Способ получения концентрата плазмина человека и продукт для использования в медицине

Группа изобретений относится к биотехнологии, фармацевтической промышленности, ветеринарии и медицине. Способ характеризующийся тем, что к фракции Кона II+III добавляют Трис-HCl буфер рН 7,5, содержащий 0,1 М лизин и 5 мМ ЭДТА, инкубируют, центрифугируют, полученную суспензию инкубируют с 10% ПЭГ 3000, после центрифугирования раствор наносят на колонку с лизин-сефарозой при рН 7,5, элюируют плазминоген буферным раствором при рН 3,5, содержащим 0,1 М глицин, 30 мМ лизин и 5 мМ каприловую кислоту, плазминоген инкубируют в присутствии стрептокиназы в трис-буфере рН 7,5, содержащем 15 мМ лизин, 10 мМ е-аминокапроновую кислоту и 50% глицерин, затем проводят хроматографию на колонке с бензамидин-сефарозой при рН 8,5, элюируют буфером при рН 3,5, содержащем 0,1 М глицина, 30 мМ лизина, и лиофилизируют целевой продукт, содержащий около 30 МЕ/мл плазмина чистотой более 98%, не менее 10 мМ лизина и 10 мМ глицина в водном растворе при рН около 3,5. Полученный продукт апирогенен, не проявляет токсичности в экспериментах на лабораторных животных, не вызывает аллергических или иных побочных реакций при внутрикожном или внутривенном введении, а также при интраорбитальном введении препарат не вызывает дефектов поля зрения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы.

 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, фармацевтической промышленности, ветеринарии, медицины и касается получения концентрата человеческого плазмина и продукта, который может быть использован в качестве лекарственного средства для применения в медицине, например в офтальмологии или в качестве тромболитического средства при коагулогических нарушениях в венах и артериях различного калибра и различной локализации. Продукт также может быть использован в офтальмологии как адъювантная терапия при лечении гемофтальмов различного генеза, гифемы, реактивного фибриноидного синдрома после экстракции катаракты и ленсвитрэктомии, инволюционной центральной хориоретинальной дистрофии с геморрагическим компонентом, тромбоза центральной вены сетчатки и ее ветвей, преретинальных и субретинальных кровоизлияний различного генеза, при фибринозно-пластических иридоциклитах для профилактики заращения фистулы при антиглаукоматозных операциях фистулизирующего типа.

Предшествующий уровень техники

Плазмин - сериновая протеаза, играющая ключевую роль в тромболизисе. Именно образование плазмина, в конечном итоге, блокируют все тромболитические средства. Естественно, что для растворения тромбов возможно использование и самого плазмина. Технически доставка этого фермента к окклюзированному сосуду может быть решена с помощью катетеризации либо проксимального, либо дистального отдела основного ствола (Novokhatny V.V. et al. US patent 6355243). Поскольку процедура растворения тромба длительная, помимо высокой чистоты препарата необходимо создать условия, в которых плазмин не инактивируется за время ее проведения. Плазмин может быть достаточно конкурентно-способным в использовании по сравнению с тканевым активатором плазминогена, одним из главных “недостатков” которого является его высокая стоимость. Другие тромболитические средства обладают рядом побочных эффектов и поэтому не являются реальными конкурентами на место тканевого активатора плазминогена или плазмина. Однако существует целый ряд ограничений в использовании традиционных тромболитических средств, которые могут быть исключены в случае прямого использования плазмина (Novokhatny V.V. et al. US patent 6355243). Так, в ряде случаев, необходимо длительно поддерживать высокую локальную концентрацию плазмина. Использование современных тромболитиков либо не позволяет это сделать, либо такое их использование делает терапию очень дорогостоящей. Все это выводит препарат плазмина на конкурентно-способный уровень. Естественно, что при этом способ получения плазмина должен давать высокоочищенный препарат, быть технологичным и иметь относительно низкую себестоимость, а конечный препарат должен сохранять необходимую активность в период его использования.

Наибольшая стабильность хранения препарата достигается за счет его лиофильного высушивания. Стабильность же препарата во время процедуры растворения тромба достигается за счет снижения рН раствора используемого плазмина до 3,7-4,0 единиц (Novokhatny V.V. et al. US patent 6355243) и/или добавления аминокислот (Jensen V.T. US patent 3950513), прежде всего лизина или его производных (Айсина Р.Б. и др. Биоорганическая химия, 1994, 20, 182-189; Ueshima S. et al. Clin.Chim.Acta 1996, 245, 7-18).

Если в плане стабилизации конечного препарата существует определенность, то в отношении способов очистки плазмина, которые могли бы стать основой технологии его промышленного получения, такой определенности нет.

Любой метод получения плазмина включает три основных блока: 1) получение плазминогена; 2) активация плазминогена (перевод плазминогена в плазмин); 3) тонкая очистка плазмина. В качестве дополнительных этапов надо рассматривать этап вирусной инактивации и этап стабилизации конечного препарата. Поскольку, в конечном итоге, речь идет о получении высокоочищенного препарата, анализировались лишь подходящие для этого методические приемы. Блоки 1 и 3 давно и хорошо отработаны в мировой практике. Основное же внимание уделяется второму блоку, который и будет определять чистоту конечного препарата и стоимость технологии в целом. На решение этой задачи и направлено настоящее изобретение.

Выпускаемый в СССР с середины 70-х годов препарат плазмина - “Фибринолизин” представлял собой продукт очень низкого качества, вызывающий широкий спектр осложнений, поскольку получался из плазминогена низкой чистоты путем обработки трипсином животного происхождения. Конечный препарат был не только низкой очистки, но и нестабилизирован, поэтому не мог решать в принципе те задачи, которые перед ним ставились. Способ же доставки препарата был малоэффективен.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому изобретению является способ получения плазмина, описанный Novokhatny V.V. et al. в US patent 6355243.

В способе-прототипе (Novokhatny V.V. et al. US patent 6355243) получение плазмина заключается в том, что плазминоген очищают, начиная с фракции Кона II+III. После солюбилизации пасты нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием, а полученный раствор смешивают с лизин-сефарозой. Связавшийся с аффинным носителем плазминоген элюируют и затем осаждают сульфатом аммония. Этот преципитат чистотой около 80% и служит источником плазмина.

Получают плазмин, используя иммобилизованную на сефарозе урокиназу. Это самый дорогостоящий этап очистки, поскольку, во-первых, используется дорогой активатор плазминогена, во-вторых, несмотря на иммобилизацию, каждый следующий цикл с использованием этого реагента дает меньший эффект и поэтому, как отмечают сами же авторы патента, требует постоянного мониторинга и коррекции. После отделения иммобилизованной урокиназы и смены буфера раствор наносили на бензамидин-сефарозу для селективной очистки плазмина. После элюции плазмина и диафильтрации полученного раствора получали конечный препарат в подкисленной уксусной кислотой воде с рН 3,7. Чистота препарата составляла более 95%. Авторы патента получали из 200 г пасты фракции Кона II+III около 0,5 г конечного препарата. Естественно, что нетехнологичность и высокая себестоимость второго этапа заставляет искать другие решения.

Раскрытие изобретения.

Предложенное изобретение включает способ получения концентрата плазмина, причем указанный концентрат включает лизин и глицин, каждый в количестве не менее 10 мМ, из плазмы крови человека, заключающийся в выделении плазминогена из фракции Кона II+III, его активацию любым подходящим для этого агентом, известным из уровня техники, вирусную инактивацию с использованием общепринятых методов (например, с использованием общеизвестных вирусных инактиваторов - химических агентов или выдерживанием при определенной температуре), удаление ее продуктов хроматографическими методами и тонкую очистку с помощью хроматографии.

В качестве исходного сырья служила фракция Кона II-III. Для солюбилизации использовали 0,2М трис буфер рН 7,5, содержащий 0,1 М лизин и 5 мМ ЭДТА. После двухчасовой инкубации при +4°С суспензию центрифугировали при 6000 g в течение 1 часа.

Для осаждения примесных белков, липидов и ассоциированных с липидами вирусов использовали ПЭГ 3000. После двухчасовой инкубации супернатанта с 10% ПЭГ при комнатной температуре смесь центрифугировали при 6000 g в течение часа. После замены буфера на 50 мМ фосфатный рН 7,5, содержащий 0,15 М хлорид натрия, раствор наносили на колонну с лизин-сефарозой. Плазминоген элюировали буферным раствором, рН 3,5, содержащим 0,1 М глицин, 30 мМ лизин и 5 мМ каприловую кислоту. Предложенные концентрации глицина и лизина позволяют максимально стабилизировать препарат без потери его активности. Элюированный белок инкубировали в течение часа при +4°С, что соответствовало еще одной стадии вирусной инактивации.

После смены буфера на 20 мМ трис, рН 7,5, содержащий 15 мМ лизин, 10 мМ е-аминокапроновую кислоту и 50% глицерин, к раствору добавляли стрептокиназу исходя из молярного соотношения плазминоген:стрептокиназа=100:1. Смесь инкубировали 18 часов при +4°С. Реакцию останавливали, добавляя 0,1 М трис, рН 8,5, содержащий 1 М хлорид натрия.

Для окончательной очистки плазмина смесь наносили на колонну с бензамидин-сефарозой, уравновешенную 50 мМ трис буфером, рН 8,5, содержащим 0,5 М хлорид натрия. Плазмин элюировали буфером, содержащим 0,1 М глицин, 30 мМ лизин, рН 3,5. В этих условиях при +4°С препарат остается стабильньм в течение месяца. Лиофилизация конечного препарата плазмина продлевает его стабильность.

Чистота конечного препарата составляет не менее 98%. Выход активного препарата около 40%.Также настоящее изобретение включает продукт, полученный указанным способом, который представляет собой концентрат, содержащий плазмин чистотой более 98%, не менее 10 мМ лизина и не менее 10 мМ глицина, причем рН концентрата около 3,5. Данный фармацевтический продукт можно использовать в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях. Продукт может быть представлять собой раствор, лиофилизированный порошок (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом), может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного, внутримышечного, внутрисуставного) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам.

Наполнителями являются, например, компоненты (неорганические и/или органические соли), необходимые для поддержания рН около 3,5, в случае необходимости, также соли или иные общеизвестные вещества, регулирующие осмотическое давление, необязательно антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций или для глазных капель или гелей.

Растворителями могут служить дистиллированная апирогенная стерильная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, раствор 1,3-бутандиола, гликозаминогликанов, декстрозы, также раствор может содержать, в случае необходимости, белки сыворотки крови, например, альбумины и/или церулоплазмин (последние также могут быть наполнителями в лиофилизированном готовом продукте).

Также можно лиофилизировать готовый раствор, содержащий концентрат плазмина, глицин и лизин и любое из перечисленных вспомогательных веществ или их сочетания.

В случае необходимости концентрат, содержащий плазмин, глицин и лизин согласно данному изобретению, можно растворять перед введением в плазме крови, в сыворотке крови больного или смешивать с растворами и/или фракциями белка (белков).

Продукт также может быть выполнен в виде разовой лекарственной формы, например в виде флаконов или ампул с раствором или с лиофилизированным концентратом, содержащим плазмин чистотой более 98%, глицин, лизин в указанных концентрациях и, необязательно, вспомогательные вещества или их сочетания, при этом при этом активность плазмина в каждой разовой дозе может составлять 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200 или 500 ед; продукт дополнительно может иметь соответствующую упаковку и, необязательно, инструкцию по применению.

Лучший вариант осуществления изобретения

К 50 г фракции Кона II-III добавили 500 мл 0,2М трис буфера рН 7,5, содержащего 0,1 М лизин и 5 мМ ЭДТА (активность плазминогена составляла 1630 ME и принималась за 100% для оценки выхода). После двухчасовой инкубации при постоянном перемешивании (+4°С) суспензию центрифугировали при 6000 g в течение 1 часа.

Для осаждения примесных белков, липидов и ассоциированных с липидами вирусов использовали ПЭГ 3000. После двухчасовой инкубации 560 мл полученной на предыдущей стадии суспензии (содержание плазминогена 1330 ME) с 10% ПЭГ при комнатной температуре смесь центрифугировали при 6000 g в течение часа. Осадок отбрасывали, а полученный супернатант (около 500 мл, 1230 ME, 75% выход) подвергали ультрафильтрации. После замены буфера на 50 мМ фосфатный, рН 7,5, содержащий 0,15 М хлорид натрия, раствор наносили на колонну с лизин-сефарозой 4В (12×2,3 см). Затем колонну отмывали уравновешивающим буфером до оптической плотности менее 0,05 единиц при 280 нм. Плазминоген элюировали 120 мл буферного раствора, рН 3,4, содержащего 0,1 М глицин, 30 мМ лизин и 5 мМ каприловую кислоту. Элюированный белок (120 мл, 1000 ME, выход 61%) инкубировали в течение часа при +4°С.

После смены буфера на 20 мМ трис, рН 7,5, содержащий 15 мМ лизин, 10 мМ в-аминокапроновую кислоту, 50% глицерин, препарат концентрировали и к раствору добавляли стрептокиназу, исходя из молярного соотношения плазминоген:стрептокиназа=100:1. Смесь инкубировали 18 часов при +4°С. Реакцию останавливали, добавляя 0,1 М трис, рН 8,5, содержащий 1 М хлорид натрия (активность плазмина 630 ME, выход 40% от исходного уровня).

Для окончательной очистки плазмина смесь в объеме 40 мл наносили на колонну с бензамидин-сефарозой 4В (2,6×5 см), уравновешенную 50 мМ трис буфером, рН 8,5, содержащим 0,5 М хлорид натрия. Плазмин элюировали буфером, содержащим 0,1 М глицин и 30 мМ лизин, рН 3,5. (600 ME, выход 37%). На заключительном этапе проводили диафильтрацию препарата, заменяя на буферный раствор, рН 3,4, содержащий 10 мМ глицин и 10 мМ лизин, концентрируя при этом препарат до 20 мл (активность плазмина 600 ME, выход 37%). В этих условиях при +4°С препарат остается стабильным в течение месяца.

Чистота конечного препарата составляла 99%.

Полученный продукт был апирогенным, не проявлял токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывал аллергических или иных побочных реакций при внутрикожном или внутривенном введении, а также при интраорбитальном введении препарат не вызывает дефектов поля зрения.

1. Способ получения концентрата плазмина человека, характеризующийся тем, что к фракции Кона II+III добавляют Трис-HCL буфер рН 7,5, содержащий 0,1 М лизин и 5 мМ ЭДТА, инкубируют в течение 2 ч, центрифугируют, полученную суспензию инкубируют с 10% ПЭГ 3000 при комнатной температуре, центрифугируют при 6000 g в течение 1 ч, раствор наносят на колонку с лизин-сефарозой при рН 7,5, элюируют плазминоген буферным раствором при рН 3,5, содержащим 0,1 М глицин, 30 мМ лизин и 5 мМ каприловую кислоту, инкубируют плазминоген в присутствии стрептокиназы в соотношении 100:1 в трис-буфере рН 7,5, содержащем 15 мМ лизин, 10 мМ е-аминокапроновую кислоту и 50% глицерин, затем проводят хроматографию на колонке с бензамидин-сефарозой при рН 8,5, элюируют буфером при рН 3,5, содержащем 0,1 М глицина, 30 мМ лизина, и лиофилизируют целевой продукт, содержащий около 30 МЕ/мл плазмина чистотой более 98%, не менее 10 мМ лизина и 10 мМ глицина в водном растворе при рН около 3.5.

2. Продукт, представляющий собой концентрат плазмина, характеризуется тем, что получен из плазмы крови человека способом по п.1, содержит около 30 МЕ/мл плазмина чистотой более 98%, не менее 10 мМ лизина и 10 мМ глицина.

3. Продукт по п.2, который представляет собой водный раствор или лиофилизированный порошок.

4. Продукт по п.2, который дополнительно содержит фармацевтически приемлемые для парентерального введения наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты.

5. Продукт по п.3, который имеет рН водного раствора около 3,5.

6. Продукт по п.2, который предназначен для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях.

7. Продукт по п.2, который предназначен для лечения или предупреждения состояний, протекающих с активацией системы свертывания крови и с тромбообразованием.