Способ получения препарата интерлейкина-1-бета

 

Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтики. Предложен способ получения препарата интерлейкина-1-бета (ИЛ-1б) из биомассы рекомбинантных штаммов Escherichia coli. Согласно изобретению бактериальные клетки разрушают обработкой щелочью при рН 12-13, клеточные стенки отделяют центрифугированием, белки осаждают обработкой супернатанта сульфатом аммония, после чего полученный осадок растворяют трис-буфером. Полученный раствор подвергают трехстадийной хроматографической очистке. Первая стадия включает хроматографию на катионите Солоза КГ и Q-целлюлозе. Далее очистку осуществляют на гидрофобном сорбенте Сфероцелл-Октил при рН 3,9 с использованием в качестве элюата раствора, содержащего 0,05 М трис(гидроксиметиламино)метана, 0,05 М натрия хлористого и 0,0125 М уксусной кислоты. Концентрируют смесь на катионите Солоза КГ. Использование изобретения обеспечивает получение повышенного выхода апирогенного интерлейкина-1-бета. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения препаратов цитокинов, а точнее к технологии получения препаратов высокоочищенного интерлейкина-1-бета (ИЛ-1б).

В настоящее время известны методы получения ИЛ-1б из культуральной среды клеток человека путем многостадийной очистки (Matsushima К. etall., Cell Immunol. 1992, p.290-301; Kronheim S.R.. et all., J.Experim. Med, 1985, N.161, p.490-502).

Недостатками большинства известных способов являются низкий выход целевого продукта, а также относительно невысокая активность.

Для решения проблемы получения значительных количеств интерлейкина разработаны технологии его микробиологического синтеза путем экспрессии гена в клетках микроорганизмов с последующим разрушением клеток и выделением конечного продукта (Meyers С.А. et all., J.Biol. Chem., 1987, N.262, р.11176-11181; Yem A.V. et all., Immunolog. Invest., N 17, p.551-559).

Недостатками данных методов являются сложная технология, низкий выход целевого продукта.

Известен способ получения рекомбинантного человеческого ИЛ-1б, который включает в себя экспрессию гена в бактериальные клетки E.coli, культивирование, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, разрушение клеток ультразвуком, отделение клеточных стенок центрифугированием, осаждение нуклеиновых кислот полиэтиленимином, удаление нуклеиновых кислот центрифугированием, осаждение общего белка сульфатом аммония, отделение белкового осадка центрифугированием, растворение белкового осадка, диализ белкового раствора и последующую очистку хроматографическими методами сначала на катионите Солоза КГ 20-30 с последующим диализом элюата, а затем на анионите DEAE-TSK-5PW (Ketlinsky S. et all., Eur. Cytokin Net., 1988, N.2, p.17-26).

Недостатками технологии являются большие потери ИЛ-1б, относительно низкая удельная активность, необходимость перевода целевого продукта в физиологический буфер, вследствие чего метод не может быть использован в препаративных целях.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ получения ИЛ-1б (пат. РФ № 2051922, 1992, кл. С 12 N 15/00, С 12 N 15/25), включающий в себя культивирование рекомбинантного штамма E.coli, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, разрушение клеток обработкой щелочью при рН 12-13 с последующей нейтрализацией смеси, отделение клеточных стенок центрифугированием, растворение белкового осадка и последующую очистку хроматографическими методами сначала на катионите Солоза КГ, затем на анионите Q-целлюлоза с последующим введением в элюат сульфата аммония и доочисткой на катионите Солоза КГ, а затем обессоливанием на том же катионите. Выход ИЛ-1б составляет около 10%, активность ИЛ-1б 1,3-1,6×10⁸ единиц на мг белка.

Недостатком способа является относительно низкий выход целевого продукта, а также пирогенность получаемого препарата, что ограничивает область его возможного применения.

Задачей, решаемой авторами, являлась разработка более технологичного процесса, позволяющего получать целевой продукт с большим выходом и более высокой активностью.

Было найдено, что при введении в технологию стадии очистки на сорбенте Сфероцелл-Октил удается добиться полной апирогенности препарата в сочетании с его селективной очисткой, однако использование данного сорбента эффективно только в случае смесей определенного состава, в частности, очищенных от некоторых белков. В этой связи была разработана технология получения препарата ИЛ-1б из биомассы рекомбинантных штаммов Escherichia coli, включающий в себя разрушение бактериальных клеток обработкой щелочью при рН 12-13, отделение нерастворимых компонентов центрифугированием, обработку супернатанта сульфатом аммония в концентрации, обеспечивающей осаждение белков (не менее 33,3 мас.%) растворение полученного осадка трис-буфером и хроматографическую очистку последовательно на сорбентах Солоза КГ, Q-целлюлоза и Сфероцелл-Октил и концентрирование продукта с использованием сорбента Солоза КГ.

В качестве анионита Сфероцелл-Октил используют разработанный в ГосНИИ особо чистых биопрепаратов сорбент, представляющий собой микросферическую нейтральную целлюлозу, модифицированную октилглицидиловым эфиром (пат. на ПМ № 12022, 2000, кл. B 01 D 15/08).

Стадии осаждения белков сульфатом аммония, хроматографию на Солозе КГ, Q-целлюлозе и концентрирование с использованием Солозы КГ осуществляют в стандартных условиях. Очистку на Сфероцелл-Октил оптимально осуществлять при рН 3,9 при использовании в качестве элюата раствор, содержащего 0,05 М трис(гидроксиметиламино)метана (далее Триса), 0.05 М натрия хлористого и 0,125 М уксусной кислоты.

Ранее Сфероцелл-Октил для очистки ИЛ-1б и борьбы с апирогенностью не применялся.

Сущность и особенности заявляемого способа иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. ИЛ-1б был получен из биомассы штамма Е. coli C600 (pPR-TGATG-hIL-1β-tsr). К биомассе объемом 0,6 л добавляют 0,6 л буферного раствора для лизиса, содержащего 0,6% трис(гидроксиметиламино)метана (далее Триса) 0,2% этилендиаминотетрауксусной кислоты (далее ЭДТА) и 0,03% фенилметилсульфонилфторида и 50 мл 45%-ного раствора едкого натра при интенсивном перемешивании до достижения рН 12,5, а затем нейтрализуют смесь 1М соляной кислотой до достижения рН 3,7. Нерастворимые продукты центрифугировали и получили 1,7 л супернатанта, содержащего 1,7 г белка, включая 0,6 г ИЛ-1б.

К лизату добавляли 850 г сернокислого аммония (33.3 мас.%), выдерживали в холодильном шкафу в течение 12 ч и центрифугировали смесь для отделения белков. Полученный осадок растворяли в 450 мл 0,05М раствора Триса, добавляли раствор 50%-ной уксусной кислоты до рН 4.1 и отделяли осадок центрифугированием. Супернатант пропускали через колонку, содержащую катионит Солоза КГ со скоростью 0,5 л/ч, промывали сорбент 1,2 л водным раствором, содержащим 0,05 М Триса и 0,0125 М уксусной кислоты, а затем элюировали белок 1,7 л раствора 0,05 М Триса. К полученному 1 л раствора белка добавляли раствор 50%-ной уксусной кислоты до рН 8,0 и наносили на колонку с сорбентом Q-целлюлоза, предварительно промытым 1 л раствора, содержащего 0,01 М Триса и 0,001 М уксусной кислоты, а затем элюировали интерлейкин 900 мл раствора, содержащего 0,05 М Триса и 0,004 М уксусной кислоты. Концентрация белка в растворе составляла 0,4 мг/мл. Выход ИЛ-1б 0,33 г.

К раствору объемом 800 мл добавляли 2,3 г натрия хлористого, а затем добавляли 50%-ную уксусную кислоту до рН 3,9. Раствор наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл-Октил, затем элтоировали ИЛ-1б раствором 0,05 М Триса, 0,05 М натрия хлористого и 0,125 М уксусной кислоты. Выход ИЛ-1б составил 0,31 г.

850 мл полученного раствора наносили на колонку с 50 мл сорбента Солоза КГ, уравновешенную раствором, содержащим 0,05 М Триса и 0,0125 М уксусной кислоты. Затем сорбент промывали 200 мл раствора 0,1 М двузамещенного натрия фосфата и 0,15 М натрия хлористого. Элюцию проводили 260 мл раствора 0,1 М двузамещенного натрия фосфата и 15 М натрия хлористого. Удельная активность ИЛ-1б 1×10⁸. Выход ИЛ-1б 0,3 г. Полученный продукт стерилизовали, стардартизовали по концентрации и разливали в пеницилиновые флаконы. Полученный препарат апирогенен.

Пример 2. В условиях примера 1 проводили выделение ИЛ-1б без стадии осаждения белка обработкой сульфатом аммония. Выход ИЛ-1б составил 0,14 г. Удельная активность ИЛ-1б 1,2×10⁸.

Полученные результаты показали, что новая технология очистки позволяет получать апирогенный препарат ИЛ-1б с выходом около 50% по активному началу по сравнению с 10-15%-ным выходом в прототипе, при наличии в нем пирогенного эффекта.

Формула изобретения

1. Способ получения препарата интерлейкина-1-бета из биомассы рекомбинантных штаммов Escherichia coli, включающий в себя разрушение бактериальных клеток обработкой щелочью при рН 12-13, отделение клеточных стенок центрифугированием, введением в супернатант сульфата аммония и трехстадийную хроматографическую очистку, включающую хроматографию на катионите Солоза КГ и Q-целлюлозе, и концентрирование смеси с использованием катионита Солоза КГ, отличающийся тем, что сульфат аммония вводят в супернатант в концентрации, обеспечивающей осаждение белков, после чего проводят растворение полученного осадка трис-буфером, а третью стадию хроматографической очистки проводят на сорбенте Сфероцелл-Октил.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сульфат аммония вводят в супернатант в концентрации не менее 33,3 мас.%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на Сфероцелл-Октил осуществляют при рН 3,9 с использованием в качестве элюата раствора, содержащего 0,05 М трис(гидроксиметиламино)метана, 0,05 М натрия хлористого и 0,0125 М уксусной кислоты.

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.06.2007

Извещение опубликовано: 27.06.2007        БИ: 18/2007

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 10.12.2010

Извещение опубликовано: 10.12.2010        БИ: 34/2010