Штамм bifidobacterium longum 379-ин, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств
Владельцы патента RU 2244745:
Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм Bifidobacterium longum 379-ИН получен путем селекции без использования методов генетической модификации штамма Bifidobacterium longum B379M и отличается способностью активно утилизировать инулин. Депонирован в ГКНМ ГУ "МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Минздрава России" под №172. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на субстратах растительного происхождения и искусственных питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры. Это позволяет использовать его в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, обеспечивающих пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширение арсенала аналогичных средств. 1 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
Известен штамм Bifidobacterium longum B379M, который является наиболее близким аналогом к заявляемому штамму (Патент SU 849779). Данный штамм выделен из кишечника здорового взрослого человека, депонирован в ВНИИгенетика в ЦМПМ под №В-2000 и характеризуется следующими признаками:
1. Культурально-морфологические признаки.
Грамположительные полиморфные неподвижные палочки с бифуркацией и утолщением на одном или двух концах. Инкубация при 37,5-38°С.
В жидких питательных средах (печеночной, гидролизатно-молочной, казеиново-дрожжевой) с добавлением 0,75-1% агара растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 24 часам. Отдельные колонии имеют форму компактных, плотных зерен.
2. Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный анаэроб. Фермент каталазу не образует, желатину не разжижает, глюкозу разлагает до уксусной и L+молочной кислоты без образования газа. Ферментирует лактозу, арабинозу, ксилозу, рибозу, слабо и непостоянно - целлобиозу и инулин; слабо, в более поздние сроки - маннозу, не разлагает маннит, инулин, сорбит, инозит, салицин.
Энергичный кислотообразователь. Сквашивает молоко к 18-20 часам культивирования с образованием сгустка нежной консистенции.
Кислотообразующая активность: на печеночной среде: к 24 ч - 100-110°Т, к 72 - 150-180°Т; на ГМ-среде: до 120°Т и 240°Т соответственно.
3. Антагонистические свойства штамм проявляет в отношении шигелл Зонне, Флекснера, энтеропатогенных кишечных палочек, стафилококков.
В толстом кишечнике человека основным питательным субстратом для бифидобактерий являются углеводы растительного происхождения. Вместе с тем, как видно из представленных данных, штамм Bifidobacterium longum B379M адаптирован к субстратам на основе животных белков и углеводов, инулин разлагает слабо и непостоянно.
Вследствие этого при попадании в организм человека недостаточны его жизнеспособность, устойчивость и колонизирующая активность при прохождении пищеварительного тракта.
Задача изобретения состоит в улучшении усвоения углеводов за счет утилизации инулина из питательной среды - ценного с медицинской точки зрения углевода, имеющего широкий спектр показаний лечебного и профилактического свойства, в том числе, обладающего пребиотической активностью.
Для получения штамма Bifidobacterium longum 379-ИН была проведена селекция штамма Bifidobacterium longum B379M. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных пассажей через синтетическую питательную среду следующего состава:
на 1 литр дистиллированной воды:
Эпидермат-0 10 г
инулин 10 г
Цистеин 0,5 г
Натрий хлористый 2,5 г
Магний сернокислый 0,5 г
Натрий уксуснокислый 0,3 г
Агар-агар 0,75 г
После растворения перечисленных компонентов в среде доводили pH до 7,2-7,4, разливали по флаконам и стерилизовали при 0,5 атм в течение 30 минут.
Первичный посевной материал штамма Bifidobacterium longum B379M в объеме 5% вносили в вышеуказанную среду и культивировали при 37°С 24 часа. Далее было проведено 35 пассажей выросшей на этой среде культуры через среду того же состава, после каждого из которых производили отбор клонов по признакам максимального накопления биомассы за цикл культивирования. Если при первых пассажах получали микробный урожай не более 105 в 1 мл, то на 30-м пассаже число КОЕ бифидобактерий достигало 109 и сохранялось на таком уровне при последующих пересевах. Это объясняется повышенной продукцией инулиназы в результате длительного пассирования на среде, содержащей инулин.
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium longum 379-ИН, который депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов-представителей нормальной микрофлоры человека ГУ “МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Минздрава России” под №172.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах, в том числе, капсул, суппозиториев, мазей; биологически активных добавок к пище, заквасок, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, соков, напитков, квасов и т.д. Также штамм Bifidobacterium longum 379-ИН может найти применение в производстве гигиенических и косметических средств, например, кремов, гелей, питательных масок.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, заквасок, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, которые в качестве действующего начала пробиотической направленности содержат штамм Bifidobacterium longum 379-ИН, который обладает более высокой биологической активностью и устойчивостью к внешним воздействиям, что обеспечивает более эффективную колонизацию кишечника и восстановление резидентной микрофлоры, а также позволит расширить арсенал технических средств лечебно-профилактической направленности. Кроме того, усвоение более широкого спектра углеводов повышает как биологическую активность и устойчивость заявляемого штамма к внешним воздействиям, так и его технологичность: он накапливает биомассу не только на общепринятых производственных средах, сквашивает молоко с получением кисломолочного продукта с ценными биологическими и органолептическими свойствами, но и культивируется на питательных субстратах из дешевого натурального растительного сырья.
Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.
Культурально-морфологические: грамположительные однородные палочки, равномерно окрашиваемые метиленовой синью, расположенные преимущественно цепочками.
Физиолого-биохимические: ферментирует лактозу, инулин, целлобиозу с образованием уксусной и молочной кислот и следов муравьиной и пропионовой кислот.
Арабинозу, ксилозу, маннозу, маннит, сорбит, салицин не ферментирует. На всех принятых в производстве питательных средах растет с накоплением биомассы бифидобактерий не менее lg 8-9 микробного числа за 16-20 часов. Обладает высокой активностью кислотообразования, сквашивая молоко за 16-18 часов с образованием сгустка нежной консистенции и хорошими органолептическими свойствами. При культивировании на среде с инулином выход биомассы превосходит прототип на 4 порядка.
Данные представлены в таблице 1.
| Таблица 1. Число КОЕ в 1 мл и активная кислотность в°Т после 16-18 часов культивирования | ||||
| Питательная среда | В. longum | В379М | В. longum 379-ИН | |
| Печеночная (Блаурокка) | 5,0х108 | 100°Т | 6,1×108 | 105°T |
| Гидролизатно-молочная | 1,3х108 | 120°Т | 2,0х109 | 126°T |
| Молоко | 3,9х108 | 80°Т | 4,2х108 | 80°T |
| Эпидермат с инулином | 1,5х105 | 40°Т | 1,1x109 | 78°T |
| Водный экстракт из клубней топинамбура | 1,2х105 | 35°Т | 5,5х108 | 70°T |
Антагонистические свойства у заявляемого штамма проявляются в отношении шигелл Зонне, Флекснера, сальмонелл, энтеропатогенных кишечных палочек, стафилококка, протея.
Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм Bifidobacterium longum 379-ИН отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий не только на производственных средах и молоке, но и растительных субстратах, содержащих углеводы растительного происхождения, в частности, инулин. Это повышает функциональную ценность продуктов и препаратов, приготовленных на основе такого штамма. При попадании в организм человека культура такого штамма утилизирует больше растительных субстратов, вследствие чего более активно идет колонизация слизистых кишечника, вытеснение патогенной и гнилостной микрофлоры, более эффективно восстанавливается резидентная микрофлора.
Пример 1. Получение лиофилизированного бактерийного препарата.
К суспензии 22-24-часовой культуры бифидобактерий штамма Bifidobacterium longum 379-ИН добавляют защитную среду высушивания (сахароза 80% и желатин 8% в объеме 10-12%) и разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофильно высушивают из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит в 1 г сухой биомассы не менее 108 живых клеток бифидобактерий.
Пример 2. Использование штамма Bifidobacterium longum 379-ИН в качестве закваски для приготовления продукта лечебно-функционального питания.
Суспензию 14-16 часовой культуры штамма Bifidobacterium longum 379-ИН вносят в стерильное молоко в объеме 5% к объему молока, перемешивают и культивируют 16-18 часов до образования сгустка, после чего продукт охлаждают и сливают. В результате получают лечебно-профилактический кисломолочный продукт с содержанием бифидобактерий не менее 108 в 1 мл.
Пример 3. Получение жидкой формы биологически активной добавки к пище.
Инокулят культуры штамма Bifidobacterium longum 379-ИН в объеме 5-10% вносят в ферментер с питательной средой следующего состава в расчете на 1 литр продукта: 5-%-ный водный экстракт топинамбура, 2% гидролизата коллагена, 0,5% хлористого натрия, 0,5% экстракта шиповника, 1% пектина, 0,1% агар-агара и культивируют в течение 6-8 часов при 37,5-38°С и стерильно разливают в емкости. В результате получают биологически активную добавку к пище с содержанием бифидобактерий не менее 108 в 1 мл. Полученная добавка обладает выраженным иммунокоррегирующим действием.
Пример 4. Получение капсулированной формы биологически активной добавки к пище.
К суспензии 22-24-часовой культуры бифидобактерий штамма Bifidobacterium longum 379-ИН добавляют среду высушивания в объеме 20% и распылительно высушивают. 1 г готовой биомассы содержит не менее 108 жизнеспособных бифидобактерий.
Для капсулирования готовят смесь, в которую в равных частях входят следующие ингредиенты: высушенная биомасса бифидобактерий, лактулоза, пектин, декстрин. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 1% стеарата магния и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,3 г. Одна капсула содержит не менее 108 жизнеспособных бифидобактерий.
Пример 5. Использование штамма Bifidobacterium longum 379-ИН для получения косметических средств.
Сухую биомассу бифидобактерий штамма с содержанием бифидобактерий не менее 109 в 1 г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.
Пример 6. Использование штамма Bifidobacterium bifidum 379-ИН для приготовления сока.
Инокулят культуры штамма Bifidobacterium bifidum 379-ИН объеме 5-10% вносят в ферментер с питательной средой следующего состава в расчете на 1 литр продукта: 5-%-ный водный экстракт топинамбура, 2% гидролизата коллагена, 0,5% хлористого натрия, 0,5% экстракта шиповника, 1% пектина, 0,1% агар-агара и культивируют в течение 6-8 часов при 37,5-38°С и вносят в сок перемешивают и разливают в смеси. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 106/мл.
Пример 7. Использование штамма Bifidobacterium bifidum 379-ИН для получения гигиенических средств.
Сухую биомассу бифидобактерий штамма с содержанием бифидобактерий не менее 109 в 1 г вводят в состав зубной пасты из расчета 1 г на 100 г пасты.
Штамм Bifidobacterium longum 379-ИН ГКНМ ГУ МНИИЭМ МЗ РФ им. Г.Н.Габричевского №172, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, заквасок, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
