками), так и ложноотрицательными, поэтому при их проведении требуется аккуратность и высокая точность постановки проб. Кроме этого у новорожденных продукция антител к определенным антигенам может отсутствовать. Специфичность диагностики методом иммунофлюоресцентного анализа при исследовании клинических образцов у новорожденных детей часто снижается из-за присутствия различных контаминантов, а его чувствительность может оказаться недостаточной для обнаружения антигенов с низким уровнем продукции [7];

- методы трансабдоминального амниоцентеза и корданоцентеза высокоинвазивные и проведение их само по себе может стать причиной внутриутробного инфицирования плода;

- получение результатов исследований длительно по времени: бактериологических - не менее 3-х суток; иммунологических и серологических, с учетом доставки анализов в специализированные лаборатории, - более суток.

Вышеупомянутые условия крайне ограничивают возможности широкомасштабного применения указанных способов диагностики ВУИ в клинической практике, однако являются обязательными для выявления возбудителя и выбора оптимального лечения.

Поэтому, прежде чем прибегнуть к дорогостоящим методам обследования, необходимо выявить, имеет ли место факт внутриутробного инфицирования младенца, в какой степени компенсированы протективно-адаптационные способности организма ребенка и насколько выражен риск реализации ВУИ в клинические формы, целесообразно ли назначение сильнодействующих антибактериальных препаратов в каждом конкретном случае.

Задачей изобретения является разработка неинвазивного, высокочувствительного способа диагностики ВУИ, который может быть осуществлен на этапе доклинической диагностики.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат - упрощение способа, сокращение времени исследования, неинвазивность, информативность.

Предлагаемый технический результат достигается за счет определения содержания гликозаминогликанов (ГАГ) и уроновых кислот (УК) в сыворотке пуповинной крови новорожденных, угрожаемых по ВУИ, с целью определения степени интоксикации и защитно-компенсаторных способностей соединительной ткани младенца, а также прогнозирования внутриутробного инфицирования младенца и риска реализации ВУИ.

Гликозаминогликаны (ГАГ) - гетерополисахариды, являются важным полифункциональным компонентом межклеточного вещества соединительной ткани [2]. В настоящее время установлено, что ГАГ в составе протеогликанов соединительной ткани обеспечивают ее механические свойства, участвуют в репаративных процессах, процессах кроветворения, иммунного ответа, выполняют трофическую и антигипоксическую функции, играют роль в воспалительных реакциях и во многих других патологических процессах [2].

Фракции ГАГ, содержащиеся в крови и моче, отражают динамику количественного и качественного состава этих биополимеров в тканях, поэтому их определение имеет важное диагностическое значение при прогнозировании различных патологических состояний и, как показали наши исследования, при внутриутробной инфекции новорожденных в том числе.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: для исследования берут пуповинную кровь (в течение первой минуты после рождения младенца). Определение содержания кислых гликозаминогликанов проводят по методу Шараева П.Н. [13] Реакция гексуроновых кислот с карбазолом и серной кислотой основаны на образовании 5-карбоксифурфурола, который с концентрированной серной кислотой дает окрашенное соединение с максимумом поглощения, идентичным наблюдаемому в реакции с гексуроновыми кислотами [13]. Для постановки пробы требуется 0,5 мл образца (сыворотки пуповинной крови).

Кроме изучения уровня гликозаминогликанов определяют содержание уроновых кислот (УК) в сыворотке пуповинной крови. УК являются компонентами большинства кислых ГАГ и в крови они обнаруживаются как метаболиты гликозаминопротеогликанов и других уроносодержащих белков. Изучение содержания УК сыворотки крови позволяет косвенно характеризовать метаболизм ГАГ.

Содержание свободных уроновых кислот определяется в надосадочной жидкости после осаждения ГАГ этанолом с помощью карбазольной реакции Дише [13].

Критерии прогноза внутриутробной инфекции:

- при наличии у беременной факторов риска внутриутробного инфицирования плода и уровни ГАГ и УК в сыворотке пуповинной крови превышают 286,1 мкмоль/л и 518,6 мкмоль/л, то ребенка следует считать здоровым,

- в случае содержания ГАГ в сыворотке пуповинной крови в пределах 225,1-286,1 мкмоль/л и УК в пределах 282,0 - 518,6 мкмоль/л ребенок является инфицированным и рекомендуется дальнейшее обследование новорожденного с целью решения вопроса о назначении ему антибактериальной терапии,

- содержание в сыворотке пуповинной крови ГАГ ниже 225,1 мкмоль/л и УК ниже 282,0 мкмоль/л является подтверждением заболевания новорожденного и требует расширенного обследования новорожденного с целью выявления возбудителя заболевания и выбора антибактериальной терапии.

Предлагаемый способ диагностики внутриутробной инфекции является простым в исполнении и экономически выгодным, поскольку не требует привлечения специального дорогостоящего оборудования и реактивов, а также дополнительной аппаратуры, не имеющихся в распоряжении стандартно оснащенной биохимической лаборатории.

Вследствие своей технологической простоты и доступности лабораторного оборудования предлагаемый способ доступен в клинических условиях, применим в условиях родильного отделения при наличии биохимической лаборатории, где имеется фотоэлектроколориметр. В отношении новорожденного абсолютно неинвазивен и безопасен, так как для исследования берется пуповинная кровь до отделения плаценты и для постановки пробы требуется малое количество образца - 0,5 мл. Способ является достаточно информативным, что доказано статистическими исследованиями.

Таким образом, предлагаемое изобретение соответствует критерию “промышленная применимость”.

Предлагаемые критерии диагностики ВУИ плода и новорожденного применимы в повседневной работе врача-неонатолога и имеют практическое значение в плане определения дальнейшего лечения и выхаживания новорожденных.

Содержание гликозаминогликанов и их фракционный состав у детей в период новорожденности изучены впервые, биохимические критерии ВУИ плода и новорожденного приводятся впервые. Вышеизложенная совокупность существенных признаков в литературе не описана.

Проведенный анализ позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения критерию “новизна”.

Обследованы 152 доношенных новорожденных и их матери. Новорожденные, матери которых имели факторы риска внутриутробного инфицирования младенцев, были признаны инфицированными и составили основную группу исследования (109 новорожденных). Под “внутриутробным инфицированием” подразумевался установленный или предполагаемый факт внутриутробного проникновения к плоду микроорганизмов или вирусов от матери. В контрольную группу вошли 43 новорожденных ребенка, родившихся в удовлетворительном состоянии от здоровых матерей без факторов риска ВУИ.

Диагноз “внутриутробная инфекция” был выставлен на основании анамнестических данных, течения беременности и родов у матерей, объективного обследования новорожденного, характерных изменений в общем анализе периферической крови ребенка и биохимического анализа крови пуповины, бактериологического исследования микрофлоры с кожи новорожденных при рождении, а также морфологического исследования плаценты. Диагноз “врожденная пневмония” верифицировался рентгенологически.

В ходе динамического клинического наблюдения и обследования основная группа была разделена на 2 подгруппы:

1-ю подгруппу составили 44 (40,4%) ребенка, у которых в первые 3-е суток жизни внутриутробная инфекция реализовалась в клинические формы, данная подгруппа рассматривалась как дети с реализацией ВУИ;

2-ю подгруппу составили новорожденные, у которых не произошло реализации внутриутробной инфекции в клинические формы. Их количество составило 65 (59,6%) детей, данная подгруппа рассматривалась как дети с внутриутробным инфицированием без реализации внутриутробной инфекции в клинические формы.

Исследования показали, что в результате интоксикации в организме новорожденного с ВУИ наблюдается нарушение обмена соединительной ткани, сопровождающееся снижением уровня ГАГ в сыворотке пуповинной крови инфицированных новорожденных 239,3±11,5 мкмоль/л (n=65).

У здоровых новорожденных обнаружена прямая сильная корреляционная связь между уровнями ГАГ и уроновых кислот (r=0,93, p<0,05). Это и подчеркивает роль УК как метаболитов ГАГ. Выявлено, что ВУИ у новорожденных характеризуется не только уменьшением содержания ГАГ, но и снижением интенсивности их метаболизма, о чем свидетельствует низкий уровень свободных уроновых кислот. В группе инфицированных новорожденных отмечались достоверно более низкие показатели УК 488,2±21,6 мкмоль/л (n=65) в сравнении с контролем. Согласно данным статистического анализа (стандартный параметрический тест Стьюдента) различие было достоверно (p<0,001).

Критерии прогноза внутриутробной инфекции:

- при наличии у беременной факторов риска внутриутробного инфицирования плода и уровни ГАГ и УК в сыворотке пуповинной крови превышают 286,1 мкмоль/л и 518,6 мкмоль/л, то ребенка следует считать здоровым,

- в случае содержания ГАГ в сыворотке пуповинной крови в пределах 225,1-286,1 мкмоль/л и УК в пределах 282,0-518,6 мкмоль/л ребенок является инфицированным и рекомендуется дальнейшее обследование новорожденного с целью решения вопроса о назначении ему антибактериальной терапии,

- содержание в сыворотке пуповинной крови ГАГ ниже 225,1 мкмоль/л и УК ниже 282,0 мкмоль/л является подтверждением заболевания новорожденного и требует расширенного обследования новорожденного с целью выявления возбудителя заболевания и выбора антибактериальной терапии.

Определение уровня ГАГ и УК, полученные критерии оценки патологического состояния новорожденного являются неочевидными. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию “изобретательский уровень”.

Описанные изменения, происходящие в соединительной ткани у новорожденных, представлены в клинических примерах.

Пример 1. Ребенок А., родился от первой беременности, протекавшей на фоне анемии II степени во второй половине беременности. Мама по профессии - лаборант, возраст - 26 лет. В 39 недель беременности произошли срочные роды в переднем виде затылочного предлежания, околоплодные воды светлые, отошли при полном открытии шейки матки.

Родилась девочка с оценкой по шкале Апгар 7-8 баллов, массой тела 3290 г, длиной тела 52 см, окружностью головы 36 см, окружностью груди 35 см. Состояние при рождении удовлетворительное. К груди приложена через 15 мин после рождения, сосала грудь активно, дальнейшее выхаживание осуществлялось по принципу “мать-дитя”. Физиологическую позу удерживала хорошо, физиологические рефлексы спинального и орального автоматизма несколько снижены. Кожные покровы чистые, розовые. Слизистые оболочки розовые, чистые. Дыхание в легких пуэрильное. Тоны сердца ритмичные, ясные. Живот мягкий, печень и селезенка не увеличены. Физиологические отправления в норме.

Данные обследования. Общий анализ крови: полицетемия - количество эритроцитов 6,7·10¹²/л, гемоглобин 222 г/л, цветной показатель 1,0, гематокрит 65%, лейкоциты 18,9·10⁹/л, базофилы 1%, тенденция к эозинофилии 4%, палочкоядерные 20%, сегментоядерные 50%, лимфоциты 17%, моноциты 8%. Уровень общего белка в пуповинной крови 52,0 г/л, общего билирубина 30,0 мкмоль/л. Бактериологическое обследование посевов с кожи ребенка при рождении: роста бактерий не обнаружено.

Показатели ГАГ в сыворотке пуповинной крови 270,2 мкмоль/л, УК - 586,4 мкмоль/л.

На основании анамнеза течения беременности и родов у мамы, данных клинического и параклинических обследований ребенка выставлен диагноз: период новорожденности, здоров. Ребенок был выписан домой на 5 сутки в удовлетворительном состоянии.

Пример 2. Ребенок Б. Беременность у мамы вторая, в анамнезе медицинский аборт. Мама по профессии - маляр-штукатур, возраст 30 лет. Беременность протекала на фоне ОРВИ, угрозы прерывания беременности, кольпита, анемии II степени. В 38 недель произошли срочные роды в переднем виде затылочного предлежания, осложненные дородовым излитием околоплодных вод. Безводный период составил 13 часов, околоплодные воды мутные, зловонные. Развитие хориоамнионита.

Родился доношенный мальчик с оценкой по шкале Апгар 6-7 баллов, масса тела 3180 г, длина тела 54 см, окружность головы 35 см, окружность груди 35 см. Состояние ребенка при рождении средней тяжести, крик слабый болезненный. Физиологическую позу удерживает слабо, физиологические рефлексы спинального и орального автоматизма снижены. Кожные покровы бледно-розовые, дистальный цианоз, цианоз носогубного треугольника, обильная пустулезная сыпь на теле. Слизистые оболочки розовые, чистые. Дыхание в легких несколько ослабленное, проводится во все отделы, хрипы не выслушиваются. Тоны сердца ритмичные, приглушены. Живот мягкий. Печень +1,5 см, селезенка не увеличена. Физиологические отправления в норме.

К груди приложен через 20 мин, сосал вяло. Дальнейшее выхаживание по принципу "мать-дитя".

Данные обследования. В общем анализе крови тенденция к анемии - количество эритроцитов 5,2·10¹²/л, гемоглобин 182 г/л, цветной показатель 0,9, гематокрит 52%, лейкоциты 12,6 г/л, эозинофилия 6%, нейтрофилез, сегментоядерные 62%, лимфоциты 18%, моноциты 14%. Уровень общего билирубина в пуповинной крови 58 г/л, общего билирубина 34 мкмоль/л. Бактериологическое исследование посевов с кожи ребенка при рождении: высев энтерококков. Морфологическое исследование плаценты - лимфоцитарный тип воспаления. Иммунологическое обследование: ИФА - отрицательный, ПЦР - отрицательный.

Показатели ГАГ сыворотки пуповинной крови 225 мкмоль/л, УК - 280 мкмоль/л.

На основании анамнеза матери, осмотра ребенка, данных лабораторных исследований выставлен диагноз: ВУИ - пиодермия.

Выписан домой на 7 сутки в удовлетворительном состоянии.

Пример 3. Ребенок В. У матери беременность четвертая, роды вторые, в анамнезе два аборта. Возраст матери 32 года, по профессии - врач. Беременность протекала с угрозой прерывания в 28 недель, на фоне многоводия, гестационного пиелонефрита, хронической фетоплацентарной недостаточности. Роды срочные при сроке 38 недель в переднем виде затылочного предлежания, осложненные дородовым излитием околоплодных вод. Безводный период 16 часов, околоплодные воды зеленые.

Родился доношенный мальчик с оценкой по шкале Апгар 5-5 баллов, в родильном зале проведены реанимационные мероприятия. Масса тела ребенка 2900 г, длина тела 50 см, окружность головы 32 см, окружность груди 31 см. Состояние при рождении тяжелое, крик слабый, болезненный. Физиологическую позу не удерживает, физиологические рефлексы орального и спинального автоматизма угнетены. Кожные покровы бледно-розовые, дистальный цианоз, цианоз носогубного треугольника. Подкожно-жировой слой развит слабо на конечностях и брюшной стенке. Пуповина тонкая. Дыхание с участием вспомогательной мускулатуры, частота дыхания 50 в минуту. Оценка по Довнесу 3-4 балла, ребенок нуждался в дополнительной оксигенации. Аускультативно: дыхание в легких ослаблено, проводится во все отделы, выслушиваются крепитирующие хрипы. Тоны сердца ритмичные, приглушены. Частота сердечных сокращений 152 в минуту. Живот мягкий. Печень +1 см, селезенка не увеличена. Из родильного блока ребенок был переведен в палату интенсивной терапии новорожденных. Выхаживался в обогреваемой кроватке. Состояние ребенка оставалось тяжелым в течение 2-х суток.

Данные обследования. В общем анализе крови анемия: эритроциты -3,6·10¹²/л, гемоглобин 186 г/л, цветной показатель 0,9, лейкоцитоз 24·10⁹/л, эозинофилия 6%, нейтрофилез со сдвигом влево - палочкоядерные 12%, сегментоядерные 58%, лимфоциты 18%, моноциты 12%, ЛИИ - 2,4. В биохимическом анализе крови при рождении: гипопротеинемия (уровень общего белка 45 г/л), общий билирубин 34 мкмоль/л, гипогликемия (глюкоза 3,0 ммоль/л). Бактериологическое исследование посевов с кожи ребенка при рождении: E.coli. При морфологическом исследованиии плаценты - лейкоцитарный тип воспаления. По данным рентгенографии органов грудной клетки - мелкоочаговая инфильтрация.

Показатели ГАГ сыворотки пуповинной крови 212 мкмоль/л, УК - 256,6 мкмоль/л.

На основании отягощенного акушерского и соматического анамнеза матери, данных объективного обследования ребенка, лабораторных данных был выставлен диагноз: Осн. ВУИ - ринит, пневмония, тяж. ст., о, период, ДН I-II. Соп. Гипоксическое поражение центральной нервной системы, синдром угнетения, острый период. Синдром задержки внутриутробного развития по гипотрофическому типу I степени.

На 3-и сутки ребенок был переведен в отделении патологии новорожденных, где было проведено комплексное лечение, включающее антибиотикотерапию. Выписан домой на 15 сутки в удовлетворительном состоянии.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что предложенные биохимические критерии диагностики ВУИ и прогнозирования риска реализации внутриутробной инфекции являются эффективными и надежными и могут быть рекомендованы для широкого клинического применения.

Источники информации

1. Барашнев Ю.И. Перинатальная патология у новорожденных. Ю.И. Барашнев, А.Г. Антонов, Н.И. Кудашов // Акушерство и гинекология. -1994. - №4. - С.26-31.

2. Башкатов С.А. Гликозаминогликаны в механизмах адаптации организма /С.А.Башкатов - Уфа.: Изд. Башкирск. Ун-та, 1996. - 144с.

3. Биохимические методы анализа показателей обмена биополимеров соединительной ткани / П.Н.Шараев, В.Г.Иванов, В.И.Рябов и др. -Ижевск, 1989.- 15с.

4. Внутриутробные бактериальные и вирусные инфекции плода и новорожденного /Б.Л.Гуртовой, А.С.Анкирская и др. //Акушерство и гинекология. - 1994. - №4. - С.20-26.

5. Девис П.А. Бактериальные инфекции плода и новорожденного. / П.А. Девис, Л.А. Готефорс; Пер. с англ. - М.: 1987. - 97 с.

6. Коровина Н.А. К вопросу о трактовке лабораторных показателей при диагностике врожденных инфекций у новорожденных и детей первых месяцев жизни / Н.А. Коровина, А.Л. Заплатников // Проблемы внутриутробной инфекции плода и новорожденного. Материалы III съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины: - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2000.- С.104-105.

7. Малкова Е.М., Гришаева О.Н. Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных детей методом полимеразной цепной реакции //Методические рекомендации для врачей. / Под редакцией А.П. Помогаевой. - Томск, Кольцово. - 2000. - 23с.

8. Никулин Л.А., Левченко Л.А. Особенности иммунного ответа на бактериальную инфекцию у новорожденных высокого риска //Материалы III съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины “Проблемы внутриутробной инфекции плода и новорожденного”. - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2000. - С.62-63.

9. Особенности течения беременности и исходы родов при внутриутробном инфицировании плода / И.С. Сидорова, И.О. Макаров, А.А. Сидоров и др. //Российский вестник перинатологии и педиатрии. -1997, - Т. 42. - №1 - С.15-20.

10. Полимеразная цепная реакция в комплексной ранней диагностике внутриутробных инфекций /О.В.Юрлова, Е.Г.Максимова, Т.Д.Прокофьева и др. //Внутриутробные инфекции плода и новорожденного: Тез. докл. Всеросс. Науч. конф. 29 -31 мая 2000 г. - Саратов, 2000. - С.227-228.

11. Пустотина О.А., Бубнова Н.И. Диагностика внутриутробной инфекции (компоненты последа и амниотической жидкости) //Акушерство и гинекология. -1999. - №4. - С.3-5.

12. Сидорова И.С. Внутриутробные инфекции: хламидиоз, микоплазмоз, герпес, цитомегалия И.С. Сидорова, И.Н. Черниенко // Российский Вестник перинатологии и педиатрии. -1998. - №3. - С.7-13.

13. Шараев П.Н. Биохимические методы анализа показателей обмена биополимеров соединительной ткани. Метод. реком. /П.Н.Шараев, И.В.Вольхина, Н.Г.Наумова. - Ижевск, 1990. - 14с.

14. Alanen A. Polymerase chain reaction in the detection of microbes in amniotic fluid A. Alanen // Ann Med. -1998. - Vol. 30. -№3. -Р.288-295.

Формула изобретения

Способ диагностики внутриутробной инфекции новорожденных путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке пуповинной крови определяют уровень гликозаминогликанов (ГАГ) и уроновых кислот (УК) и при их значениях 225,1-286,1 мкмоль/л и 282,0-518,6 мкмоль/л соответственно ребенка признают инфицированным, а при значении ГАГ ниже 225,1 мкмоль/л и УК ниже 282,0 мкмоль/л ребенка признают больным.