Штамм бактерий azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Штамм Azotobacter vinelandii ИБ 4 получен методом аналитической селекции природных изолятов по принципу отбора продуцентов, обладающих достаточно высокой антагонистической активностью по отношению к грибам-фитопатогенам. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН под номером Azotobacter vinelandii ИБ 4. Для получения препарата штамм выращивают на безазотистой питательной среде в течение 60 ч при 28-30°С с аэрацией до титра 10¹⁰ КОЕ/мл. Штамм обладает высокой нитрогеназной активностью, способностью к продуцированию цитокининов, стимулирующих рост и развитие растений. 7 табл.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей корневых гнилей пшеницы, повышает урожайность пшеницы и содержание белка в зерне. Новый штамм может быть реализован в микробиологической промышленности для получения биопрепарата для защиты от болезней и повышения урожайности и качества зерна злаковых культур.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [1]. Однако этот штамм не эффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium sp. и Helminthosporium sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [2], и Pseudomonas putida BKM В-1743Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium [3]. Недостатком известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.

Известен штамм Azotobacter chroococcum N В-3173, предназначенный для получения бактериального удобрения [4], повышающий урожайность ячменя. Недостатком является отсутствие антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Azotobacter chroococcum 92 [5], обладающий способностью подавлять рост некоторых фитопатогенных грибов. Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия и сравнительно невысокая продуктивность.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, обладающего высокими продуктивностью и нитрогеназной активностью, способностью повышать урожайность и качество зерна.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4, выделенного из образца пахотных земель, отобранного в Салаватском районе Республики Башкортостан.

Штамм хранится и поддерживается в Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН, имеет коллекционный номер Azotobacter vinelandii ИБ 4.

1. Культурально-морфологические признаки.

а. На агаризованной питательной среде (С-40), имеющей состав, г/л: КН₂РO₄ - 0,2; КНРO₄ - 0,8; CaSO₄*2Н₂O - 0,1; MgSO₄*7H₂O - 0,2; FеСl₃ - 0,01; Nа₂МоO₄ - 0,01; дрожжевой экстракт - 0,5; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; дистиллированная вода до 1000 мл, рН 7,4, культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой слизистой консистенции. На 24 часу роста клетки - мелкие палочки 0,5*0,7 мкм, слабо подвижные; на 48-72 часу - есть цисты.

b. На питательной агаризованной среде Берка, имеющий состав, г/л: К₂НРO₄ - 0,8; КН₂РO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; NaCl - 0,2; CaSO₄ - 0,1; Fe₂(MoO₄) - 0,01; глюкоза - 10 г; дистиллированная вода до 1000 мл; агар-агар - 1,5%; рН 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 1-2 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, однородной консистенции.

с. На твердой питательной среде с бензойнокислым натрием в качестве единственного источника углерода рост отсутствует. При внесении бензойнокислого натрия в среду в количестве 0,15% наблюдаются мелкие колонии 1-2 мм.

d. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: К₂НРO₄ - 0,3; СаНРO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; рН 6,8-7,0, культура образует круглые колонии диаметром 4 мм, выпуклые, с ровными краями, кремового цвета, слизистой консистенции.

е. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 5 мм, плоские, непрозрачные, цвета слоновой кости, консистенция маслянистая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста - мелкие малоподвижные палочки с тупыми концами, на 48 ч образуют цисты.

f. На питательной среде Эшби с маннитом в качестве источника углерода колонии маслянистые полупрозрачные диаметром 1-2 мм, консистенция тянущаяся. На 24-48 часу роста клетки - мелкие палочки 0,6 мкм, с закругленными концами, слабоподвижные.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°С.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, мелассу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает рамнозу, декстрин, мезоинозитол, лактозу; не усваивает: сорбит, арабинозу. Слабо растет на МПА.

Хорошо растет на среде с уксуснокислым натрием в качестве единственного источника углерода.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 1*10¹⁰ КОЕ/мл. Не погибает при нагревании при 50°С в течение 15 мин.

Штамм устойчив к ампицилину (700 мкг/мл), канамицину (400 мкг/мл). Чувствителен к римфапицину (100 мкг/мл), левомицетину (100 мкг/мл).

Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Штамм хранится на косяках со средой С-40 в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильно-высушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.

Пример 1. Для сравнения продуктивности нового штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4 с известным штаммом Azotobacter chroococcum 92 проводили выращивание в колбах на качалке при 180-200 об/мин в течение 60 часов, при температуре 28°С на жидкой питательной среде следующего состава, %: меласса - 3,0; К₂НРО₄ - 0,03; СаНРO₄ - 0,02; NaCl - 0,05; СаСО₃ - 0,5; K₂SO₄ - 0,02. Результаты приведены в табл.1 и свидетельствуют о более высокой продуктивности предлагаемого штамма над штаммом по прототипу. Высокое значение продуктивности предлагаемого штамма отмечено и при выращивании на других питательных средах, используемых при культивировании микроорганизмов рода Azotobacter (табл.2).

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4.

На чашки Петри с агаризованной средой КГА (картофель тертый - 200 г; глюкоза - 20 г; агар - 20 г; вода водопроводная - 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4. Чашки инкубируют при 28°С в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл.3 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма.

Пример 3. Новый штамм испытали в мелкоделяночном эксперименте в условиях опытного поля Института биологии УНЦ РАН на эффективность биологической защиты против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы и на повышение качества и количества урожая на пшенице сорта “Жница” с естественным уровнем заражения посевного материала. За сутки перед посевом пшеницу обрабатывали культуральной жидкостью (с титром 4*10⁹ КОЕ/мл) штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4, из расчета 1 мл культуральной жидкости на 1 кг зерна, что соответствует в среднем 3,2*10⁴ живых клеток на 1 зерно. Контрольный вариант обработали стерильной водопроводной водой. В ходе эксперимента использовались участки размером 4 м² в трехкратной повторности на каждый вариант, все повторности всех вариантов были рандомизированы между собой. В качестве эталонов брали известные коммерческие биопрепараты “Агат-25” в количестве 0,04 кг/т и “Фитоспорин” - 0,5 кг/т. Содержание белка в зерне оценивали по ГОСТ 10846-91. Результаты эксперимента приведены в табл.4 и свидетельствуют о большей эффективности нового штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4, выразившейся в усилении степени биологической защиты пшеницы от корневых гнилей, повышении ее урожайности и увеличении содержания белка в зерне.

Пример 4. Штамм Azotobacter vinelandii ИБ 4 обладает достаточно высокой нитрогеназной активностью, которую определили ацетиленовым методом. Полученные результаты приведены в табл.5, в этой же таблице приведена нитрогеназная активность и некоторых штаммов бактерий рода Azotobacter, предлагаемых для использования под различные сельскохозяйственные культуры [6-9].

Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, и характеризуются способностью индуцировать деление растительных клеток и являются наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Образование заявляемым штаммом цитокининов в количестве 118 нг в 1 мл культуральной жидкости обнаружено методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [10]. Для подтверждения наличия ростстимулирующей активности у заявляемого штамма были проведены эксперименты на растениях фасоли (примеры 6 и 7).

Пример 6. Семена фасоли сорта Харьковская белосемянная Д-45 замачивали на 3 часа в 20 мл в разбавленной культуральной жидкости штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4 с титром 10⁷ КОЕ/мл. Контрольный вариант обрабатывали в стерильной водопроводной воде. На каждый вариант брали по 12 семян фасоли. Растения выращивали 15 дней после появления первых всходов. Результаты опыта приведены в табл.6.

Пример 7. Изучали способность заявляемого штамма стимулировать образование корней у черенков фасоли. Для этого черенки 15-дневных растений фасоли ставили в воду с добавлением культуральной жидкости, полученной при ферментации на питательной среде С-40, титр полученной суспензии 10⁷ КОЕ/мл. Черенки контрольных растений помещали в стерильную водопроводную воду. Количество черенков в каждом варианте - 10, продолжительность опыта 12 дней. После окончания опыта подсчитывали образовавшиеся корни. Результаты приведены в табл.7.

Результаты экспериментов (табл.6, 7) свидетельствуют о наличии определенной ростстимулирующей активности нового штамма, выразившейся как в улучшении развития растений фасоли, так и в довольно значительной степени клубенькообразования на корнях этих растений и стимуляции образования корней на черенках.

Таким образом, выделен новый штамм Azotobacter vinelandii ИБ 4, который отличается высокой продуктивностью, широким спектром антагонистического воздействия на грибные фитопатогены. Предпосадочная бактеризация пшеницы этими микроорганизмами позволяет увеличить ее урожай и содержание белка в зерне. Штамм обладает способностью продуцировать цитокинины, проявляя при этом ростстимулирующую активность. Перечисленные полезные свойства позволяют использовать его для борьбы с грибными болезнями пшеницы и повышения ее урожайности.

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1464468, кл. А 01 N 63/00, 1988.

2. Патент США №4714614, кл. 424-93, 1987.

3. Патент RU №1805849, кл. А 01 N 63/00, 1993.

4. Авторское свидетельство СССР №1359272, кл С 05 F 11/08, 1985.

5. Авторское свидетельство СССР №922105, кл. С 05 F 11/08, 1982.

6. Патент RU №2074159, кл. С 05 F 11/08, 1997.

7. Патент RU №2074158, кл. С 05 F 11/08, 1997.

8. Патент RU №2074157, кл. С 05 F 11/08, 1997.

9. Патент RU №2076088, кл. С 05 F 11/08, 1997.

10. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кулаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов //Физиология растений. - 1990. - Т.37, Вып.1. - С.193-199.

Таблица 1
Штамм	Время ферментации, ч	Число жизнеспособных клеток (КОЕ), млрд/мл
Azotobacter vinelandii ИБ 4	60	93
Azotobacter chroococcum 92 (по прототипу)	60	2,3

Таблица 2 Титр микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4 при культивировании на различных питательных средах
Число жизнеспособных клеток (КОЕ)/мл
Питательная среда	24 ч	48 ч	60 ч
С-40	1·107	6,5·108	2,2·1011
Федорова	4·107	1·109	3·1011
Эшби	6,5·108	2,2·1011	3,3·109
КГА	2,6·108	6·109	9·1010

Таблица 3 Антагонистическое действие штаммов Azotobacter vinelandii ИБ 4 и штамма по прототипу на грибные фитопатогены
Вид фитопатогенных грибов	Диаметр зоны подавления роста гриба, мм
	Штаммы
Azotobacter chroococcum 92 (по прототипу)	Azotobacter vinelandii ИБ 4
Fusarium culmorum	-	20
Fusarium gibbosum	-	19
Fusarium graminesrum	-	15
Fusarium nivale	-	9
Fusarium semitectum	-	14
Fusarium solani	2	9
Fusarium avenaceum	-	19
Fusarium moniliforme	-	12
Bipolaris sorokiniana	4	20
Penicillium funiculosum	-	14

Таблица 5 Нитрогеназная активность предлагаемого штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4 и его аналогов
Культура	Нитрогеназная активность, Мкг N2/мл/чac
Аz ИБ 4	0,656
Az. chroococcum В 35 [6]	0,260
Az. chroococcum Ш 25 [7]	0,450
Az. chroococcum Ц 40 [8]	0,110
Az. chroococcum Б 1 [9]	0,220

Таблица 6 Результаты модельного эксперименты по изучению влияния нового штамма Az ИБ 4 на развитие растений фасоли
Вариант	Средняя высота растений, см	Средний вес корней*, г	Количество образовавшихся клубеньков, размером более 2 мм, шт
Контроль	21,81	9,60	2
Azotobacter vinelandii ИБ 4	23,95	15,60	46
* - цифры приведены по сырому весу

Таблица 7 Результаты опыта по стимуляции образования корней у черенков фасоли
Вариант	Количество погибших растений к концу опыта, %	Количество черенков, образовавших корни, шт	Суммарное количество корней на 10 черенках фасоли, шт
Контроль	8	2	17
Azotobacter vinelandii ИБ 4	1	7	93

Штамм бактерий Azotobacter vinelandii, депонированный в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером Azotobacter vinelandii ИБ 4, для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами, повышения количества и качества урожая.