Способ получения обогащенного углеводами альфафетопротеина

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения альфафетопротеина (АФП), высокой чистоты, обогащенного углеводами. Способ получения включает разбавление исходного сырья, которое осуществляют в два раза 0,1 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, центрифугирование его и хроматографию целевого продукта на аффинной колонке с низкоавидными высокоспецифичными моноклональными антителами, ковалентно пришитыми к цианбромированной сефарозе. Затем колонку отмывают 10-кратным объемом 2 М NaCl на 0,15 М карбонатном буфере с рН 9,3, элюцию проводят 2,5 М карбонатным буфером с рН 11,2, с последующей нейтрализацией элюата с помощью 1 М соляной кислотой. Продукт диализуют против фосфатно-солевого буфера и центрифугируют продукт, перед стерилизацией продукта его сорбируют на аффинных колонках и осуществляют солевую элюцию на ДЕАЕ-сефарозе. Затем добавляют сахарозу или крахмал, стерилизуют готовый продукт фильтрацией, с последующей лиофилизацией готового продукта или хранения его в виде раствора. Изобретение позволяет осуществить промышленную технологию получения препарата высокой степени чистоты с сохраненной углеводной фракции, пригодного в лечебной практике.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения альфафетопротеина (АФП), высокой чистоты, обогащенного углеводами.

Известен способ получения препарата АФП из исходного сырья - абортивной крови, согласно которому к исходному сырью добавляют хлористый натрий до конечной концентрации 0,5 М и смесь осветляют центрифугированием. Центрифугирование осуществляют при скорости 8000-10000 об/мин в течение 30 минут. Осадок белков отбрасывают, а полученный супернатант подвергают хроматографической очистке на сорбенте с иммобилизованными антителами против белков сыворотки крови человека, причем элюцию АФП с имунноаффинной колонки приводят 4 М раствором хлорида магния. В качестве сорбента используют ВrСМ-сефарозу или ВrСМ-агарозу с содержанием 5-10 мг/мл антител к АФП.

Полученную фракцию АФП концентрируют ультрафильтрацией и очищают гельфильтрацией на ультрагеле АсА-44, после чего полученный элюат подвергают дополнительной очистке на колонке с сорбентом на основе поликлональных антител против белков сыворотки крови человека и против имунноглобулинов сыворотки крови животного, использованного для получения антител к АФП.

В качестве сорбента используют Вr-СМ активированную сефарозу или агарозу с содержанием 5-10 мг/мл комплекса антител (против белков сыворотки крови человека и против иммуноглобулинов сыворотки крови животного).

Выделенный АФП доводят до необходимой концентрации, добавляют NaCl до концентрации 0,9-5,0% и полисахарид до концентрации 1,0-5,0%, полученный раствор стерилизуют фильтрацией, фасуют. Для увеличения срока хранения препарат может быть лиофилизирован.

Выход целевого продукта составляет 76-80%, а чистота препарата составляет 95-96% (см. патент РФ №2123009, кл. С 07 К 14/00, 1998 г.) - наиболее близкий аналог.

В результате анализа известного способа необходимо отметить, что данный способ не позволяет получить препарат с сравнительно высокой чистоты и биологической активности.

Известно, что действие АФП на клетку связано с его свойством вносить в клетки различные низкомолекулярные гидрофобные соединения, такие как эстрадиол, предшественники простагландинов полиненасыщенные жирные кислоты и другие гидрофобные лиганды.

Количество необходимого организму для этих целей АФП прямо пропорционально его способности рециркулировать - то есть количеству следующих циклов: связывание АФП с лигандом в межклеточном пространстве, проникновение его в клетку, освобождения от лиганда и выхода из клетки за новой порцией лиганда.

Недостатком препарата, полученного известным способом, является его сравнительно низкие чистота и биологическая активность. Установлено, что биологическая активность препарата АФП коррелирует со степенью гликолизирования его молекул и соответственно низким pI (Taketa et al., 1998, Ohta et al., 1998). Доказано, что в составе эмбрионального АФП наибольшей способностью к рециркуляции обладает его наиболее гликозилированная кислая (углеводная) фракция. Последовательность операций и условия их осуществления в способе - наиболее близком аналоге не позволяют в оптимальной степени сохранить в целевом продукте необходимую фракцию.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения в промышленных объемах препарата АФП высокой чистоты, с сохраненной углеводной фракцией, обладающего высокой рециркуляционной способностью.

Поставленная задача обеспечивается тем, что в способе получения обогащенного углеводами альфафетопротеина, включающем разбавление исходного сырья, центрифугирование его и хроматографию целевого продукта на аффинной колонке, элюцию целевого продукта с последующей нейтрализацией элюата, добавление сахарозы или крахмала, стерилизацию целевого продукта фильтрацией, с последующей лиофилизацией готового продукта или хранения его в виде раствора, новым является то, что разбавление исходного сырья осуществляют в два раза 0,1 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, хроматографию проводят на аффинной колонке с низкоавидными высокоспецифичными моноклональными антителами, ковалентно пришитыми к цианбромированной сефарозе, затем колонку отмывают 10-кратным объемом 2 М NaCl на 0,15 М карбонатном буфере с рН 9,3, а элюцию целевого продукта проводят 2,5 М карбонатным буфером с рН 11,2, нейтрализацию элюата осуществляют 1 М соляной кислоты, полученный целевой продукт диализуют против фосфатно-солевого буфера и центрифугируют продукт, а перед стерилизацией целевого продукта его сорбируют на аффинных колонках и осуществляют солевую элюцию на ДЕАЕ-сефарозе.

При проведении патентных исследований не выявлены решения, идентичные заявленному, а следовательно, заявленное изобретение соответствует критерию “новизна”.

Считаем, что сущность предложенного решения не следует явным образом из известных решений, а следовательно, заявленное изобретение соответствует критерию “изобретательский уровень”.

Сведений, изложенных в материалах заявки, достаточно для практического осуществления изобретения.

Способ получения препарата будет понятен из следующего примера.

Пример

В качестве исходного сырья для получения препарата может быть использована сыворотка абортивной крови или пуповинная сыворотка человека (как и в наиболее близком аналоге).

Исходное сырье разбавляют в два раза 0,1 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4 наносят на аффинную колонку с низкоавидными высокоспецифичными моноклональными антителами к АФП, ковалентно пришитыми к цианбромированной сефарозе. Установлено, что 0,1 М фосфатно-солевой буфер с рН 7,2-7,4 позволяет создать условия для наиболее полного связывания целевого продукта (АФП) антителами. Низкоавидные высокоспецифичные моноклональные антитела, ковалентно пришитые к цианбромированной сефарозе, обеспечивают максимально мягкую высоко специфическую сорбцию целевого продукта на данный носитель.

Колонку с нанесенным сырьем инкубируют в течение 12 часов при температуре +4°С, перемешивая сорбент. После удаления сырья колонку отмывают 10-кратным объемом 2 М NaСl на 0,15 М карбонатном буфере рН 9,3. Время инкубации и температура установлены, исходя из характера кинетических кривых адсорбции (минимальное время полного связывания). Перемешивание необходимо для ускорения процесса адсорбции. Отмывка колонки именно 10-кратным объемом 2 М NaCl на 0,15 М карбонатном буфере рН 9,3 позволяет обеспечить полное удаление с носителя неспецифически связавшихся белков, отличных от АФП.

Элюцию АФП с колонки приводят 2,5 М карбонатным буфером рН 11,2. Элюция именно 2,5 М карбонатным буфером рН 11,2 позволяет практически полностью элюировать АФП, не повредив его.

Элюат нейтрализуют 1 М соляной кислоты. Установлено, что 1 М соляная кислота обеспечивает мягкую нейтрализацию буфера без его значительного разбавления.

Полученный раствор АФП диализуют против фосфатно-солевого буфера и центрифугируют 30 минут при 8000 g. Диализ против фосфатно-солевого буфера и центрифугирование в указанных режимах обеспечивают перевод препарата в биогенный буфер, разрешенный для медицинского применения и освобождение от возможно элюированных частиц сорбентов с колонок.

Препарат проверяют на иммунологическую активность иммуноферментным анализом и на чистоту электрофорезом. Иммуноферментный анализ и электрофорез позволяют количественно определить АФП и возможные белковые примеси. В случае, если полученный препарат содержит менее 90% АФП, его сорбируют на аффинных колонках с моноспецифическими антителами против основных белков человеческой сыворотки, что позволяет повысить чистоту препарата.

Полученный продукт подвергают мягкой солевой элюции на ДЕАЕ-сефарозе. Мягкая солевая элюция на ДЕАЕ-сефарозе обеспечивает сохранение наиболее активной кислой фракции АФП.

Проверка результата процедуры выделения кислой фракции АФП осуществляется методом изоэлектрофокусирования с последующим иммунноэлектрофорезом. Данный метод обеспечивает контроль за рI полученного продукта.

Полученный препарат доводят до концентрации 75 мкг/мл и добавляют к нему сахарозу до 20% или любой полисахарид, разрешенный к применению в составе инъекционных препаратов (например, крахмал).

Выход целевого продукта составляет 70%, чистота препарата - 98-99%.

Полученный препарат стерилизуют фильтрацией, фасуют во флаконы и лиофильно высушивают и лиофилизируют.

Продукт стабилен 4 года при температуре -20°С, не менее 3-х лет при температуре +2-6°С и не менее 2-х лет при температуре 20°С.

Процедуры контроля продукта, упомянутые в заявке являются стандартными, они подробно описаны в литературе, и поэтому в материалах заявки не раскрыты.

Временные, температурные и иные режимы, не упомянутые в настоящей заявке, являются стандартными для проведения операций заявленного способа.

Существенными отличиями заявленного способа от прототипа, обеспечивающими решение поставленной задачи, являются:

- сохранение углеводной фракции АФП, обогащенной углеводами, обладающими повышенной способностью к рециркуляции;

- проведение хроматографической очистки целевого продукта в одну стадию на иммуносорбенте с иммобилизованными низкоаффинными высокоспецифичными моноклональными антителами к АФП, а кроме того, сорбируют полученный продукт на иммуносорбенте с иммобилизованными моноспецифическими антителами к основным белкам плазмы. Уменьшение этапов хроматографии и исключение стадии концентрации на ультрафильтрационной ячейке позволяет сделать процедуру хроматографической очистки препарата максимально щадящей;

- промывка колонки с моноклинальными антителами перед элюцией раствором 2 М натрий хлора на 0,15 М карбонатном буфере рН 9,3 и элюцию АФП с колонки 2,5 М карбонатным буфером рН 11,2, позволяет в отличие от элюции 4 М раствором NaCl максимально удалить посторонние примеси и исключить дополнительные стадии хроматографии.

Использование способа позволяет осуществить промышленную технологию получения препарата высокой степени чистоты с сохраненной углеводной фракции, пригодного в лечебной практике.

Формула изобретения

Способ получения обогащенного углеводами альфафетопротеина, включающий разбавление исходного сырья, центрифугирование его и хроматографию целевого продукта на аффинной колонке, элюцию целевого продукта с последующей нейтрализацией элюата, добавление сахарозы или крахмала, стерилизацию целевого продукта фильтрацией, с последующей лиофилизацией готового продукта или хранения его в виде раствора, отличающийся тем, что разбавление исходного сырья осуществляют в два раза 0,1 М фосфатно-солевым буфером с рН 7,2-7,4, хроматографию проводят на аффинной колонке с низкоавидными высокоспецифичными моноклональными антителами, ковалентно пришитыми к цианбромированной сефарозе, затем колонку отмывают 10-кратным объемом 2М NaCl на 0,15М карбонатном буфере с рН 9,3, а элюцию целевого продукта проводят 2,5 М карбонатным буфером с рН 11,2, нейтрализацию элюата осуществляют 1М соляной кислоты, полученный целевой продукт диализуют против фосфатно-солевого буфера и центрифугируют продукт, а перед стерилизацией целевого продукта его сорбируют на аффинных колонках и осуществляют солевую элюцию на ДЕАЕ-сефарозе.