Штамм гриба fusarium sambucinum - продуцент биологически активных веществ

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штаммам грибам-продуцентам биологически активных веществ. Штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 выделен из растительного сырья и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, имеет коллекционный номер ВКПМ №F-867. Штамм непатогенен и нетоксичен. Штамм характеризуется высоким содержанием белка и широким спектром различных биологически активных веществ в биомассе и культуральной жидкости. Биомасса и культуральная жидкость одинаково пригодна как при производстве биологически активных препаратов, в косметической промышленности, пищевой промышленности для получения биологически активной добавки к пище, так и в сельском хозяйстве как биодобавка для кормления животных, стимулятор роста растений, биотехнологии. 2 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штаммам грибам-продуцентам биологически активных веществ, и может быть использовано при производстве и применении биологически активных препаратов, пищевых и кормовых добавок, в косметологии.

Широко известно, что грибы рода Fusarium продуцируют биологически активные вещества, а также являются источником белка пищевого и кормового назначения.

Известны штаммы гриба Fusarium sambucinum и Fusarium sambucinum, используемые в качестве продуцентов простагландинов (Патент RU №1459244, опубл 15.10.1994; Патент RU №1446928, опубл. 30.12.1994).

Известен также штамм гриба Fusarium sambucinum -продуцент убихинона Q 10 (Патент RU №2064499, опубл. 27.07.1996).

Однако указанные штаммы продуцируют вещества, ограниченные одним видом биологической активности.

Известен также штамм гриба Fusarium sambucinum BKM F 3051 D как продуцент широкого спектра биологически активных веществ, содержащихся не только в биомассе, но и в культуральной жидкости (Патент RU №2054484, опубл. 20.02.1996).

Недостатком известного штамма является сложная технология извлечения биологически активных веществ.

Известен штамм гриба Fusarium sambucinum ВСБ-917 (ВКПМ F-169), используемый в качестве продуцента белка пищевого и кормового назначения и физиологически активных веществ. На основе этого штамма получен препарат «Милайф», влияющий на тканевый обмен (Патент RU №2040932, опубл. 09.08.1995).

Однако известный штамм Fusarium sambucinum ВСБ-917 (ВКПМ F-169) характеризуется низким уровнем синтеза углеводов, в том числе высокомолекулярных полисахаридов - гликанов (около 13%), проявляющих биологическую активность.

Наиболее близким аналогом является штамм гриба Fusarium sambucinum PS - 64 (ВКПМ F-165), используемый в качестве продуцента белка пищевого и кормового назначения и физиологически активных веществ. Штамм характеризуется более высоким уровнем синтеза углеводов до 23%. На основе штамма создана биологически активная добавка (БАД) к пище «Микро-ВИТ» (Патент RU №2092179, опубл. 10.10.1997).

Недостатком известного штамма Fusarium sambucinum PS -64 (ВКПМ F-165) является низкая скорость роста и ограниченный спектр продуцируемых физиологически активных веществ.

Задачей изобретения является получение нового штамма гриба с высоким содержанием белка и биологически активных веществ в биомассе, а также продуцирующего в культуральную жидкость широкий спектр различных биологически активных веществ: незаменимых аминокислот, полисахаридов, жирных кислот, убихинонов, витаминов, микроэлементов и др. для создания на его основе различных препаратов профилактического и лечебного назначения.

Технический результат изобретения заключается в увеличении спектра и выхода биологически активных веществ за счет создания нового эффективного штамма - продуцента.

Штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 выделен из растительного сырья и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, имеет коллекционный номер ВКПМ №F - 867.

Штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) характеризуется следующими свойствами:

Морфологические признаки. Образует микро- и макроконидии:

веретеновидные и серповидные, с 3-5 перегородками, размерами (25×38)×(3×5,5) Мкм. Гифы разветвленные, септированные, диаметром 2,5-3,5 Мкм. Септы простые с т ельцами Воронина. При старении в клетках гиф наблюдается обильное образование жировых включений. Плодовых тел не образует.

Культуральные признаки. На агаризованной среде Чапека и сусло-агаре образует конидии с хорошо развитым воздушным мицелием, сначала белым, затем розовеющим, при старении приобретающим охряно-коричневые тона.

Физиологические признаки. Сбраживает сахара: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, сорбозу, целлобиозу, декстрины, слабо раффинозу, арабинозу, мелицитозу. Ассимилирует сахара: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, сорбозу, декстрины, растворимый крахмал, не ассимилирует раффинозу, арабинозу, рибозу, мелибиозу, инулин. Отношение к органическим кислотам: усваивает уксусную, молочную, янтарную и лимонную кислоты; не усваивает яблочную и винную кислоты. Растет на аммонийном азоте.

Технологические характеристики. Аэроб. Растет в интервале температур 22-38°С (оптимальная температура роста 26-30°С). Способен развиваться в интервале рН 4,5-7,0 (оптимум рН 5,5-6,0).

Штамм непатогенен и нетоксичен.

Хранение штамма. Штамм хорошо сохраняется путем периодических пересевов (3-4 раза в год) на солодовом (6-7° Бал) сусло-агаре. После пересева рост штамма осуществляется в термостате при 26°С в течение 3 суток. Хранится культура при комнатной температуре.

Химический состав биомассы гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867):

Содержание

сырого протеина	- 47-54%
углеводов,	- 23-26%
в том числе гликанов	- 16-20%
липидов	- 7-9%
нуклеиновых кислот	- 4-6%
минеральных веществ	- 8-10%
витаминов (Е, Н, группа В)	- 0,03-0,05%
аминокислот, (% от асв)	- 27-30%
микроэлементов	- 1,5-3%

Витаминный состав биомассы:

А (ретинол)	-н/обн
Е (токоферол)	- 32,0 мг/кг
B1 (тиамин хлорид)	- 1,3 мг/кг
В2 (рибофлавин)	- 87,8 мг/кг
В3 (пантотеновая к-та)	- 145,0 мг/кг
B5 (никотиновая к-та)	- 86,9 мг/кг
В6 (пиридоксин)	- 8,0 мг/кг
ВС (фолиевая к-та)	- 16,5 мг/кг
В12 (цианокобаламин)	- 0,2 мг/кг
Н (биотин)	- 1,1 мг/кг

Содержание микроэлементов в биомассе: мг/кг

Калий	- 13350
Натрий	- 5880
Кальций	- 1935
Магний	- 1225
Железо	- 922
Медь	- 27,5
Цинк	- 62,1
Марганец	- 243
Хром	- 9,4
Никель	- 9,6
Свинец	- 3,0
Кадмий	- н/обн
Мышьяк	- 0,09

Состав и содержание аминокислот белка биомассы, %:

лизин	- 1,98
гистидин	- 1,57
аргинин	- 2,01
аспарагиновая к-та	- 3,17
треонин	- 1,33
серин	- 1,23
глютаминовая к-та	- 3,67
пролин	- 1,59
глицин	- 1,35
аланин	- 1,94
цистин	- 0,18
валин	- 1,70
метионин	- 0,42
изолейцин	- 1,37
лейцин	- 2,10
тирозин	- 1,11
фенилаланин	- 1,81

Химический состав культуральной жидкости гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F -867):

Общий анализ:

Сухие вещества -	1,5%
Органические кислоты -	10-12 г/л
Жирные кислоты	2,5 г/л

Микроэлементы, в мг/л:

К -	800-1000
Na -	300-400
Са -	200-300
N -	200
Mg -	30-40
Fe -	0,1
Cu -	0,05
Zn -	0,4-0,6
Mn -	0,03
Ni -	0,003
Со -	0,008
Рв -	н/обн
Pg -	н/обн
As -	н/обн

Состав и содержание аминокислот в культуральной жидкости:

Витаминный состав культуральной жидкости:

В1 -	0,09 мг/л
В2 -	1,0-1,2 мг/л
В3 -	0,5-0,7 мг/л
В4 -	Н/обн
В5 -	95,0-97,0 мг/л
В6 -	0,4-0,6 мг/л
В9 -	0,25 мг/л
В12	- Н/обн
Н -	сл.

Количество и состав фракции органических кислот в культуральной жидкости:

лимонная кислота -	0,4-0,6 г/л
фумаровая кислота-	0,3 г/л
яблочная кислота -	0,3-0,5 г/л
щавелево-уксусная кислота -	0,3 г/л
янтарная кислота -	0,4-0,6 г/л
уксусная кислота -	0,5 г/л

Биомасса и культуральная жидкость одинаково пригодна как при производстве биологически активных препаратов, в косметической промышленности, пищевой промышленности для получения БАД к пище, так и в сельском хозяйстве как биодобавка для кормления животных, стимулятор роста растений, в биотехнологии и т.д.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Для оценки технологических характеристик предлагаемого штамма гриба F.sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) в сравнении с известным штаммом - продуцентом F.sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165) проводят сравнительные испытания в лабораторных условиях.

Молочную сыворотку нагревают до 90-100°С, выдерживают при этой температуре в течение 5 минут, а затем осаждают белок. Сыворотку фильтруют, добавляют в нее сульфат аммония и фосфорнокислый калий, доводят рН среды до 5,5. Получают среду следующего состава: РВ (редуцирующие сахара) - 1,6%, NH₄ - 900 мг/л и Р₂О₅ - 500 г/л.

Приготовленную среду разливают в качалочные колбы (объемом 750 мл) по 250 мл в каждую и стерилизуют в течение 30 минут при 0,5 атм.

После стерилизации и охлаждения колб с находящейся в них средой их засевают раздельно суспензией грибов, полученной при внесении стерильной воды в пробирки с сусло-агаром, на котором выращивали мицелий гриба в течение 2-х суток.

Ниже представлен средний химический состав сухой молочной сыворотки:

1. Сухие вещества, г/л	- 35,9
2. Азот общий, г/л	- 1,1
3. Азот аммонийный, мг/л	- 225,0
4. Микроэлементы, мг/л:
К	- 690
Na	- 695
Са	- 1010
Mg	- 22,3
Fe	- 19,2
Cu	- 0,5
Zn	- 15,2
Mn	- 9,3
Р2O5	- 950
5. Общие углеводы, г/л	- 31,0
6. РВ б/инверсии, г/л	- 19,4
7. Органические кислоты, г/л	- 10,2
рН	- 5,2

Биомассу грибов выращивают в одинаковых условиях на качалке при температуре 30°С и рН 5,5.

На 2-е сутки обильный мицелий наблюдают в тех колбах, где была засеянная культура гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867). Через 36 часов количество биомассы гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) составляет 12 г/л, тогда как вес сухого мицелия гриба F. sambucinum PS-64 (ВКПМ №F - 165) составляет всего 9 г/л.

При выращивании в условиях интенсивной аэрации и перемешивания среды накопление биомассы гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) происходит через 12-14 часов, а гриба F. sambucinum PS-64 (ВКПМ №F - 165) - только через 14-18 часов

Анализ биомассы обоих грибов показал, что качество высушенного мицелия гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) выше, чем мицелия гриба F. sambucinum PS-64 (ВКПМ №F - 165). В табл.1 представлены качественные показатели биомассы обоих грибов.

Табл.1 Химический состав биомассы штаммов грибов Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) и Fusarium sambucinum PS-64(ВКПМ №F-165)
№	Характеристика биомассы	F. sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F - 867)	F. sambucinum PS - 64(ВКПМ № F - 165)
1.	Общий белок, (%, от асв)	49,2	44,1
2.	Углеводы, (%, от асв)	24,9	21,2
	в том числе гликаны	18	12
3.	Липиды, (%, от асв)	8,1	6,5
4.	Нуклеиновые кислоты, (%, от асв)	3,9	4,1
5.	Зола, (%, от асв)	8,0	8,1
6.	Влажность, %	7,8	7,5

Как видно из данных табл. 1, биомасса гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) содержит сырого протеина и углеводов больше, чем биомасса F. sambucinum PS-64 (ВКПМ №F-165) на 5,2% и 3,7 % (в том числе гликанов на 6%) соответственно.

Благодаря высокому содержанию белка и биологически активных веществ, полученная биомасса гриба F. sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) может быть использована как кормовая добавка в сельском хозяйстве или добавка к пище человека.

Пример 2.

Биологическую активность культуральной жидкости предлагаемого штамма гриба F.sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) в сравнении с известным штаммом -продуцентом F.sambucinum PS-64 (ВКПМ F - 165) проверяют на культуре дрожжей, выращиваемой на мелассе.

Культуральная жидкость грибов рода Fusarium обладает биологической активностью, способной ускорять рост микроорганизмов (пекарских дрожжей, кормовых дрожжей и др.) и растений, в частности, овощных культур.

Стимулирование роста микроорганизмов и растений культуральной жидкостью грибов объясняется содержанием в ней значительного количества витаминов, аминокислот и минеральных элементов.

Кроме указанных продуктов метаболизма в культуральной жидкости грибов рода Fusarium содержатся биологические активаторы, такие как гетероауксин, которые стимулируют репродуктивные процессы в организме в частности, плодоношение.

Для проверки биологической активности культуральной жидкости исследуемых штаммов грибов был выбран штамм дрожжей: Saccharomycas cerevisiae cliastaticus ВКПМ -γ -1218.

Для выращивания дрожжей готовят среду следующего состава: разбавленная (в 20 раз) меласса, в которую добавляют сульфат аммония в количестве 5 г/л и фосфорнокислый калий в количестве 3 г/л. Выращивание дрожжей проводят в камеральных условиях в аппарате с интенсивным массообменном.

Культуральные жидкости штамма гриба F.sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F - 867) и известного штамма F.sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165) добавляют раздельно в среду для выращивания дрожжей в концентрации 0,05 об% (т.е. 5 мл/л жидкой среды из массы).

Процесс непрерывного культивирования дрожжей (каждый вариант опыта) проводят в течение 2-х суток (48 часов). В течение этого времени наблюдают морфологическое состояние дрожжевых клеток, количество почкующихся клеток, определяют концентрацию биомассы, остаточные сахара, степень потребления азота и фосфора из культуральной среды.

В табл.2 приведены основные параметры роста дрожжей при добавлении культуральной жидкости после выращивания штаммов грибов Fusarium sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F - 867) и Fusarium sambucinum PS-64 (ВКПМ F - 165).

Табл.2 Влияние культуральной жидкости грибов на основные параметры роста дрожжей при их культивировании на среде с мелассой в условиях интенсивной аэрации
Штаммы дрожжей	Культуральная жидкость от выращивания грибов	Основные параметры
Скорость роста, час	Конц. дрожжей, г/л	Остат. сахар, г/л	NH4, мг/л	Р2O5, мг/л
S. serevisiae diastaticus ВКПМ-γ-1218	Fusarium sambucinum ВКПМ №F - 867 5 мл/л среды в час	3 часа или 0,33 час-1	40,0	0,1	150,0	50,0
	Fusarium sambucinum PS - 64	4,2 часа или 0,24 час-1	40,0	0,15	230,0	78,0
	Контроль: без добавлений культ. жидкости	5 часов или 0,20 час-1	37,5	0,20	185,0	95,0

Из представленных данных табл.2 следует, что на рост дрожжей - сахаромицетов наиболее эффективное действие оказывает культуральная жидкость штамма гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 (ВКПМ №F - 867) в сравнении с культуральной жидкостью штамма гриба Fusarium sambucinum PS-64 (ВКПМ F-165).

Штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001-3 ВКПМ № F-867 - продуцент биологически активных веществ.