Способ определения функциональной активности субкомпонентов c1r 2s2 первого компонента комплемента человека
Владельцы патента RU 2251698:
Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации" (RU)
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способу определения функциональной активности субкомпонентов C1r2s2 первого компонента комплемента человека. Сущность способа заключается в сорбировании в лунках микропланшета неспецифического иммуноглобулина G, затем последовательно в эти лунки вносят раствор, содержащий сыворотку морской свинки и этилендиаминтетраацетат натрия и после инкубации - анализируемую пробу, содержащую комплекс C1r2S2 компонента человека с неизвестной активностью и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки крови человека, полученную диализом против дистиллированной воды, а также буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния, и после инкубации проводят отмывку и осушение планшета, в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции рассчитывают активность комплекса C1r2s2. 1 табл.
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Субкомпоненты С1r и С1s, синтезируемые в организме в равных количествах и представляющие собой зимогены протеиназ, образуют прочный Са-зависимый тетрамерный комплекс С1r2s2, связанный с субкомпонентом C1q также Са-зависимым образом и формирующий с ним компонент С1. При связывании С1 с иммунным комплексом происходит активация протеиназ С1r и С1s. Активация этих ферментов - существенный этап инициации каскада активации комплемента по классическому пути, поэтому их функциональный дефицит может быть причиной различного рода патологических состояний организма.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена, Тем не менее, наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. На уровне техники не известны источники информации, касающиеся определения функциональной активности комплекса С1r2s2 субкомпонентов комплемента, пригодные для клинической практики.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность комплекса C1r2S2 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесение в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для сорбции на иммуноглобулине только субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс C1r2S2 с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при рН 5,5) в качестве источника компонентов С4, С2 и С3. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание С3b на сорбированном иммуноглобулине в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1r2S2. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3 - фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного комплекса C1r2S2 последовательно активировать компоненты С4, С2 и благодаря образованию С3 - конвертазы из активированных компонентов С4 и С2 (С4b2а), активировать с помощью последней также и С3 с образованием С3b, количество которого определяется по его количеству, связавшемуся в лунках. Тем самым достигается определение функциональной активности C1r2S2 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности комплекса C1r2S2 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов.
Пример. Определение функциональной активности препарата C1r2s2. Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Два раза отмывают планшет вероналовым буферны раствором, рН 7,4 (VBSE), содержащим 0,15 М NaCl, 50 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора VBSE и 15 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С и отмывки вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са2+ и 0,5 мМ Mg2+ (VBS2+), в лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBS2+, содержащего 15 мкл псевдоглобулиновой фракции сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при рН 5,5) и анализируемую пробу, содержащую комплекс С1r2s2 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата комплекса C1r2S2 рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение активности комплекса C1r2s2 в 6 образцах. Полученные результаты приведены в таблице 1.
| Таблица 1. Определение активности комплекса С1r2s2 иммуноферментным методом. | ||
| № образца | Активность комплекса C1r2s2 (нг/мл) | |
| в образце | определенная методом ИФА | |
| 1 | 180 | 178 |
| 2 | 160 | 157 |
| 3 | 140 | 140 |
| 4 | 50 | 43 |
| 5 | 45 | 41 |
| 6 | 35 | 35 |
| 7 | 30 | 29 |
| 8 | 25 | 26 |
| 9 | 20 | 23 |
| 10 | 18 | 18 |
| 11 | 5 | 7 |
Способ определения функциональной активности комплекса С1r2s2 комплемента человека, характеризующийся тем, что в лунках микропланшета сорбируют неспецифический иммуноглобулин G, затем вносят раствор, содержащий сыворотку морской свинки и этилендиаминтетраацетат натрия, после инкубации и осушения планшета вносят анализируемую пробу, содержащую комплекс C1r2s2 комплемента человека с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки крови человека, получаемую диализом против дистиллированной воды, а также буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния, проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности комплекса C1r2s2 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.
