Производные бензимидазола в качестве модуляторов ige

 

Изобретение относится к области медицины и касается фармацевтического состава для лечения или предотвращения аллергической реакции, связанной с повышенными уровнями IgE у млекопитающих, содержащего соединения общей формулы (А). Состав обладает повышенной активностью в отношении подавления избыточного вырабатывания IgE. 1 табл.

Существующий уровень техники

Данное изобретение относится к низкомолекулярным ингибиторам реакции IgE (иммуноглобулина Е) на аллергены, полезным при лечении аллергии, и/или астмы, или любых заболеваний, для которых IgE является патогенным.

По оценкам астмой страдают 10 миллионов человек в Соединенных Штатах, т.е. приблизительно 5% населения. Оцениваемые расходы на астму в Соединенных Штатах превышают 6 миллиардов долларов. Приблизительно 25% пациентов с астмой, обращающихся за скорой помощью, нуждаются в госпитализации, а большая часть общих прямых медицинских расходов идет на стационарное больничное лечение (скорую помощь) на сумму более 1,6 миллиарда долларов. Расходы на предписанные медикаменты, увеличившиеся между 1985 и 1990 годами на 54%, приблизились к 1,1 миллиарда долларов (Kelly, Pharmacotherapy 12:13 S-21 S (1997)).

В соответствии с Национальным обзором амбулаторного здравоохранения на астму приходится 1% всех амбулаторных посещений, и это заболевание продолжает оставаться важной причиной пропусков школы у детей. Несмотря на улучшение понимания процесса заболевания и лучшие лекарства, заболеваемость астмой и смертность от астмы в США и во всем мире продолжает расти (Министерство здравоохранения и гуманитарных служб США; 1991, публикация №91-3042). Таким образом, астма представляет собой серьезную угрозу здоровью общества.

Патофизиологические процессы, вызывающие возникновение астматического эпизода, могут быть разделены на две фазы, обе отличает брон-хоконстрикция, вызывающая затруднение дыхания, сдавливание груди и одышку. Астматическая реакция первой, ранней фазы вызывается аллергенами, раздражителями или физической нагрузкой. Аллергены поперечно связывают молекулы иммуноглобулина Е (IgE), связанные с рецепторами на тучных клетках, заставляя их высвобождать определенное количество ранее сформированных медиаторов воспаления, в том числе гистамина. К дополнительным инициаторам относятся осмотические изменения в тканях дыхательных путей после физической нагрузки или вдыхания холодного сухого воздуха. Реакция второй, поздней фазы характеризуется инфильтрацией активированных эозинофилов и других воспалительных клеток в ткани дыхательных путей, эпителиальным шелушением и присутствием в дыхательных путях сильно вязкой слизи. Нарушение, вызванное этой воспалительной реакцией, оставляет дыхательные пути подвергнутыми первичному воздействию или сенсибилизированными, так что для вызывания последующих симптомов астмы требуются меньшие инициализаторы.

Для паллиативного лечения астмы доступно несколько лекарств; однако их эффективность сильно варьируется. Короткодействующие β₂-адренергические агонисты, тербуталин и альбутерол, долгое время являющиеся основой лечения астмы, действуют прежде всего в ходе ранней фазы в качестве бронходилататоров. Более новые долго действующие β₂-агонисты, салметерол и формотерол, могут уменьшать бронхоконстрикторный компонент поздней реакции. Однако поскольку β₂-агонисты не обладают значительной противовоспалительной активностью, они не оказывают воздействия на бронхиальную гиперреактивность.

Многочисленные другие лекарства нацелены на специфические аспекты ранней или поздней астматической реакции. Например, антигистамины, такие как лоратадин, ингибируют ранние опосредованные гистамином воспалительные реакции. Некоторые из более новых антигистаминов, такие как азеластин и кетотифен, могут иметь и противовоспалительный, и слабый бронходилататорный эффект, но они в настоящий момент не имеют установленной эффективности при лечении астмы. Такие ингибиторы фосфодиэстеразы, как теофиллин/ксантины могут ослаблять поздние воспалительные реакции, но нет очевидных подтверждений того, что эти соединения уменьшают бронхиальную гиперреактивность. Такие антихолинергики, как ипратопиум бромид, используемые в случаях острой астмы для ингибирования тяжелого сужения бронхов, не воздействуют на воспаления ранней и поздней фазы, не воздействуют на бронхиальную гиперреактивность, а потому не играют никакой роли в хронической терапии.

Кортикостероидные лекарства, такие как будесонид, являются наиболее сильными противовоспалительными агентами. Ингибиторы высвобождения медиатора воспаления, такие как кромолин и недокромил, действуют путем стабилизации тучных клеток и, тем самым, ингибирования воспалительной реакции на аллерген в поздней стадии. Таким образом, кромолин и недокромил, как и другие кортикостероиды, уменьшают бронхиальную гиперреактивность путем минимизации сенсибилизирующего эффекта воспалительного нарушения дыхательных путей. К сожалению, эти противовоспалительные агенты не дают бронхорасширяющего эффекта.

Разрабатываются несколько новых агентов, ингибирующих специфические аспекты астматического воспаления. Например, антагонисты лейкотриенового рецептора (ICI-204, 219, accolate) специфически ингибируют опосредованные лейкотриенами воздействия. Лейкотриены участвуют и в возникновении воспаления дыхательных путей, и в бронхоконстрикции.

Таким образом, несмотря на то, что в настоящее время доступно множество лекарств для лечения астмы, эти соединения прежде всего паллиативны и/или имеют значительные побочные эффекты. Следовательно, были бы в высшей степени желательны новые терапевтические подходы, нацеленные на причину, лежащую в основании, а не на каскад симптомов. Астма и аллергия имеют общую зависимость от опосредованных IgE событий. Разумеется, известно, что избыточное вырабатывание IgE является основной причиной аллергий в целом и аллергической астмы в частности (Duplantier and Cheng, Ann. Rep. Med. Chem. 29:73-81 (1994)). Таким образом, соединения, понижающие уровни IgE, могут быть эффективными при лечении причины, лежащей в основе астмы и аллергии.

Ни одна из современных терапий не устраняет избыточный циркулирующий IgE. Гипотеза о том, что понижение IgE плазмы может уменьшить аллергическую реакцию, была подтверждена недавними клиническими результатами с химерическим анти-IgE антителом CGP-51901 и рекомбинантным очеловеченным моноклональным антителом rhuMAB-E25. Действительно, три компании, Tanox Biosystems Inc., Genentech Inc. и Novartis AG совместно работают над разработкой очеловеченного анти-IgE антитела (BioWorld Today, February 26, 1997, р.2), которое будет лечить аллергию и астму путем нейтрализации избыточного IgE. Компания Tanox уже успешно протестировала анти-IgE антитело CGP-51901, уменьшавшее тяжесть и продолжительность назальных симптомов аллергического ринита в фазе II теста на 155 пациентах (Scrip №2080, Nov.24, 1995, р.26). Компания Genentech недавно раскрыла положительные результаты тестов фаз II/III на 536 пациентах рекомбинантного очеловеченного моноклонального антитела rhuMAB-E25 (BioWorld Today, November 10, 1998, р.1). Это антитело rhuMAB-E25, вводимое путем инъекции (высшая доза 300 мг каждые 2-4 недели по необходимости), обеспечивало 50%-ное снижение количества дней, когда пациенту требовались дополнительные неотложные медикаменты (антигистамины и противоотечные средства), по сравнению с плацебо. Получение недостающих данных по этому продукту предполагается в 2000 году. Положительные результаты тестов анти-IgE антитела по снижению количества дней, когда пациенту требовались дополнительные неотложные медикаменты (антигистамины и противоотечные средства), по сравнению с плацебо. Получение недостающих данных по этому продукту предполагается в 2000 году. Положительные результаты тестов анти-IgE антитела показывают, что терапевтические стратегии, направленные на понижающее регулирование IgE, могут быть эффективными.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение рассматривает семейство родственных соединений для использования при лечении состояния, связанного с избыточным уровнем IgE. Бензимидазоловые ингибиторы IgE в соответствии с настоящим изобретением представлены родовой формулой

в которой Х и Y независимо выбираются из группы, состоящей из H, алкила, алкоксигруппы, арила, замещенного арила, гидроксигруппы, галогена, аминогруппы, алкиламиногруппы, нитрогруппы, цианогруппы, СF₃, ОСF₃, CONH₂, CONHR и NHCOR₁. R выбирается из группы, состоящей из Н, СН₃, С₂Н₅, С₃Н₇, С₄Н₉, CH₂Рh и СН₂С₆Н₄-F(р-). R₁ и R₂ выбираются независимо из группы, состоящей из Н, арила, замещенного арила, циклоарила, замещенного циклоарила, многокольцевого циклоарила, бензила, замещенного бензила и тому подобного. Замещениями являются алкил, арил, CF₃, СН₃, ОСН₃, ОН, CN, COOR, СООН и тому подобное.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения раскрывается состав для использования при лечении аллергического состояния, содержащий диациловый бензимидазоловый ингибитор IgE, раскрытый выше, и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент, объедиенные в фармацевтически приемлемом разбавителе. Дополнительные активные ингредиенты могут выбираться из группы, состоящей из короткодействующих b2-адренергических агонистов, таких как тербуталин и альбутерол, долгодействующих b2-адренергических агонистов, таких как салметерол и формотерол, антигистаминов, таких как лоратадин, азеластин и кетотифен, ингибиторов фосфодиэстеразы, антихолинергических агентов, кортикостероидов, ингибиторов высвобождения воспалительного медиатора или антагонистов лейкотриенового рецептора.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения раскрывается семейство симметричных и асимметричных диациловых и моноациловых бензимидазоловых соединений для использования при лечении аллергического состояния, содержащее следующие виды (см. в конце описания)

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения раскрывается способ приготовления медикамента для лечения состояния, связанного с избыточным уровнем IgE. Это соединение имеет формулу

где Х и Y независимо выбираются из группы, состоящей из Н, алкила, алкоксигруппы, арила, замещенного арила, гидроксигруппы, галогена, аминогруппы, алкиламиногруппы, нитрогруппы, цианогруппы, СF₃, ОСF₃, CONH₂, CONHR и NHCOR₁. R выбирается из группы, состоящей из Н, СН₃, С₂Н₅, С₃Н₇, С₄Н₉, CH₂Ph и СН₂С₆Н₄-F(р-). R₁ и R₂ выбираются независимо из группы, состоящей из Н, арила, замещенного арила, циклоарила, замещенного циклоарила, многокольцевого циклоарила, бензила, замещенного бензила и тому подобного. Замещениями являются алкил, арил, СF₃, СН₃, ОСН₃, Oh, CN, COOR, СООН и тому подобное.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения раскрывается способ лечения млекопитающего, имеющего состояние, связанное с избыточным уровнем IgE. Способ содержит введение млекопитающему количества соединения, достаточного для уменьшения уровней IgE у млекопитающего. Соединение имеет формулу

где Х и Y независимо выбираются из группы, состоящей из Н, алкила, алкоксигруппы, арила, замещенного арила, гидроксигруппы, галогена, аминогруппы, алкиламиногруппы, нитрогруппы, цианогруппы, СF₃, ОСF₃, CONH₂, CONHR и NHCOR₁. R выбирается из группы, состоящей из Н, СН₃, С₂Н₅, С₃Н₇, С₄Н₉, CH₂Ph и СН₂С₆Н₄-F(р-). R₁ и R₂ выбираются независимо из группы, состоящей из Н, арила, замещенного арила, циклоарила, замещенного циклоарила, многокольцевого циклоарила, бензила, замещенного бензила, алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, многокольцевого циклоалкила, алифатических соединений со сцепленными кольцами, циклопропила, замещенного циклопропила, циклобутила, замещенного циклобутила, циклопентила, замещенного циклопентила, циклогексила, замещенного циклогексила, циклогептила, замещенного циклогептила, бициклогептила, бициклооктила, бициклононила, замещенного бициклоалкила, адамантила, замещенного адамантила и тому подобного, в которой по меньшей мере один из радикалов R₁ и R₂ является ароматической группой. Замещениями являются алкил, арил, СF₃, СН₃, ОСН₃, ОН, CN, COOR, СООН и тому подобное.

В варианте раскрытого выше способа по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент может приниматься в сочетании с приемом соединения. Дополнительный активный ингредиент может объединяться с упомянутым соединением в фармацевтически приемлемом разбавителе и совместно вводиться млекопитающему. Дополнительным активным ингредиентом может быть короткодействующий b2-адренергический агонист, выбранный из группы, состоящей из тербуталина и альбутерола. В одном из вариантов дополнительным активным ингредиентом может быть долгодействующий b2-адренергический агонист, выбранный из группы, состоящей из салметерола и формотерола, или антигистамин, выбранный из группы, состоящей из лоратадина, азеластина и кетотифена. В еще одном варианте дополнительным активным ингредиентом может быть ингибитор фосфодиэстеразы, антихолинергический агент, кортикостероид, ингибитор высвобождения воспалительного медиатора или антагонист лейкотриенового рецептора.

Соединение обычно принимается дозами величиной от приблизительно 0,01 мг до приблизительно 100 мг на 1 кг массы тела в день разделенными дозами упомянутого соединения в течение по меньшей мере двух последовательных дней с регулярными периодическими интервалами.

Прочие варианты в рамках объема настоящего изобретения могут быть более полно поняты по последующему подробному описанию.

Подробное описание предпочтительного выполнения

Настоящее изобретение направлено на низкомолекулярные ингибиторы IgE (синтеза и/или высвобождения), которые полезны при лечении аллергии, и/или астмы, или любых заболеваний, в которых IgE является патогенным. Конкретные рассматриваемые здесь соединения были идентифицированы по их способности к подавлению уровней IgE как в ex vivo тестах, так и в in vivo тестах. Разработка и оптимизация режимов клинического лечения может быть прослежена специалистами по описанным ниже тестам ех vivo и in vivo.

Тест Ех Vivo

Этот тест начинается с инициирования антигена in vivo и измеряет вторичные реакции антитела in vitro. Основной протокол был задокументирован и оптимизирован для диапазона параметров, в том числе: доза антигена для инициирования и временной промежуток после инициирования, количество культивированных in vitro клеток, концентрации антигена для выявления вторичной реакции IgE (и прочих иммуноглобулинов) in vitro, пробу фетальной бычьей сыворотки (ФБС), которая обеспечивает оптимальную реакцию IgE in vitro, важность CD4+ инициированных Т-клеток и гаптен-специфических В-клеток, а также специфичность теста ELISA для IgE (Marcelletti and Katz, Cellular Immunology 135:471-489 (1991); включено сюда посредством ссылки).

Реальный протокол, использовавшийся для данного проекта, был адаптирован для анализа с большей производительностью. Мыши BALB/cByj были иммунизированы внутрибрюшинно с помощью 10 мкг DNP-KLH, абсорбированного на 4 мг квасцов, и убивались через 15 дней. Селезенки изымались и гомогенизировались в тканевом дефибрере, дважды промывались и содержались в DMEM, дополненном 10% ФБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,0005% 2-меркаптоэтанола. Были установлены культуры клеток селезенки (2-3 миллиона клеток/мл, 0,2 мл/ячейка в четырех экземплярах, 96-ячеечные пластины) в присутствии или отсутствии DNP-KLH (10 нг/мл). Тестовые соединения (2 мкг/мл и 50 нг/мл) добавлялись к культурам клеток селезенки, содержащим антиген, и инкубировались при 37°С в течение 8 дней в атмосфере 10% СO₂.

Поверхностный слой культуры был собран через 8 дней, и были измерены иммуноглобулины путем модификации специфического изотип-селективного теста ELISA, описанного в Marcelletti and Katz (см. выше). Тест был модифицирован для облегчения высокой производительности. Пластины ELISA были подготовлены путем покрывания DNP-KLH в течение ночи. После блокирования с помощью альбумина бычьей сыворотки (АБС) аликвотное количество поверхностного слоя каждой культуры разводилось (1:4 в фосфатно-буферном солевом растворе (ФБСР) с АБС, азидом натрия и Tween 20), добавлялось на пластины ELISA и инкубировалось в течение ночи в увлажняемом ящике при 4°С. Уровни IgE были подсчитаны после последовательных инкубаций с биотинилированным антимышиным IgE козла (b-GAME), АР-стрептавидином и субстратом.

Подобным же образом был измерен антигенно-специфический IgG1, за исключением того, что поверхностный слой культуры был разведен 200-кратно, a b-GAME был заменен на биотинилированный антимышиный IgG1 козла (b-GAMGl). IgG2a был измерен в пластинах ELISA, которые были покрыты DNP-KLH с последующим разведением 1:20 поверхностного слоя культуры и инкубацией с биотинилированным антимышиным IgG2a козла (b-GAMG2a). Количество каждого изотипа определялось путем сравнения со стандартной кривой. Уровень определяемости всего антитела был приблизительно равен 200-400 пг/мл, и существовала кросс-реактивность, в объеме менее 0,001%, с любым другим изотипом Ig в ELISA для IgE.

Тест In Vivo

Соединения, активность которых была обнаружена в тесте ex vivo (выше), были дополнительно протестированы на активность при подавлении реакций IgE in vivo. Мыши, получившие облучение низкой дозы до иммунизации с помощью носителя, проявляли увеличенную реакцию IgE на сенсибилизацию антигеном 7 дней спустя. Прием тестовых соединений производился непосредственно перед и после сенсибилизации антигеном, измерялась способность данного лекарства подавлять реакцию IgE. Сравнивались уровни IgE, IgG1 и IgG2a в сыворотке.

Самки мышей BALB/cByj облучались дозой 250 рад через 7 часов после начала дневного светового цикла. Два часа спустя мыши иммунизировались внутрибрюшинно с помощью 2 мкг KLH в 4 мг квасцов. Через 6 дней начинались инъекции лекарства в течение от двух до семи дней, раз или два в день. Обычно внутрибрюшинные инъекции и пероральные принудительные введения производились в виде суспензий (150 мкл/инъекция) в солевом растворе с 10% этанола и 0,25% метилцеллюлозы. Каждая группа состояла из 5-6 мышей. На второй день приема лекарства вводилось 2 мкг DNP-KLH внутрибрюшинно в 4 мг квасцов, непосредственно после утренней инъекции лекарства. Мышам пускалась кровь через 7-21 дней после введения DNP-KLH.

Антиген-специфические антитела IgE, IgG1 и IgG2a измерялись посредством ELISA. Периорбитальные пробы крови центрифугировались при 14000 об/мин в течение 10 минут, поднявшиеся на поверхность элементы разводились пятикратно в солевом растворе и снова центрифугировались. Концентрации антитела каждой пробы крови определялись посредством ELISA четырех растворений (в трех экземплярах) и сравнивались со стандартной кривой: анти-DNP IgE (1:100 до 1:800), анти-DNP IgG2a (1:100 до 1:800) и анти-DNP IgG1 (1:1600 до 1:12800).

Диациловые бензимидазоловые ингибиторы IgE

Было синтезировано несколько описываемых родовой формулой видов, и была оценена их эффективность при понижающем регулировании IgE в ex vivo и в in vivo тестах.

где Х и Y независимо выбираются из группы, состоящей из Н, алкила, алкоксигруппы, арила, замещенного арила, гидроксигруппы, галогена, аминогруппы, алкиламиногруппы, нитрогруппы, цианогруппы, СF₃, ОСF₃, CONH₂, CONHR и NHCOR₁. R выбирается из группы, состоящей из Н, СН₃, С₂Н₅, С₃Н₇, С₄Н₉, СН₃Рh и СН₂С₆Н₄-F(р-). R₁ и R₂ выбираются независимо из группы, состоящей из Н, арила, замещенного арила, циклоарила, замещенного циклоарила, многокольцевого циклоарила, бензила, замещенного бензила, алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, многокольцевого циклоалкила, алифатических соединений со сцепленными кольцами, циклопропила, замещенного циклопропила, циклобутила, замещенного циклобутила, циклопентила, замещенного циклопентила, циклогексила, замещенного циклогексила, циклогептила, замещенного циклогептила, бициклогептила, бициклооктила, бициклононила, замещенного бициклоалкила, адамантила, замещенного адамантила и тому подобного, в которой по меньшей мере один из радикалов R₁ и R₂ является ароматической группой. Замещениями являются алкил, арил, СF₃, СН₃, ОСН₃, ОН, CN, COOR, СООН и тому подобное.

Синтез комбинаторной библиотеки

Диациловые бензимидазоловые соединения по настоящему изобретению были приготовлены с помощью следующих реакций синтеза, в которых желательные кислые хлориды выбираются из групп R₁ и R₂, приведенных в Таблице.

Синтез соединения 3: 4-нитро-1,2-фенилендиамин (10 г, 65,3 ммоль) и 4-аминобензойная кислота (8,95 г, 65,3 ммоль) помещались в колбу с круглым дном, и медленно добавлялся оксихлорид фосфора (95 мл). Реакционной смеси позволяли перемешиваться в условиях противотока. Через 18 часов реакции давали возможность охладиться, а затем медленно выливали на водно-ледяную смесь в колбе Эрленмайера при энергичном перемешивании. Выпадал зеленовато-желтый осадок, который затем фильтровался и промывался обильным количеством воды. Затем остаток высушивался, давая 16,9 г сырого желательного продукта. Масс-спектральный анализ (положительный ион) показал наличие соединения 3.

Синтез соединения 4: бензимидазол 3 (800 мг, 3,14 ммоль) растворялся в сухом пиридине (5 мл) в сцинтилляционном сосуде, и медленно добавлялись желательные кислые хлориды (1,1 экв). Реакции проводились в печи при 60°С. Через 16 часов реакция охлаждалась до комнатной температуры, и добавлялась дистиллированная вода. Происходило выпадение осадка, который отфильтровывался, промывался водой и высушивался на воздухе. Водный слой экстрагировался с помощью ЕtOАс (6×50 мл), высушивался на безводном Na₂SO₄, а растворитель удалялся в вакууме, давая в результате окрашенное твердое вещество. Путем положительно-ионной масс-спектрографии было обнаружено, что желательный моноацилированный продукт присутствует в начальном осадке, а также в органическом слое. Поэтому полученные твердые остатки комбинировались и использовались как таковые для шага восстановления.

Восстановление соединения 4: сырой моноацилированный нитро-бензимидазол 4 (1,22 г, 3,40 ммоль) растворялся в МеОН (20 мл), и добавлялось минимальное количество THF для полного растворения. Добавлялось каталитическое количество 10% Pd на С, и раствор дегазировался и оставлялся перемешиваться под давлением 3,4 атм в атмосфере H₂ на 4 часа. После завершения реакции по наблюдениям посредством тонкослойной хроматографии реакционная смесь фильтровалась через селит, и растворитель удалялся при пониженном давлении до получения 979 мг сырого остатка.

Общие органические анализы

HPLC/масс-спектрографические данные были получены с помощью Gilson semi-prep HPLC с УФ-детектором Gilson 170 Diode Array и масс-спектрографического детектора РЕ Sciex API 100LC. Детектор Waters 600Е с УФ Waters 490E также использовался для записи HPLC-данных. Соединения элюировались градиентом CH₃CN (с 0,0035% TFA) и Н₂O (с 0,01% TFA). Оба HPLC-инструмента использовали колонны Advantage С 18 60А 5μ 50 мм × 4,6 мм компании Thomson Instmment Compamy. Масс-спектры были получены путем прямой инъекции и электроаэрозольной ионизации на масс-спектрографическом детекторе РЕ Sciex API 100LC. Тонкослойная хроматография производилась с помощью алюминиевых прокаленных покрытых пластин Merck 60F-254. Флэш-хроматография выполнялась на силикагеле Merck 60 (230-400 меш), купленном в фирме ЕМ Scientific.

Синтез симметричных диамидов

Симметричные диациловые бензимидазоловые соединения по настоящему изобретению в общем случае приготавливались из 2-(4-аминофенил)-5-аминобензимидазола, который получался путем восстановления 2-(4-нитрофенил)-6-нитробензимидазола.

Динитробензимидазол приготавливался следующим образом: смесь 4-нитрофенилендиамина (6,4 г, 41,83 ммоль) и 4-нитробензойной кислоты (7,86 г, 47 ммоль) растворялась в РОСl₃ (250 мл) и нагревалась для оттока в течение 2 часов. Реакционная смесь охлаждалась, выливалась на лед и перемешивалась в течение 30 минут. Получающееся твердое вещество фильтровалось и промывалось метанолом и бикарбонатом натрия для удаления непрореагировавшей кислоты и оставлялось высыхать на ночь, давая желательный продукт в виде коричневого твердого вещества (5,8 г).

Продукт определялся посредством электроаэрозольной масс-спектрографии (температура плавления >300°С).

2-(4-Аминофенил)-5-аминобензимидазол был приготовлен путем суспендирования вышеупомянутого твердого вещества (75 г) в THF (75 мл), к которой добавлялся Pd-C (10% Pd по весу). Колба продувалась водородом и перемешивалась в течение ночи под стеклянным колпаком с водородом. Тонкослойная хроматография и масс-спектрография показали, что начальный материал все еще наличествовал, поэтому реакция была оставлена продолжаться в течение выходных. Тонкослойная хроматография показала завершение реакции, реакция фильтровалась через селит и промывалась метанолом. Растворитель удалялся при пониженном давлении, при этом получалось темно-коричневое твердое вещество (0,37 г), которое использовалось без дополнительной очистки.

Альтернативно 2-(4-аминофенил)-5-аминобензимидазол был приготовлен путем следующего восстановления: 2-(4-нитрофенил)-6-нитробензимидазол (8,9 г, 31 ммоль) суспендировался в концентрированной НСl (100 мл), к которой был добавлен хлорид олова (42,3 г, 180 ммоль). Реакционная смесь нагревалась для оттока в течение 5 часов. Смесь охлаждалась до комнатной температуры, и соль соляной кислоты желательного продукта осаждалась посредством добавления этанола. Полученное твердое вещество фильтровалось, заново растворялось в воде, и раствор защелачивался путем добавления концентрированного гидроксида аммония. Полученный осадок фильтровался и высушивался в течение ночи под вакуумом, давая желательный продукт в виде серого твердого вещества (6,023 г, 26,9 ммоль, 87%). Продукт определялся путем электроаэрозольной масс-спектрографии и HPLC (температура плавления 222-227°С).

2-(4-Аминофенил)-5-метокси бензимидазол был синтезирован из 2-(4-нитрофенил)-5-метокси бензимидазола, который был приготовлен следующим образом: 1,2-диамино-4-метоксибензол (1,26 г, 10,0 ммоль) смешивался с 4-нитробензойной кислотой (1,67 г, 9,8 ммоль), растворялся в РОСl₃ (10 мл) и нагревался для оттока в течение 2,5 часов. Реакционная смесь охлаждалась и осторожно выливалась на лед. Полученное твердое вещество фильтровалось, промывалось NаНСО₃ и использовалось без дальнейшей очистки.

2-(4-Аминофенил)-5-метокси бензимидазол был получен путем растворения 1 г вышеупомянутого нитробензимидазола в 30% Na₂S·9H₂О (20 мл) с перемешиванием при комнатной температуре в течение 21 часа. Реакционная смесь разбавлялась водой и экстрагировалась с помощью ЕtOАс. Комбинированные органические экстракты сушились на сульфате натрия и концентрировались в вакууме. Продукт определялся посредством масс-спектроскопии.

2-(4-Аминофенил)-5,6-дихлор бензимидазол был синтезирован из 2-(4-нитрофенил)-5-дихлор бензимидаэола, который был приготовлен следующим образом: 1,2 диамино-4,5-дихлорбензол (1,68 г, 10,0 ммоль) смешивался с 4-нитробензойной кислотой (1,58 г, 9,3 ммоль), растворялся в РОСl₃ (10 мл) и нагревался для оттока в течение 2,5 часов. Реакционная смесь охлаждалась и осторожно выливалась на лед. Полученное твердое вещество фильтровалось, промывалось NaHCO₃ и использовалось без дальнейшей очистки.

2-(4-Аминофенил)-5,6-дихлор бензимидазол был получен путем растворения 1 г вышеупомянутого нитробензимидазола в 30% Nа₂S·9Н₂O (20 мл) с перемешиванием при комнатной температуре в течение 21 часа. Реакционная смесь разбавлялась водой и экстрагировалась с помощью EtOAc. Комбинированные органические экстракты сушились на сульфате натрия и концентрировались в вакууме. Продукт определялся посредством масс-спектроскопии.

2-(4-Аминофенил)-7-метил бензимидазол был синтезирован из 2-(4-нитрофенил)-7-метил бензимидазола, который был приготовлен посредством смешивания 1,2-диамино-3-метилбензола (1,24 г, 10,0 ммоль) с 4-нитробензойной кислотой (1,69 г, 9,8 ммоль), растворения в РОСl₃ (10 мл) и нагревания для оттока в течение 2,5 часов. Реакционная смесь охлаждалась и осторожно выливалась на лед. Полученное твердое вещество фильтровалось, промывалось NаНСО₃ и использовалось без дальнейшей очистки.

2-(4-Аминофенил)-7-метил бензимидазол был синтезирован путем растворения 1 г вышеупомянутого нитробензимидазола в 30% Na₂S·9H₂O (20 мл) с перемешиванием при комнатной температуре в течение 4,5 часов. Реакционная смесь разбавлялась водой и экстрагировалась с помощью ЕtOАс. Комбинированные органические экстракты сушились на сульфате натрия и концентрировались в вакууме. Продукт определялся посредством масс-спектроскопии.

2-(4-Аминофенил)-6-метил бензимидазол был синтезирован из 2-(4-нитрофенил)-6-метил бензимидазола, который был приготовлен посредством смешивания 1,2-диамино-4-метилбензола (1,24 г, 9,8 ммоль) с 4-нитробензойной кислотой (1,6 г, 9,9 ммоль), растворения в РОСl₃ (10 мл) и нагревания для оттока в течение 2,5 часов. Реакционная смесь охлаждалась и осторожно выливалась на лед. Полученное твердое вещество фильтровалось, промывалось NaHCO₃ и использовалось без дальнейшей очистки.

2-(4-Аминофенил)-6-метил бензимидазол был синтезирован путем растворения 1 г вышеупомянутого нитробензимидазола в 30% Na₂S·9H₂O (20 мл) с перемешиванием при комнатной температуре в течение 4,5 часов. Реакционная смесь разбавлялась водой и экстрагировалась с помощью EtOAc. Комбинированные органические экстракты сушились на сульфате натрия и концентрировались в вакууме. Продукт определялся посредством масс-спектроскопии.

2-(4-Аминофенил)-5,6-диметил бензимидазол был синтезирован из 2-(4-нитрофенил)-5,6-диметил бензимидазола, который был приготовлен посредством смешивания 1,2-диамино-4,5-диметилбензол (1,38 г, 10,1 ммоль) с 4-нитробензойной кислотой (1,69 г, 9,9 ммоль), растворения в РОСl₃ (10 мл) и нагревания для оттока в течение 2,5 часов. Реакционная смесь охлаждалась и осторожно выливалась на лед. Полученное твердое вещество фильтровалось, промывалось NаНСО₃ и использовалось без дальнейшей очистки.

2-(4-Аминофенил)-5,6-диметил бензимидазол был синтезирован путем растворения 1 г вышеупомянутого нитробензимидазола (31,1) в 30% Na₂S·9H₂O (20 мл) с перемешиванием при комнатной температуре в течение 4,5 часов. Реакционная смесь разбавлялась водой и экстрагировалась с помощью ЕtOАс. Комбинированные органические экстракты сушились на сульфате натрия и концентрировались в вакууме. Продукт определялся посредством масс-спектроскопии.

Последующее приготовление симметричных диамидов выполнялось одним из следующих способов.

Способ А: 2-(4-аминофенил)-6-аминобензимидазол (1 ммоль) суспендировался в THF (5 мл), к которой добавлялся DIEA (2,5 ммоль), и смесь охлаждалась до -78°С. К вышеупомянутой охлажденной смеси добавлялся кислый хлорид (2,5 ммоль), и смесь оставлялась нагреваться до комнатной температуры на ночь. К реакции добавлялась вода (2 мл) и экстрагировалась с помощью EtOAc. Объединенные органические экстракты комбинированно промывались NaHCO₃ (вод.) и концентрировались при пониженном давлении. Полученный остаток очищался на силикагеле (гексаны/ЕtOАс или МеОН/СН₂Cl₂) или с помощью обратно-фазового HPLC (СН₃CN/H₂O).

Способ Б: 2-(4-аминофенил)-6-аминобензимидазол (1 ммоль) и DMAP (кат.) растворялись в пиридине (5 мл). К вышеупомянутому раствору был добавлен кислый хлорид (2,5 ммоль), и реакция перемешивалась в течение ночи при 60°С. Реакция охлаждалась до комнатной температуры, и для осаждения продукта добавлялась вода. Полученное твердое вещество собиралось путем фильтрации с промыванием твердого вещества гексанами, водой и NaHCO₃ (вод.). Полученный остаток очищался на силикагеле (гексаны/ЕtOАс или МеОН/СН₂Сl₂) или с помощью обратно-фазового HPLC (CH₃CN/H₂O).

Способ В: 2-(4-аминофенил)-6-аминобензимидазол (1 ммоль) суспендировался в THF (10 мл), к которой добавлялся К₂СО₃ (2,5 ммоль) в воде (0,5 мл), и смесь охлаждалась до -78°С. К вышеупомянутой охлажденной смеси добавлялся кислый хлорид (2,5 ммоль), и смесь оставлялась нагреваться до комнатной температуры на ночь. К реакции добавлялась вода (10 мл) и экстрагировалась с помощью ЕtOАс. Комбинированные органические экстракты комбинированно промывались NaHCO₃ (вод.) и концентрировались при пониженном давлении. Полученный остаток очищался на силикагеле (гексаны/ЕtOАс или МеОН/СН₂Сl₂ или с помощью обратно-фазового HPLC (CH₃CN/H₂O).

Способ Г: карбоксиловая кислота (2,2 ммоль), EDC (2,2 ммоль) и DMAP (кат.) растворялись в горячем пиридине. К вышеупомянутому раствору был добавлен 2-(4-аминофенил)-6-аминобензимидазол (1 ммоль), и смесь нагревалась в течение ночи до 60°С. Охлажденная реакционная смесь разделялась между водой и ЕtOАс. Органический слой промывался NaHCO₃, высушивался на Na₂SO₄ и концентрировался под вакуумом. Полученный остаток очищался на силикагеле (гексаны/ЕtOАс или MeOH/CH₂Cl₂) или с помощью обратно-фазового HPLC (СН₃СN/Н₂О).

Виды диациловых бензимидазолов

Были синтезированы и проверены на предмет своей способности подавлять IgE следующие виды, охватываемые раскрытой родовой формулой. Эти виды представлены выше в главе "Раскрытие изобретения".

Активность понижающего регулирования IgE

Все раскрытые виды были протестированы на предмет своей способности подавлять IgE как в тесте ex vivo, так и в тесте in vivo. Все они были активны в обоих тестах. Активности (IC50) видов в тесте ех vivo находились в диапазоне от приблизительно 100 пМ до 1 нМ. В тесте in vivo доза IC₅₀ находилась в пределах от приблизительно 100 мкг/кг веса тела в день до приблизительно 10 мг/кг веса тела в день. Диациловые бензимидазоловые соединения в целом были более мощными, чем моноациловые соединения.

Подавление реакции IgE

Ингибиторная активность малых молекул по настоящему изобретению была протестирована в описанных выше ех vivo и in vivo тестах. Все представленные выше соединения были активны при подавлении реакции IgE. В тесте ех vivo соединения родов I-XI давали 50%-ное ингибирование при концентрациях от 1 пМ до 10 мкМ. В тесте in vivo соединения были эффективны при концентрациях от менее чем приблизительно 0,01 до приблизительно 25 мг/кг/день, при принятии разделенными дозами (например, от двух до четырех раз в день) в течение по меньшей мере двух - семи последовательных дней. Таким образом, низкомолекулярные ингибиторы по настоящему изобретению рассматриваются как полезные при понижении вызванного антигеном повышения концентрации IgE и, следовательно, при лечении зависящих от IgE процессов, таких как аллергии в целом и аллергическая астма в частности.

Режимы лечения

Количество соединения ингибитора IgE, которое может быть эффективным при лечении частной аллергии или состояния, будет зависеть от природы нарушения и может быть определено посредством стандартных клинических методов. Точная доза, которую следует использовать в данной ситуации, также будет зависеть от выбора соединения и серьезности состояния и должна выбираться в соответствии с мнением практикующего врача и состоянием каждого пациента. Подходящие дозировки могут быть определены и скорректированы практикующим врачом на основе зависимостей реакции на дозу между уровнями IgE пациента, а также стандартными индексами легочных и гемодинамических изменений. Кроме того, специалисты поймут, что вариации дозы могут быть определены без лишних экспериментов путем следования протоколу (протоколам), рассматриваемым здесь для ex vivo и in vivo скрининга (см., например, Hasegawa et al., J. Med. Chem. 40:395-407 (1997) и Ohmori et al., Int. J. Immunopharmacol. 15:573-579 (1993); используя подобные ex vivo и in vivo тесты для определения зависимостей доза - реакция для подавления IgE производными нафталина; включенные сюда посредством ссылки).

Сначала приемлемые дозировки соединений в общем случае варьируются от приблизительно 0,001 до приблизительно 300 мг на 1 кг веса тела в день разделенными дозами, более предпочтительно между приблизительно 0,01 и 100 мг на 1 кг веса тела в день разделенными дозами. Соединения предпочтительно вводятся системно в виде фармацевтических рецептур, пригодных для таких путей, как пероральный, аэрозольный, внутривенный, подкожный, либо любым другим путем, который может быть эффективным для обеспечения системного дозирования активного соединения. Составы фармацевтических рецептур хорошо известны из уровня техники. Режим лечения предпочтительно содержит периодический прием. Более того, может быть назначена долгосрочная терапия, если оказывается, что аллергические реакции инициируются посредством продолжительного воздействия аллергена (аллергенов). Прием раз в день или дважды в день был эффективен для подавления реакции IgE на появление одного антигена у животных, если этот прием производился непрерывно в течение двух - семи последовательных дней. Таким образом, в предпочтительном выполнении соединение принимается в течение по меньшей мере двух следующих друг за другом дней с регулярными периодическими интервалами. Однако режим лечения, в том числе частота приема дозы и продолжительность лечения, могут определяться специалистом-практиком и модифицироваться так, как требуется для обеспечения оптимального понижающего регулирования IgE, в зависимости от природы аллергена, дозы, частоты и продолжительности воздействия аллергена и от стандартных клинических показателей.

В одном из выполнений настоящего изобретения подавляющее IgE соединение может приниматься в сочетании с одним или несколькими другими раскрытыми низкомолекулярными ингибиторами для выполнения оптимального понижающего регулирования реакции IgE пациента. Дополнительно предусматривается, что одно или несколько соединений по настоящему изобретению могут приниматься в сочетании с другими, уже известными или раскрытыми позже лекарствами для лечения как причины, лежащей в основе аллергии или астмы, так и их острых симптомов. Такие комбинированные терапии, предусмотренные в объеме настоящего изобретения, содержат смешивание одного или нескольких низкомолекулярных ингибиторов с одним или несколькими дополнительными ингредиентами, эффективность которых при снижении по меньшей мере одного из симптомов болезненного состояния известна. В качестве варианта раскрытые здесь низкомолекулярные ингибиторы могут приниматься отдельно от дополнительных лекарств, но в течение того же болезненного состояния, при этом и ингибитор(ы) IgE, и паллиативные соединения принимаются в соответствии со своими независимыми эффективными режимами лечения.

Диапазон активности для каждого соединения приведен в таблице.

Формула изобретения

1. Фармацевтический состав для лечения или предотвращения аллергической реакции, связанной с повышенными уровнями IgE у млекопитающего, содержащий одно или несколько следующих соединений:

где Х, Y и R означает водород;

R₁ и R₂ выбирают независимо из группы, состоящей из арила, замещенного арила, например бензила, замещенного бензила, алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, например циклопропила, замещенного циклопропила, циклобутила, замещенного циклобутила, циклопентила, замещенного циклопентила, циклогексила, замещенного циклогексила, циклогептила, замещенного циклогептила, адамантила, азот или серосодержащего гетероциклического кольца, где по меньшей мере один из радикалов R₁ и R₂ является ароматической группой, при этом R₁ и R₂ оба не могут быть фенильными группами.

2. Фармацевтический состав по п.1, в котором замещения выбирают из группы, состоящей из алкила, арила, CF₃, CH₃, OCH₃, OH, CN, COOR и СООН.

3. Фармацевтический состав по п.1, содержащий, по меньшей мере, один дополнительный ингредиент, активный при облегчении, по меньшей мере, одного симптома, связанного с упомянутой аллергической реакцией и выбираемый из группы, состоящей из короткодействующего b2-адренергического агониста, долгодействующего b2-адренергического агониста, антигистамина, ингибитора фосфодиэстеразы, антихолинергического агента, кортикостероида, ингибитора высвобождения воспалительного медиатора или антагониста лейкотриенового рецептора.

4. Фармацевтический состав по п.1, в котором соединение выбирается из группы, состоящей из

РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57