Способ подавления чувства страха

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакотерапии. Млекопитающему вводят эффективную дозу 6-гидрокси-8-[4-[4-(2-пиримидинил)-пиперазинил]-бутил]-8-азаспиро[4.5]-7,9-диона или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или его гидрата. Способ расширяет арсенал лекарственных средств, используемых для подавления чувства страха. 3 табл., 6 ил.

 

Объектом данного изобретения является способ подавления чувства страха путем лечения анксиолитически эффективным количеством 6-гидрокси-8-[4-[4-(2-пиримидинил)-пиперазинил]-бутил]-8-азаспиро[4.5]-7,9-диона. Это соединение впервые было описано Jajoo, et al., Drug Metab. and Disposition. 17/6, pp.634-640, 1989, как один из нескольких метаболитов применяемого в клинике анксиолитического препарата буспирона. Строение этого метаболита было подтверждено сравнением с полученным синтетически аутентичным образцом соединения. Этот метаболит обозначен BMY 28674.

Исходное лекарственное вещество, буспирон, имеет следующую структуру:

Буспирон, химическое название 8-[4-[4-(2-пиримидинил)-1-пиперазинил]-бутил]-8-азаспиро(4,5)-декан-7,9-дион является фармацевтически активным соединением, которое, как было обнаружено, эффективно при лечении состояния тревоги (страха) и депрессии. Принято считать, что буспирон оказывает свое действие с помощью рецептора серотонина 1А (5-НТ1А). Однако, буспирон имеет высокую степень первичного обмена и, в целом, только около 4% терапевтической дозы буспирона попадает в системный кровоток в неметаболизированной форме после перорального приема (Mayol, et al., Clin. Pharmacol. Ther.. 37, р.210, 1985). Наблюдали также большие различия во всасывании буспирона между разными людьми. Это было продемонстрировано с помощью измерения максимальной концентрации лекарственного вещества в плазме больных вплоть до 10-кратного различия (Gammans, et al., American J. Med., 80, Suppl. 3B, pp.41-51, 1986).

Синтез буспирона и родственных аналогов и их психотропные свойства описаны Wu, et аl., Патент США 3717634. Применение буспирона гидрохлорида в качестве нового антифобического агента для лечения больных, страдающих неврозом, описано Casten, et аl.. Патент США 4182763.

BMY 28674 ранее испытывали на антифобические свойства с помощью лабораторных методов, специально разработанных для определения антифобических свойств азапироновых соединений, таких как буспирон, гепирон и структурные аналоги. При этих испытаниях у BMY 28674 не было обнаружено заметной антифобической активности. Для этого соединения никогда не была описана биологическая активность какого-либо типа. Действительно, за исключением 1-пиримидинилпиперазина (1-РР), никакой заметной антифобической активности не было описано для любого из известных метаболитов буспирона (см. Gammans, et al., JAMA. (March, 1986), Vol. 80, Supp. 3B, pp.43-44). Поэтому полагают, что пероральный прием дозы буспирона для лечения страха (фобий) оптимизируется, когда осуществляется таким образом, чтобы максимизировать концентрацию лекарственного вещества, не измененного при расходовании метаболитов.

В Патенте США 5431922 описан препарат буспирона пролонгированного действия как обеспечивающий преимущество при пероральном введении лекарственного вещества, так как уровни неизмененного буспирона в крови повышены, тогда как уровни метаболитов понижены, если измерять соотношением уровней буспирона и 1-РР-метаболита в плазме. Однако, для этих препаратов не было приведено никаких данных по их эффективности, не указано, выпускаются ли они промышленно.

В Патенте США 5633009 описан и заявлен трансдермальный пластырь для доставки буспирона. Как ожидалось, трансдермальная доставка надежно обеспечивала более высокие уровни бусперона в крови (AUC) при значительно уменьшенном содержании метаболитов, при измерении относительно 1-РР. Типичный пластырь был предназначен для доставки 60 мг буспирона в течение 24 часов. Неожиданно клинические испытания показали, что антифобическое действие не отличается от действия плацебо.

Позднее в Патенте США 6008222 был запатентован улучшенный способ перорального применения буспирона, при котором биодоступность неизмененного буспирона повышается, а образование метаболитов понижается. Описанный способ включал совместное введение буспирона с лекарственным веществом нефазодоном, ингибитором цитохрома Р4503А4 (CYP3A4). После оценки предварительных клинических данных не планировалось никакого дальнейшего совершенствования фармацевтического препарата на основе комбинации этих лекарственных веществ.

Короче говоря, хотя было найдено, что BMY 28674 является одним из нескольких человеческих метаболитов, образующихся в результате перорального приема анксиолитического лекарственного вещества, буспирона, ранее, до настоящего изобретения, никакой биологической активности не ассоциировали с самим соединением. В частности, никакой анксиолитической активности не было обнаружено в предыдущих испытаниях. Рекомендации по дозировкам для буспирона делались в соответствии с предположением, что ингибирование обмена буспирона (метаболизма) вызовет более сильную антифобическую реакцию. Клиническое наблюдение, что определенный процент больных, страдающих фобиями (больных с чувством страха, тревоги), не чувствовал облегчения при приеме буспирона, приписывали тому, что у этих "не отвечающих" больных не достигаются достаточные уровни исходного лекарственного препарата. Второе клиническое наблюдение - относительно семи-десятидневного латентного периода до проявления анксиолитического эффекта - относили за счет необходимости изменения динамики рецепторного сайта в результате постоянного приема буспирона. Неожиданное открытие анксиолитического действия BMY 28674 наводит на мысль о других объяснениях этих наблюдений.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Влияние BMY 28674 на индуцированную изоляцией ультразвуковую и двигательную активность молодых крыс (крысят).

Фиг.2. Влияние буспирона на индуцированную изоляцией ультразвуковую и двигательную активность крысят.

Фиг.3. Концентрации буспирона в крови человека после перорального приема буспирона.

Фиг.4. Концентрации 1-РР в крови человека после перорального приема буспирона.

Фиг.5. Концентрации BMY 28674 в крови человека после перорального приема буспирона.

Фиг.6. In vitro изучение метаболизма: метаболизм буспирона в микросомах человеческой печени с образованием BMY 28674.

Выводы и подробное описание изобретения

Авторы изобретения обнаружили, что 6-гидрокси-8-[4-[4-(2-пиримидинил)-пиперазинил]-бутил]-8-азаспиро[4.5]-7,9-дион (I) применим в качестве агента для лечения страха, и он называется в данном описании BMY 28674. Соединение имеет следующую структурную формулу:

и, как полагают, является активным метаболитом буспирона.

В результате предварительного доклинического (маломасштабного) испытания клинически применимого анксиолитического агента буспирона и нескольких из его предполагаемых и действительных метаболитов преобладает точка зрения, что анксиолитическое действие вызывается, главным образом, самим буспироном при малом (если вообще таковой существует) вкладе метаболитов буспирона. Например, системное введение (в.в. или внутрижелудочное) некоторых предполагаемых метаболитов крысам дает слабое, или не дает никакого вообще, ингибирование возбуждения нейронов дорсального (спинного) шва. Напротив, сам буспирон эффективно ингибирует возбуждение нейронов дорсального шва (см. VanderMaelen, et al., Eur. J. Pharmacol., 129, pp.123-30, 1986). Хотя один метаболит, структурный фрагмент 1-(2-пиримидинил)пиперазин, также известный как 1-РР

показал слабое ингибирование возбуждения дорсального шва, а также некоторую антифобическую активность в некоторых других доклинических испытаниях (см. Патент США 4409223), он также проявил анксиогенные свойства в других бихевиористских опытах (см. Cervo, et al., Life Sciences, 43, pp.2095-2102, 1988; Martin, Psychopharmacology, 104, pp.275-278, 1991). Возможно, биологический эффект 1-РР опосредуется с помощью альфа 2-адренергического механизма, так как 1-РР не проявляет связывания по 5-НТ1А рецептору. В настоящее время клинический эффект 1-РР неясен.

Если принять общее положение, что активным анксиолитическим агентом является сам буспирон, то в настоящее время инструкции по дозировке даются в соответствии с максимизацией в крови страдающих фобиями больных уровней неизмененного буспирона. У больных, у которых ингибирован метаболизм буспирона, что связано либо с уровнями печеночной ферментативной активности больного, либо с приемом веществ, которые оказывают ингибирующее действие на печеночный метаболизм, в частности CYP3A4; больным советовали уменьшить количество принимаемого буспирона. Интересно, что не было установлено специфической корреляции побочных эффектов с более высоким уровнем буспирона в крови. С открытием данного активного метаболита (по изобретению) характер этих указаний по дозировке следует изменить применительно к условиям, способствующим предпочтительному ферментативному образованию BMY 28674. В действительности дозу буспирона следует повысить, а не понизить, у больных с ингибированным обменом буспирона.

Другая широко распространенная гипотеза связана с тем, что буспирон не ослабляет чувства тревоги у определенного процента больных. Это отсутствие эффекта относили за счет недостаточного уровня неизмененного буспирона в крови "нереагирующих" пациентов, даже насмотря на то, что уровни буспирона в крови всех больных очень низкие. Научное подтверждение этого объяснения неудачи при лечении отсутствует. Альтернативное объяснение явствует из открытия активного метаболита BMY 28674 и его анксиолитического действия. Более правдоподобно неудачное лечение некоторых больных объясняется на основании соотношения анксиолитической эффективности и уровня BMY 28674 в крови. "Нереагирующими" оказываются те больные, у которых при обмене превращение буспирона в BMY 28674 недостаточно для достижения эффективного уровня BMY 28674. Этому объяснению соответствует широкий разброс уровней буспирона в крови, наблюдаемый как у одного и того же больного, так и у различных больных, после перорального приема. Эта вариабельность может являться результатом известных колебаний уровней активности обмена в печени человека в течение дня. Однако, так как уровни самого буспирона в крови очень низки, различия между уровнями буспирона в крови обычно малы по сравнению с различиями между уровнями более распространенных метаболитов в крови.

Аналогично, латентный период до проявления анксиолитического действия после начала лечения буспироном может охватывать время, требуемое для аккумуляции метаболита, а также для "перерегуляции" динамики рецепторного сайта. Обычно зависимость анксиолитического действия от появления метаболита BMY 28674 хорошо коррелируется с клиническими наблюдениями над больными, испытывающими чувство страха, получающими перорально буспирон.

Исходя из того, что интактный буспирон обеспечивает полезную антифобическую активность, наблюдаемую в клинике, была разработана система доставки в виде трансдермального пластыря (см. Патент США 5633009). Предполагалось, что трансдермальный пластырь с буспироном является лучшим средством для (лечения) снятия страха, так как трансдермальная система доставки лекарственного препарата дает минимальный метаболизм буспирона, тем самым обеспечивается большее количество исходного лекарственного вещества при значительно пониженных уровнях метаболитов. Неожиданно при применении в клинике трансдермального пластыря с буспироном наблюдали низкую анксиолитическую активность или совсем ее не наблюдали. Этот неожиданный результат привел к переоценке метаболитов буспирона и к открытию сильного антифобического действия BMY 28674.

Нижеследующая схема метаболизма (Схема 1) буспирона взята из Jajoo, et al., Xenobiotica. 1990, Vol. 20, No. 8, pp.779-786, "In vitro metabolism of the antianxiety drug buspirone as a predictor of its metabolism in vivo". ("In vitro метаболизм лекарственного вещества против страха буспирона как прогноз его метаболизма in vivo").

Схема 1

Схема метаболизма буспирона в микросомах и гепатоцитах печени крыс

Новая работа началась с оценки рецепторного связывания метаболитов буспирона. Соответственно, in vitro активность буспирона (Bu; MJ 9022) и его метаболитов 1-РР (BMY 13653), 3'-ОН-буспирона (BMY 14295), 5-ОН-буспирона (BMY 14131) и 6'-ОН-буспирона (BMY 28674) оценивали по его активности относительно человеческого 5-НТ1А рецептора. Результаты этих экспериментов представлены в Таблице 1.

Таблица 1
Соединение	IC50 [нМ]	STDEV	Кi величина	N
8-OH-DPAT (эталон)	2,5	0,9	1	8
Буспирон (MJ 9022)	30	18	15	8
6-ОН-буспирон (BMY 28674)	114	85	57	7
5-ОН-буспирон (BMY 14131)	928	176	464	7
3-ОН-буспирон (BMY 14295)	652	402	326	7
1-РР (BMY 13653)	>1000	-	-	3

Как можно видеть, в Таблице 1 суммировано новое in vitro действие MJ 9022 (буспирон) и его метаболитов BMY 13653 (1-РР), BMY 14131 (5-ОН-буспирон), BMY 14295 (3-ОН-буспирон) и BMY 28674 (6-ОН-буспирон) на человеческий 1А рецептор серотонина (5-НТ1А). Буспирон проявляет высокое сродство к человеческому 5-НТ1А-рецептору (К_i=15 нМ). BMY 28674 имеет связывающее сродство, приближающееся к сродству буспирона (К_i=57 нМ). Другие проверяемые метаболиты имеют относительно слабое сродство к человеческому 5-НТ1А-рецептору по сравнению с буспироном.

BMY 28674, по-видимому, является активным метаболитом буспирона. Не только вторым наиболее часто встречающимся метаболитом, образующимся при исследованиях обмена из человеческой мочи (5-гидрокси-РР является наиболее распространенным)

но, что более важно, уровни BMY 28674 в крови человека примерно в 40 раз выше, чем уровни буспирона в крови, и в несколько раз выше, чем уровни 1-РР в крови. Также имеет значение тот факт, что скелетная структура буспирона остается интактной в BMY 28674. Кроме того, данные связывания по 5-НТ1А рецептору указывают, что BMY 28674 имеет более близкое к буспирону связывающее сродство, в противоположность другим метаболитам, которые проявляют только более слабое взаимодействие по 5-НT1A сайту. В настоящее время 5-НТ1А рецептор понимается как серотонинергический рецептор, тесно вовлеченный в регуляцию страха. Основное внимание данного исследования сосредоточено на метаболитах буспирона, которые сохраняют скелетную структуру буспирона и содержат в молекуле не более одной гидрофильной гидроксигруппы. Наличие более чем одной гидрофильной гидроксигруппы, по-видимому, уменьшает распространение и транспорт таких полигидроксильных продуктов метаболизма в CNS-области организма, тем самым делая маловероятным необходимые рецепторные взаимодействия в нацеленных областях.

Ранее в in-house испытаниях функциональных свойств BMY 28674 использовали in vivo тест, являющийся модификацией конфликт-реакции Фогеля (Vogel), простой надежной конфликт-методики для испытания подавляющих страх агентов (веществ против страха) (см. Vogel, et al., Psychopharmacologia. (Berl.) 21, pp.1-7, 1971). Однако, BMY 28674 не дает реакции подавления страха в тесте Фогеля. Ранее у BMY 28674 не замечали никакой полезной антифобической активности.

Ультразвуковые колебания, испускаемые детенышами крыс после того, как их отделяли от матерей и от помета и подвергали различному воздействию окружающей среды (например, действию низкой температуры), как оказалось, являются чувствительным способом для оценки потенциальных анксиолитических и анксиогенных соединений (Winslow and Insel, 1991, Psychopharmacologia. 105:513-520). Психоактивные соединения, предполагаемые анксиолитики, подавляют частоту ультразвуковых сигналов, в то время как сигналы увеличиваются при действии лекарственных веществ с анксиогенными свойствами. Более важно, что вызываемые изоляцией ультразвуковые изменения, по-видимому, являются наиболее чувствительными для обнаружения анксиолитических свойств в широком спектре классов лекарственных веществ, таких как бензодиазепины, 5-НТ ингибиторы повторного всасывания, агонисты 5-НТ1А, а также антагонисты NMDA. В настоящем исследовании 6-гидроксилированный метаболит буспирона, BMY 28674, обладающий сродством к человеческому 5-НT1A рецептору (К_i=57 нМ), оценивают на потенциальную анксиолитическую активность на детенышах крыс в возрасте 9-11 дней, которых отбирают у матерей, отделяют от помета и помещают на холодную (18-20°С) плашку с целью "выявления" вызванных стрессом ультразвуковых сигналов (Фиг.1). На Фиг.2 показаны результаты, полученные в этом тесте для буспирона.

Введение BMY 28674 (0,03-1 мг/кг, sc; Фиг.1) за 30 мин до испытания дает зависящее от дозы подавление ультразвукового сигнала детеныша крысы на холодной плашке [F(4,45)=19,27, p=0,0001]. Доза BMY 28674, прогнозируемо снижающая число сигналов на 50% (ID₅₀), составляет 0,13 мг/кг. Двигательная активность также значительно снижается после введения BMY 28674 [F(4,45)=5,85, р=0,007]. Однако, доза ID₅₀ (0,41 мг/кг) BMY 28674, которая, по оценкам, снижает двигательную активность, примерно в 3 раза выше, чем доза ID₅₀ (0,13 мг/кг) для подавления ультразвуковых сигналов, что наводит на мысль, что, подобно буспирону анксиолитические свойства BMY 28674 проявляются при более низких дозах.

Введение буспирона (0,03-1 мг/кг, sc; Фиг.2) за 30 мин до тестирования дает зависящее от дозы подавление ультразвукового сигнала детеныша крысы на холодной плашке [F(4,42)=15,44, р=0,0001]. Прогнозируемая доза буспирона, снижающая число сигналов на 50% (ID₅₀), составляла 0,10 мг/кг. Двигательная активность также ослаблялась [F(4,42)=4,343, p=0,005] при дозах, примерно в 5 раз более высоких, чем дозы, подавляющие ультразвуковые сигналы.

Полученные результаты демонстрируют, что, подобно буспирону, метаболит BMY 28674 проявляет анксиолитикоподобную активность на ультразвуковом сигнале модели страха, возникающего у изолированного детеныша крысы. Анксиолитическая активность, обусловленная BMY 28674, проявляется при дозах, значительно более низких, чем доза, требуемая для подавления двигательной активности. Короче говоря, вышеприведенные in vitro и in vivo тесты демонстрируют положительные результаты успокаивающего теста как для буспирона, так и для BMY 28674; однако, уровни концентраций буспирона в крови после перорального приема человеком малы. До настоящей работы никакой информации относительно уровней концентраций BMY 28674 в клинической крови не было.

Проводились фармакокинетические исследования на человеке и они дали поразительные результаты, дополнительно подтверждающие роль BMY 28674 как активного анксиолитического метаболита.

Испытуемым людям (n=13) давали перорально буспирон в течение 25 дней с суммарной дозой 10-60 мг. Эту дозу делят на пять раз и дают с 5-дневными интервалами, с повышением ВID дозы в каждом интервале. Фармакокинетические измерения проводят на 5-й день каждого интервала и эти данные были использованы для оценки фармакокинетики буспирона, 1-РР и BMY 28674. Схема приема человеком показана в Таблице 2.

Таблица 2
Интервал в схеме применения	Буспирон BID доза (мг)	Измерение РК (День исследования)
1	5	5
2	7,5	10
3	15	15
4	20	20
5	30	25

Эти многократные дозы перорально принимаемого буспирона в виде пяти различных доз, как было обнаружено, являются безопасными и обычно хорошо переносятся здоровыми взрослыми пациентами, участвующими в 25-дневном исследовании.

На Фиг.3, 4 и 5 показаны средние концентрации в крови буспирона, 1-РР и BMY 28674, соответственно, через 12 часов после приема дозы в последний день каждого интервала. Уровни буспирона (Фиг.3), в целом, очень низки (около 1-2 нг/мл при более высоких дозах) и падают до менее чем 1 нг/мл через два часа после дозы. Напротив, уровни 1-РР (Фиг.4) и BMY 28674 (Фиг.5) значительно выше и пролонгированность (выделения) действия сравнимо с буспироном. Концентрации BMY 28674 в несколько раз выше чем концентрации 1-РР, и, примерно, в 30-40 раз выше чем концентрации буспирона.

До настоящего времени исследования показывают, что после перорального приема буспирона уровни метаболита BMY 28674 в крови практически (в основном) сравнимы с наблюдаемыми незначительными уровнями буспирона в крови. Хотя было показано, что сам буспирон проявляет анксиолитические свойства в испытуемых моделях, таких как детеныши крысы USV, представленные в данном описании, низкие концентрации в крови, наблюдаемые у человека, приводят к заключению, что именно распространенный метаболит BMY 28674 опосредует наблюдаемый клинически успокаивающий эффект. До настоящей оценки метаболитов буспирона относительная распространенность BMY 28674 у человека после перорального приема буспирона не была известна.

Хотя очевидно, что для получения анксиолитического эффекта можно вводить сам BMY 28674, пероральный прием его предшественника, буспирона, сделанный в определенных условиях, может также представлять собой улучшенный способ введения BMY 28674 в организм (систему) беспокойного человека. Для того чтобы определить это состояние, были проведены in vitro эксперименты по метаболизму с целью получения обмена буспирона в микросомах печени человека (HLM). Выбирают многочисленные препараты HLM исходя из их CYP3A4-ферментативной активности. Препараты HLM получают от Gentest Corporation (Woburn, МА: Catalog NN НO23, НO70, НO93 и H112), их характеризуют с помощью стандартных методик. Помимо определения потери исходного соединения при инкубациях определяют также уровни метаболита BMY 28674.

В первой стадии экспериментов определяют корреляцию, изображенную на Фиг.6, между специфической активностью CYP3A4 в препаратах HLM и метаболизмом буспирона и продукцию метаболита. ¹⁴С-буспирон с одинаковой концентрацией (10 мкм) термостатируют с пятью HLM-препаратами из печени пяти доноров. В течение 15 минут инкубируют с 0,5 мг/мл микросомного белка и используют NADPH-генерирующую систему. Уровни ¹⁴С-буспирона и BMY 28674 в инкубированных образцах определяют обращенно-фазовой ВЭЖХ, применяя для обнаружения радиоактивности режим он-лайн, и сравнением с аутентичными стандартами. ¹⁴С регенерируют количественно. На Фиг.6 показано отношение концентраций BMY 28674 и буспирона в сравнении с CYP3A4 специфической активностью, измеренной в HLM-препаратах печени от пяти доноров (среднее из двух различных определений). Эти результаты показывают, что соотношение BMY 28674 к буспирону повышается по мере того, как СYР3А4-специфическая активность в HLM повышается. Изменение в соотношении по мере повышения СYР3А4-активности отмечается как повышением уровней BMY 28674, так и понижением концентрации буспирона (результаты не показаны).

Вторую серию инкубации проводят с целью определения потенциального ингибитора CYP3A4, меняя соотношение BMY 28674 к буспирону при HLM-инкубациях. Одинаковую концентрацию ¹⁴С-буспирона (10 мкм) инкубируют с объединенными HLM (объединенные путем соединения равных объемов из печени пяти вышеуказанных доноров). Кетоконазол, хорошо описанный ингибитор CYP3A4, добавляют к инкубируемым образцам с различной концентрацией. Все другие условия инкубации, а также анализ образцов описаны выше. В отсутствие кетоконазола после 15-минутной инкубации буспирона с объединенным HLM отношение BMY 28674 к буспирону составляет 0,42 (Таблица 3). Никакого влияния на метаболизм буспирона не отмечается при концентрациях кетоконазола вплоть до 0,125 мкМ. При 0,25 мкМ кетоконазола отношение 6'-гидроксибуспирона к буспирону понижается до 0,32. При более высоких концентрациях 1,25 мкМ и 2,5 мкМ отношение BMY 28674 к буспирону падает далее до 0,06 и 0,01, соответственно. Эти результаты показывают, что когда кетоконазол совместно инкубируют с буспироном в объединенных HLM, соотношение BMY 28674 и буспирона понижается по мере увеличения концентрации CYP3A4 ингибитора, кетоконазола. Изменение соотношения по мере увеличения концентрации кетоконазола отличается как понижением уровней BMY 28674, так и повышением концентраций неизмененного буспирона.

Таблица 3 Ингибирование метаболизма буспирона с помощью кетоконазола
[кетоконазол]	[буспирон]	[BMY 28674]	[BMY 28674/ буспирон]
(мкМ)	Относительное СРМ	(Отношение)
0	20054	8400	0,42
0,025	18645	7884	0,42
0,125	19648	8201	0,42
0,25	21957	7052	0,32
1,25	36117	2111	0,06
2,5	43712	576	0,01

Таким образои, эти in vitro эксперименты показывают зависимость как метаболизма буспирона, так и появления метаболита BMY 28674 от активности CYP3A4 в печени человека.

Целью данного изобретения является создание улучшенного (усовершенствованного) способа выявления анксиолитической реакции у больных, испытывающих чувство тревоги. Этой цели достигают, обеспечивая анксиолитические уровни BMY 28674 в крови больных, испытывающих чувство тревоги. Наиболее очевидным способом достижения этой цели является системное применение больным самого BMY 28674. Следовательно, один аспект данного изобретения относится к способу снятия состояния тревоги у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, с помощью системного применения эффективной седативной дозы BMY 28674.

Эффективная доза должна, как правило, создавать минимальные концентрации (CMIN) BMY 28674 в крови, которые составляют, по меньшей мере, 1-2 нг/мл. Обычно момент измерения уровней CMIN - это спустя 12 часов после приема дозы, т.е. непосредственно перед следующей ВID-дозой. BMY 28674 можно вводить различными способами, включая, без ограничения, пероральный, подъязычный, трансназальный или парентеральный, например внутримышечный, внутривенный, подкожный и т.п.

В целях терапии BMY 28674 можно давать одним из этих способов в виде препарата, содержащего эффективное анксиолитическое количество BMY 28674, или одной из его фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты или гидрата в фармацевтически приемлемом носителе. Фармацевтические композиции, обеспечивающие от 5 до 50 мг активного ингредиента на стандартную дозу, являются предпочтительными и могут быть обычно приготовлены в виде водных растворов и водных или масляных суспензий. BMY 28674 можно также давать перорально, если приготовить в виде пероральной лекарственной формы, такой как таблетка, лепешка, капсула, сироп, эликсир, водный раствор или суспензия.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот к BMY 28674 также рассматриваются как применимые в качестве анксиолитических агентов. По определению такими солями являются соли, в которых анион не вносит заметный вклад в токсичность или фармакологическую активность основной формы BMY 28674.

Соли присоединения кислот получают либо реакцией BMY 28674 с органической или неорганической кислотой, предпочтительно, при контактировании в растворе, либо любым стандартным способом, подробно описанным в литературе и доступным любому практику-специалисту в данной области техники. Примерами применимых органических кислот являются карбоновые кислоты, такие как малеиновая кислота, уксусная кислота, винная кислота, пропионовая кислота, фумаровая кислота, изэтионовая кислота, янтарная кислота, памовая кислота и т.п.; применимыми неорганическими кислотами являются галоидводородные кислоты, такие как НСl, НВr, HI; серная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Предпочтительными пероральными композициями являются композиции в виде таблеток или капсул, и помимо BMY 28674 они могут содержать обычные эксципиенты, такие как связующие (например, сироп, аравийскую камедь, желатин, сорбит, трагакант или поливинилпирролидон), наполнители (например, лактозу, сахар, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин), смазки (например, стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль или двуокись кремния), вещества, способствующие измельчению (например, крахмал) и поверхностно-активные агенты (например, лаурилсульфат натрия). Растворы или суспензии BMY 28674 с обычными фармацевтическими носителями применяют для парентеральных композиций, таких как водный раствор для внутривенной инъекции или масляная суспензия для внутримышечной инъекции. Такие композиции, имеющие нужную прозрачность, стабильность и адаптивность к парентеральному применению, получают, растворяя 0,1-10 вес.% активного ингредиента (BMY 28674 или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или его гидрата в воде или в носителе, содержащем многоатомный алифатический спирт, такой как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоли, или их смеси. Полиэтиленгликоли содержат смесь нелетучих, обычно жидких полиэтиленгликолей, растворимых как в воде, так и в органических жидкостях и имеющих молекулярную массу около 200-1500.

BMY 28674 можно синтезировать способами, хорошо описанными в химической литературе и известными специалисту в области синтетической органической химии. Один способ получения использует буспирон в качестве исходного вещества, это способ изображен на Схеме 2.

Схема 2

Получение BMY 28674

Этот способ получения предлагается в качестве полезного примера и иллюстрирует удобный синтез BMY 28674.

Следует также принять во внимание, что BMY 28674 можно получать ферментативным (микросомы печени человека или крысы) превращением буспирона in vitro (см. Jajoo, et al., Xenobiotica. 1990, Vol. 20, No. 8, pp.779-786).

Системное введение можно также реализовать вторым способом, с помощью которого достигаются эффективные анксиолитические уровни BMY 28674 в крови, а именно пероральным введением предшественника BMY 28674. Такие пролекарственные формы следует вводить в количестве, которое вызывает эффективное анксиолитическое действие, не давая вредного или ненужного побочного действия. То есть, системное применение BMY 28674 можно осуществлять, вводя млекопитающим перорально предшественник или пролекарственную форму BMY 28674, например, буспирон.

Однако этот способ системного введения BMY 28674 улучшен по сравнению с известным стандартным способом перорального применения буспирона и отличается от него. Пролекарство буспирон применяют в улучшенном способе осуществления анксиолиза по данному изобретению. Следовательно, другой аспект данного изобретения направлен на ослабление (снятие) чувства тревоги у млекопитающего с помощью улучшенного способа перорального применения буспирона. Улучшение (усовершенствование) включает пероральное введение буспирона таким образом, что предпочтительным является метаболическое продуцирование BMY 28674, тем самым обеспечивается анксиолитически эффективное количество BMY 28674 у больного. Это противоречит принятым в настоящее время методам введения, которые направлены на максимизацию уровней неизмененного буспирона в крови. В качестве примера: ранее в рекомендациях по дозировке указывалось, что если буспирон вводят в условиях, благоприятствующих ингибированию его метаболизма, т.е., когда в результате получают более высокие уровни неизмененного буспирона и более низкие уровни метаболита, дозу буспирона следует понизить. Улучшенный метод является прямо противоположным предыдущему методу перорального введения буспирона. Вместо понижения дозы буспирона, когда его метаболизм ингибируется, дозу буспирона следует повысить, чтобы достичь пригодных уровней BMY 28674. Нет конкретной корреляции между серьезными побочными эффектами и приемом повышенных количеств буспирона.

Резюмируя, можно сказать, что второй аспект настоящего изобретения относится к улучшенному способу ослабления нежелательного тревожного состояния у млекопитающего с помощью перорального применения буспирона или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты таким способом, который благоприятствует метаболическому продуцированию BMY 28674 у млекопитающего. В целом следует принимать такое количество буспирона (в виде дозы), которое даст в результате минимальную концентрацию (CMIN) BMY 28674 в крови 1-2 нг/мл. Определение CMIN у больных обычно делают через 12 часов после введения дозы лекарственного вещества и непосредственно перед следующей дозой.

Примером одного из факторов, влияющих на метаболическое образование BMY 28674, является влияние пищи на пероральный прием дозы буспирона. Согласно вкладышу в упаковке BUSPAR^T (пероральные таблетки буспирон НСl) высказано предположение, что при приеме буспирона вместе с пищей увеличивается концентрация неизмененного буспирона в плазме.

Второй пример модификации приема доз, предлагаемой во вкладыше в упаковке BUSPAR^T, - это рекомендация понижения дозы буспирона, если ее дают в комбинации с ингибитором CYP3A4.

С точки зрения улучшенного способа ослабления нежелательного состояния тревоги с помощью перорального введения буспирона по этому улучшенному методу по данному изобретению рекомендуется прямо противоположное тому, что предлагается в приведенных примерах. Вместо приема дозы лекарственного вещества во время еды рекомендуется принимать его примерно за два часа или более до еды или спустя два часа или более после еды. Аналогично, в случае слабого действия цитохрома Р450 ЗА4 (CYP3A4) дозу буспирона следует повысить, а не понизить, как рекомендуется листовкой-вкладышем в упаковке BUSPAR^T.

Другие изменения в применении препарата, предлагаемые для улучшения анксиолитического метода системного введения BMY 28674 с помощью перорального приема буспирона, включают следующие:

- Буспирон следует вводить перорально в соответствии с дневными периодами максимальной СYР3А4-активности у млекопитающего.

- Прекратить прием сопутствующих медицинских препаратов или пищевых продуктов, которые ингибируют активность CYP3A4.

- Увеличить дозу буспирона для корректировки пониженной СYР3А4-активности, если прекращение приема сопутствующего (одновременного) лекарственного препарата, который ингибирует цитохромную активность, с медицинской точки зрения нецелесообразно.

В общем пероральный прием буспирона пациентом в состоянии страха (тревоги) модифицируется таким образом и в такой степени в соответствии с полезной медицинской практикой, чтобы метаболическое образование BMY 28674 было предпочтительным. В согласии с надежной практикой предпочтительно вводить BMY 28674 или предшественник в таких концентрациях, которые вызывают анксиолитический эффект, не давая вредных или ненужных побочных эффектов.

Описание конкретных вариантов изобретения

Соединение, применение которого составляет сущность данного изобретения, и способ его получения можно понять лучше в свете следующих примеров, которые даны только с целью иллюстрации, но не для ограничения области применения и объема.

ПРИМЕР 1

Получение BMY 28674 (I)

А. Ди-4-нитробензилпероксидикарбонат(III)

Ди-4-нитробензилпероксидикарбонат получают, используя модификацию литературной методики (F.Strain, et al., J.Am.Chem.Soc., 1950. 72, 1254). Так, к охлажденному льдом раствору 4-нитробензилхлороформата (10,11 г, 4,7 ммол) в ацетоне (20 мл) добавляют по каплям в течение 30 минут охлажденную льдом смесь 30% H₂O₂ (2,7 мл, 24 ммол) и 2,35 N NaOH (20 мл, 47 ммол). Смесь энергично перемешивают в течение 15 минут и затем ее фильтруют, а осадок на фильтре промывают водой и затем гексаном. Полученное сырое твердое вещество растворяют в хлористом метилене, раствор сушат (Na₂SO₄) и затем его разбавляют равным объемом гексана. Концентрирование этого раствора при 20°С в роторном испарителе дает кристаллический остаток, который фильтруют, промывают гексаном и сушат в вакууме с получением соединения III (6,82 г, 74%) в виде светло-желтого микрокристаллического вещества, т. пл. 104°С (разл.).

Найдено, что ди-4-нитробензилпероксидикарбонат относительно стабилен, разлагается при Т. плавления со слабым выделением газа. Для сравнения: дибензилпероксидикарбонат (Cf. M.P. Gore, J.C. Vederas, J.Org.Chem., 1986, 51, 3700) разлагается с внезапным энергичным выбросом вещества из капилляра для определения т.пл.

В. 6-(4-Нитробензилпероксикарбонатил)-8-[4-[4-(2-пиримидинил)-пиперазинил]-бутил]-8-азаспиро[4.5]-7.9-дион (II)

К раствору 8-[4-[4-(2-пиримидинил)-пиперазинил]-бутил]-8-азаспиро[4.5]-7,9-диона (буспирон: 10 г, 26 ммол) в сухом ТГФ (250 мл) добавляют LiN(Me₃Si)₂ (28,5 мл 1 М раствора в ТГФ) при -78°С и перемешивают в течение 3 час, затем добавляют по каплям в течение 1 часа раствор ди-4-нитробензилпероксикарбоната (11,2 г) в сухом ТГФ (150 мл). Перемешивание при -78°С продолжают в течение 1 часа.

Удаляют охлаждающую баню и реакционный раствор выливают в смесь Н₂О и EtOAc. Органическую фазу отделяют и промывают водой, а затем рассолом. Органическую фазу сушат и затем упаривают с получением вязкого масла. Флеш-хроматография этого масла элюированием с колонки с силикагелем смесью MeCN-EtOAc (1:2) дает сырой продукт, который промывают ацетоном, чтобы удалить непрореагировавший буспирон, и получают 6,23 г белого твердого вещества (46%), продукт (II).

С. 6-Гидрокси-8-[4-[4-(2-пиримидинил)-пиперазинил]-бутил-8-азаспиро [4.5]-7,9-дион (I; BMY 28674)

Смесь II (4,0 г, 6,9 ммол) и 10% Pd/C (около 1 г) в МеОН (100 мл) гидрируют в вибраторе Парра при 276-310 кПа в течение 1 часа. Гидрированную смесь фильтруют через слой цеолита, который затем промывают EtOAc. Фильтрат упаривают до смолы, которую очищают флеш-хроматографией, используя колонку с силикагелем и элюируя EtOAc, с получением 0,41 г грязно-белого твердого вещества (I).

Анализ. Вычислено для С₂₁Н₃₁N₅О₃: С, 62,82; Н, 7,78; N, 17,44.

Найдено: С, 62,84; Н, 7,81; N, 13,33.

ПРИМЕР 2

Анализ 5-НТ1А-рецепторного связывания

Мембраны для связывания готовят, используя человеческий 5-НТ1А-рецептор, экспрессирующий в НЕК293-клетках. Клетки собирают и разрушают с помощью гомогенизатора Даунса. Клетки центрифугируют при 18000xg 10 минут и осадок снова суспендируют в буфере для анализа, замороженном в жидком азоте и хранящемся при -80°С до (дня) анализа.

На лунку берут всего 30 мкг белка. Анализ проводят в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Буфер для анализа представляет собой 50 мМ HEPES, содержащий 2,5 мМ MgCl₂ и 2 мМ EGTA. Препарат мембраны инкубируют при 25°С в течение 60 минут с 0,1-1000 нМ испытуемого соединения и 1 нМ 3Н-8-ОН-DPAT. 10 мМ Серотонина служит в качестве блокирующего агента для определения неспецифического связывания. Реакцию прекращают, добавляя 1 мл охлаждаемого льдом 50 мМ HEPES-буфера, и быстро фильтруют через харвестер клеток Брэндела (Brandel), используя фильтры Ватман (Whatman) GF/B. Осадки на фильтрах считают с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика LKB Trilux. Значения IC₅₀ определяют, используя нелинейную регрессию, методом Excel.

ПРИМЕР 3. Анализ ультразвуковых сигналов, индуцированных изоляцией детеныша крысы

Детенышей крыс Harlan Sprague-Dawley (самцы и самки) помещают в клетки из поликарбоната с маткой до 9-11-дневного возраста. За 30 минут до испытания крысят отнимают от матки, помещают в новую клетку со своей маленькой подстилкой, приносят в лабораторию и помещают под лампу (свет), чтобы поддерживать температуру тела при 37°С. Затем детенышей взвешивают, метят и возвращают к помету до оценки поведения (бихевиористкой оценки). Испытание проводят в регистрационной камере из плексигласа, в которой имеется металлическая пластина, поддерживаемая при 18-20°С, с сеткой 5×5 см, помещенной на пластине. Для регистрации ультразвуковых сигналов на высоте 10 см над пластиной подвешивают микрофон. Ультразвуковые сигналы регистрируют с помощью системы Noldus UltraVox, обеспечивающей анализ частоты и длительности сигналов в (он-лайн) оперативном режиме. Число ячеек решетки, в которые входит детеныш, также суммируют путем визуальной оценки. Детенышей, которые не издают, по меньшей мере, 60 сигналов за 5-минутный период перед испытанием, исключают из фармакологической оценки. Немедленно после сбора базовых данных детенышам инъецируют носитель или лекарственный препарат подкожно в загривок (в шейном отделе) и возвращают к собратьям по помету. Через тридцать минут детенышей опять тестируют с помощью соответствующих характеристик (ультразвуковые сигналы и пересечения клеток решетки) для оценки действия лекарственного вещества. Если иначе не указано, каждого детеныша используют только один раз. Отклонение от базовой линии (изменение) и изменение в процентах по сравнению с базовой линией частоты ультразвуковых сигналов и пересечений решетки анализируют односторонним методом ANOVA. Для точной оценки действия лекарственного вещества осуществляют Bonferroni/Dunn post hoc сравнения с носителем в качестве контроля. Для оценки дозы (миллиграммы на килограмм) каждого прогнозируемого агониста, ингибирующей индуцированные изоляцией ультразвуковые сигналы на 50% (ID₅₀), применяют log-пробит-анализ. Все сравнения проводят с экспериментальным коэффициентом ошибок (α) типа I 0,05.

Дозы каждого препарата устанавливают в произвольном (иррегулярном) порядке нескольким пометам. BMY 28674 и буспирон растворяют в физиологическом растворе (0,9% NaCl, носитель). Все инъекции делают подкожно в объеме 10 мл/кг. Дозы препарата относятся к весу соли.

ПРИМЕР 4. Изучение метаболизма in vitro: Превращение буспирона в BMY 28674

- Выбирают 5 донорских препаратов HLM на основании их CYP3A4 цитохром Р450-ферментативной активности.

- ¹⁴С-буспирон (10 мкМ) инкубируют с пятью препаратами HLM печени пяти доноров (15 минут с 0,5 мг/мл микросомного белка).

- Уровни ¹⁴С-буспирона и BMY 28674 в инкубационных образцах определяют обращенно-фазовой ВЭЖХ, используя оперативное обнаружение радиоактивности и сравнение с аутентичными стандартами.

- Вторую серию инкубаций проводят для определения возможности кетоконазола (ингибитора CYP3A4) изменить соотношение BMY 28674 к BUSPAR^I при инкубациях HLM.

- ¹⁴С-буспирон (10 мкМ) инкубируют с объединенным HLM (15 минут с 0,5 мг/мл микросомного белка).

Способ подавления чувства страха у млекопитающего, заключающийся во введении млекопитающему 6-гидрокси-8-[4-[4-(2-пиримидинил)-пиперазинил]-бутил]-8-азаспиро[4.5]-7,9-диона или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или его гидрата.