Способ определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации

 

Изобретение относится к рыбной промышленности. Способ заключается в том, что образцы спермы до и после криоконсервации подвергают воздействию радиоактивного индикатора свободнорадикальных реакций с последующим измерением радиоактивности образцов методом жидкостной сцинтилляции. Оценку степени повреждения мембран проводят по изменению уровня содержания в них меченых свободных радикалов, а жизнеспособными считают образцы, имеющие показатель изменения уровня свободных радикалов не более 30-50%. Способ обладает достаточной чувствительностью определения, прост в выполнении. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к рыбной промышленности и может быть использовано в искусственном разведении рыб и других животных при создании банка генов ценных и исчезающих видов животных с целью сохранения биоразнообразия.

Практическое использование методов криоконсервации спермы животных сдерживается их несовершенством и неизученностью механизмов криоповреждений и способов их корректировки. Режимы замораживания - оттаивания, увеличение концентрации внутри- и внеклеточных солей, чрезмерное обезвоживание клетки, токсичность криозащитных сред могут вызвать как генетические повреждения, так и повреждения цитоплазматических мембран, от целостности которых зависит нормальное функционирование клеток.

Для обеспечения высокой эффективности методов криоконсервации спермы животных очень важно с высокой степенью точности прогнозировать ее выживаемость после криоконсервации. Это необходимо для оценки действия криозащитных сред и корректировки их состава, отбора проб наиболее жизнеспособных сперматозоидов для закладки на долгосрочное хранение и прогнозирования жизнеспособности эмбрионов.

В настоящее время не существует достаточно объективных методов определения жизнеспособности спермы животных по степени их повреждения после криоконсервации.

Наиболее распространенным способом определения жизнеспособности спермы после криоконсервации является оценка качества спермы рыб по ее активности. Активность определяют под микроскопом по соотношению числа подвижных сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением к общему количеству клеток в поле зрения и выражают в процентах. (См. Сборник научно-технической и методической документации по аквакультуре. М.: ВНИРО, 2001, с.152-158).

Способ является недостаточно достоверным и воспроизводимым из-за сложности получения капли спермы для визуального анализа под микроскопом строго одинакового объема. Методика нанесения капли спермы вызывает гибель части спермиев, что вносит дополнительную погрешность. Обеспечение стабильных и воспроизводимых условий нахождения спермиев при реализации способа (температура, рН и др.) также затруднительно. Кроме того, подвижность сперматозоидов не характеризует степень их повреждения в процессе криоконсервации и не всегда коррелирует с их жизнеспособностью и оплодотворяющей способностью, которая является основным показателем качества спермы.

Известен способ оценки качества спермы, заключающийся в измерении количества тепла, выделяемого спермиями при постоянной температуре инкубации. (См. Патент ГДР №85875, кл. 45 h 29/00, 1971).

Однако данный способ является недостаточно корректным, т.к. количество тепла, выделяемого спермиями, зависит от многих трудноконтролируемых факторов, например степени возбуждения, зрелости спермиев и т.д.

Известны способы определения качества спермы, основанные на принципе измерения времени изменения окраски спермы под воздействием различных индикаторов. (См. авт. свид. СССР №375067, кл. А 61 D 7/02, 1973, №622466, А 61 D 7/02, 1978).

Однако данные способы непригодны для оценки жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации, т.к. солевой состав криозащитных сред может изменять результаты окрашивания.

Известен способ определения качества спермиев, предусматривающий оценку уровня повреждения мембран, который заключается в смешивании спермы с питательной средой, содержащей флуорохром, и последующий анализ окрашенных спермиев под микроскопом. (См. авт. свид. №1329780, кл. A 61 D 7/02, А 61 В 10/00, 1987). В качестве флуорохрома используют смесь двух красителей - тиазинового красного и этидиум бромида. При повреждениях мембраны акросомы тиазиновый красный проникает в акросому и вызывает ее свечение, а этидиум бромид, проникая через поврежденную цитоплазматическую мембрану спермия, вызывает свечение его головки. Качество спермиев оценивают по интенсивности их свечения под люминесцентным микроскопом по балльной шкале.

Однако данный способ трудоемок и дает лишь общее представление о поврежденной структуре мембраны спермия по балльной шкале, не позволяя получить количественную характеристику уровня повреждений.

Наиболее близким способом того же назначения к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ определения жизнеспособности спермы, предусматривающий оценку степени повреждения мембран по изменению дыхания клеток в различных средах. (См. авт. свид. СССР №938990, кл. А 61 D 7/02, 1982). Способ заключается в полярографической оценке энергетической системы сперматозоидов в среде инкубации, которую проводят по реакции дыхания на 2,4 - динитрофенол и дополнительно определяют целостность внешней клеточной мембраны сперматозоидов по реакции дыхания на янтарат калия. Поскольку в неповрежденные сперматозоиды янтарно-кислый калий не проникает, усиление дыхания имеет место только в случае увеличения проницаемости мембран.

Таким образом, указанный способ позволяет графически зарегистрировать результат измерения и определить по отношению скорости дыхания до введения янтарата калия и после его введения степень повреждения мембран.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата, относится то, что способ недоступен к применению в полевых условиях, сложен в выполнении, требует дорогостоящего оборудования. Кроме того, способ является косвенным и недостаточно чувствительным, т.к. результат определения в большой степени зависит от тщательности и воспроизводимости подготовки анализируемой пробы.

Настоящее изобретение направлено на универсализацию и упрощение способа, снижение трудоемкости и повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что в способе определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации, предусматривающем оценку степени повреждения мембран и определение ее жизнеспособности по результатам этой оценки, особенность заключается в том, что образцы спермы до и после криоконсервации подвергают воздействию радиоактивного индикатора свободнорадикальных реакций с последующим измерением радиоактивности образцов методом жидкостной сцинтилляции, оценку степени повреждения мембран проводят по изменению уровня содержания в них меченых свободных радикалов по уравнению

Δ=(DPM_oп-DPM_К)·100/DPM_K,

где Δ - показатель изменения уровня меченых свободных радикалов, %,

DPM_K - содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы до криоконсервации, расп/мин,

DPM_оп - содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы после криоконсервации, расп/мин,

а жизнеспособными считают образцы, имеющие показатель изменения уровня свободных радикалов (Δ) не более 30-50%.

Кроме того, радиоактивный индикатор целесообразно добавлять к образцам спермы в соотношении 10:1,5. При этом предпочтительно сперму подвергать воздействию радиоактивного индикатора в течение 1-2 ч.

В заявленном способе для оценки степени криоповреждения спермы использован метод радикальной сополимеризации. Метод ориентирован на метаболический критерий - интенсивность свободнорадикальных реакций. Этот метод позволяет измерять стрессовую реакцию клеток сперматозоидов, подверженных криоконсервации, путем сравнения уровня свободнорадикальных реакций в них с контрольным (характеризующимся стационарным метаболическим состоянием клеток, не подвергаемых вредному воздействию). Изменение интенсивности окислительно-восстановительных метаболических реакций в клетках отражается на содержании свободных радикалов (СР) - короткоживущих промежуточных продуктов этих реакций. Радикалы могут считаться движущими факторами биохимических реакций. Основные группы свободных радикалов, определяемых в клетках животных различными методами, характеризуют две разные категории окислительных реакций: образование перекисных радикалов в липидах мембран и образование интермедиатов окислительно-восстановительных ферментативных реакций. При повреждениях клеток, вызванных различными причинами, развивается неспецифический "окислительный стресс", включающий развитие цепных реакций перекисного окисления липидов, образование супероксид-радикалов, повреждающих мембранные структуры клетки, а также генетический материал, а на более позднем этапе - изменение (как правило, снижение) активности мембрано-связанных ферментов, а также ферментов антиокислительной защитной системы клетки (каталазы, СОД и др.). Таким образом, при различных патологических процессах индуцируются реакции радикального характера, которые нарушают стационарное течение клеточных процессов.

Принцип метода состоит в применении растворимого в воде радиоактивного индикатора - мономера, который, будучи введен в живые клетки при инкубации, включается в СР-реакции in vivo и полимеризуется в местах образования СР. Становясь нерастворимым, полимер не выводится из клетки. После фиксации в мембране сперматозоида относительное содержание СР детектируется соответственно уровню радиоактивности в образцах спермы.

Методом электронного парамагнитного резонанса установлено, что СР в образце связываются веществом-маркером. Повреждения выявляются по СР-реакциям в первые 1-2 часа воздействия и затем подтверждаются в долгосрочных опытах по определению жизнеспособности спермиев другими методами и их оплодотворяющей способности. Предпочтительное соотношение количества радиоактивного индикатора к образцам спермы 10:1,5 подобрано опытным путем.

Многочисленными опытами установлено, что уровень изменения содержания СР в образцах спермы рыб, характеризующий степень повреждения клеток, в норме не превышает 30-35%; сдвиг уровня СР-реакций более чем на 50% соответствует началу патологических процессов, а более значительные изменения приводят к их гибели.

Проведенный анализ уровня техники позволил установить, что не обнаружен источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Следовательно, заявленное изобретение соответствует уровню "новизна".

Дополнительный поиск известных решений показал, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Образцы спермы до и после криоконсервации подвергают воздействию радиоактивного индикатора свободнорадикальных реакций. Образцы спермы после криоконсервации предварительно размораживают в теплой воде. К сперме добавляют радиоактивный индикатор, например ¹⁴С - акриламид активностью 0,1 мкКюри/мл в соотношении 1,5:100, и выдерживают в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Далее образцы отмывают пятикратно раствором Рингера на миллипоровых фильтрах под давлением. Затем фильтры с пробами помещают во флаконы для сцинтилляционного счета и высушивают на воздухе в течение суток. Пробы подготавливают для измерения радиоактивности методом жидкостной сцинтилляции и определяют радиоактивность. Аналогичные операции проводят для образцов нативной (не замороженной) спермы или нативной спермы, разведенной испытуемой средой. Значение радиоактивности проб соответствует содержанию в них свободных радикалов

Оценку степени повреждения мембран в образцах проводят по изменению уровня содержания в них меченых свободных радикалов по уравнению:

Δ=(DPM_оп-ОРМ_к)·100/DPM_К,

где Δ - показатель изменения уровня меченых свободных радикалов, %;

DPМ_k - содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы до криоконсервации, расп/мин;

DPM_оп - содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы после криоконсервации, расп/мин.

Жизнеспособными считают образцы, имеющие показатель изменения уровня свободных радикалов (Δ) не более 30-50%.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Опыты по определению жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации производили со спермой осетровых рыб, замороженной в различных криозащитных средах. Образцы спермы до и после криоконсервации подвергали воздействию радиоактивного индикатора свободнорадикальных реакций. Образцы спермы после криоконсервации, находящиеся в пробирках "Эппендорф", предварительно размораживали, помещая в водяную баню с температурой воды 38-40°С на 1 минуту. В пробирки, содержащие 1,5 мл спермы, добавляли по 10 мкл радиоактивного индикатора (¹⁴С - акриламид активностью 0,1 мкКюри/мл) и выдерживали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Далее образцы отмывали пятикратно раствором Рингера на миллипоровых фильтрах под давлением, применяя водоструйный насос. Для этого отбирали и помещали на фильтр по 200 мкл каждой пробы. Затем фильтры с пробами помещали во флаконы для сцинтилляционного счета и высушивали на воздухе в течение суток. Перед измерением радиоактивности методом жидкостной сцинтилляции пробы подготавливали следующим образом: для проведения кислотного гидролиза в каждый флакон добавляли по 0,4 мл конц. HClO₄ и по 0,4 мл конц. Н₂О₂; помещали в термостат (50°С) на 6 час; далее добавляли по 2,5 мл 1,5 М трисаминометана для нейтрализации кислоты и по 15 мл сцинтилляционной смеси на основе диоксана (раствор Брея). Определение радиоактивности проб проводили на жидкостном сцинтилляционном спектрометре "Rackbeta" фирмы LKB.

Оценку степени повреждения мембран в образцах проводили по изменению уровня содержания в них меченых свободных радикалов по показателю Δ, а также по проценту оплодотворения икры дефростированной спермой и дальнейшего развития (до вылупления). Контролем служила нативная сперма (без замораживания). Каждый вариант опыта включал 3 повторности.

Результаты приведены в таблице.

Как видно из таблицы, значения изменения уровня содержания меченых свободных радикалов в образцах спермы более 30-50% соответствует резкому снижению оплодотворяющей способности спермы.

На основании приведенных данных можно сделать вывод, что среда №64 обладает наибольшими криозащитными свойствами, судя как по показателю Δ, предложенному в данном способе, так и по оплодотворяющей способности дефростированной спермы. Криозащитные качества среды №63 приемлемы, а сред №№56 и 52 недостаточны.

Таким образом, заявляемый способ позволяет определить криоповреждения в сперматозоидах перед закладкой проб на долгосрочное хранение в криобанк, что способствует сокращению расходов на обслуживание биохранилищ. Как правило, криоповреждения могут присутствовать в 90% образцов. В среднем в год закладывается в криобанк около 11000 спермодоз. Обеспечение сохранности одной спермодозы (включая стоимость жидкого азота) составляет 38 рублей. Экономия от предварительного (предзакладочного) контроля криоповреждений заявленным методом составляет около 30000 рублей.

Заявляемый способ универсален, нетрудоемок, прост в выполнении, обладает достаточной чувствительностью определения и может быть использован при разработке условий замораживания и оттаивания спермы, криопротекторов и сред для ее замораживания, а также при разработке других способов ее сохранения.

Изложенные выше сведения свидетельствуют о выполнении при использовании заявленного изобретения следующей совокупности условий:

- способ определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации по заявленному изобретению относится к рыбной промышленности и может быть использован в искусственном разведении рыб и других животных;

- для заявленного способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте изложенной формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость".

Формула изобретения

1. Способ определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации, предусматривающий оценку степени повреждения мембран и определение ее жизнеспособности по результатам этой оценки, отличающийся тем, что образцы спермы до и после криоконсервации подвергают воздействию радиоактивного индикатора свободнорадикальных реакций с последующим измерением радиоактивности образцов методом жидкостной сцинтилляции, оценку степени повреждения мембран проводят по изменению уровня содержания в них меченых свободных радикалов по уравнению

Δ=(DPМ_ОП–DРМ_К)·100/DРМ_К,

где Δ – показатель изменения уровня меченых свободных радикалов, %;

DPM_K – содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы до криоконсервации, расп/мин;

DPM_ОП – содержание меченых свободных радикалов в образцах спермы после криоконсервации, расп/мин,

а жизнеспособными считают образцы, имеющие показатель изменения уровня свободных радикалов (Δ) не более 30-50%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что радиоактивный индикатор добавляют к образцам спермы в соотношении 10:1,5.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что сперму подвергают воздействию радиоактивного индикатора в течение 1-2 ч.